Identification of the Sequences Flanking the Insertion in Rice Mutant

一、用反向PCR分离水稻插入突变体侧翼序列

实验原理：在含有T-DNA的水稻插入突变体中，通过抽提突变体总DNA进行酶切并使酶切产物自连，可以得到由T-DNA片段和与其相邻的基因组DNA组成的有效环状DNA分子。由于T-DNA序列是已知的，通过在T-DNA上设计巢式PCR引物，可以迅速扩增上述有效环状DNA分子中与T-DNA相邻的基因组DNA片段，从而分离出T-DNA的侧翼序列 (图1)。
实验目的：分离水稻T-DNA插入突变体的侧翼序列。


图1. 反向PCR扩增T-DNA左端侧翼序列原理

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 1.5 ml离心管
   
3. dNTP (Pharmacia, USA)
   
4. Xba I (Takara, Dalian, China)
   
5. T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)
   
6. rTaq (Takara, Dalian, China)
   
7. BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.1 (Applied Biosystems, USA)
   
8. 50%甘油
   

仪器设备

1. 电热恒温隔水式培养箱 (SGSP-02，黄石市恒丰医疗器械有限公司)
   
2. 冰箱 (BCD-243K F&R，新飞)
   
3. GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems，USA)
   
4. ABI3730xl测序仪 (Applied Biosystems, USA)
   

实验步骤

1. 用2 ml离心管法制备基因组DNA备用 (参见：2 ml离心管法快速制备水稻高质量总DNA [符德保等，2018])。
   
2. 在灭菌的1.5 ml离心管中加入如下体系，于37 °C温箱酶切10 h：
   

   基因组DNA	7 μl (完整DNA约1 µg)
   10x M buffer	5 μl
   10x BSA	5 μl
   Xba I (15 U/μl)	0.7 μl
   加灭菌ddH2O	至终体积50 µl

3. 在步骤2的酶切体系中加入如下体系，于4 °C冰箱连接16 h：
   

   10x T4 DNA ligase buffer	10 μl
   T4 DNA ligase (400 U/μl)	0.035 μl
   灭菌ddH2O	至终体积100 μl

4. 以步骤3中连接产物作为反向PCR第一步反应的模板。分离T-DNA左端侧翼序列的PCR反应体系如下：
   

   10x PCR Buffer	2 μl
   50%甘油	2 μl
   dNTP (2 mmol/L)	2.5 μl
   ULB2 (10 μmol/L)	0.5 μl
   XLB2 (10 μmol/L)	0.5 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.1 μl
   连接产物	0.8 μl
   灭菌ddH2O	至终体积20 μl

   反应程序为：95 °C, 5 min; (95 °C, 1 min；56 °C, 1 min; 72 °C, 3 min) x 35 cycles; 72 °C, 7 min; 25 °C, 10 min。
   分离T-DNA右端侧翼序列的引物为URB1和XRB1，反应体系和左端一致，反应程序和左端一致但退火温度改为62 °C。
   
5. 以步骤4中相应的PCR产物为模板分别对T-DNA的左右端侧翼序列进行第二轮PCR扩增。分离T-DNA左端侧翼序列的第二轮PCR引物为ULB3和XLB3，反应体系和第一步相同，反应程序只需将退火温度修改为59 °C即可。分离T-DNA右端侧翼序列的第二轮PCR引物为URB4和XRB3，反应体系和程序均参照第一步，但退火温度需调整为58 °C。
   
6. 取5 μl第二轮PCR的产物于1% (w/v) 0.5x TBE琼脂糖凝胶中电泳检测，挑选有大于250 bp条带的PCR产物用双脱氧链终止法进行测序 (图2)。从T-DNA左端得到的PCR产物用ULB3测序，从右端得到的产物用URB4测序。
   
   
   图2. 反向PCR第二轮PCR产物电泳检测
   
   
7. 在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLASTN工具将测序结果与水稻基因组序列进行同源比对，以最好的匹配结果为插入位点。
   
8. 反向PCR使用的引物序列如下：
   ULB2：5’CCAGATAAGGGAATTAGGGTT 3’
   XLB2：5’TCTTCATTGTTATATCTCCTTGGAT 3’
   ULB3：5’CCAGTACTAAAATCCAGATCCC 3’
   XLB3：5’GATGTGTCCCTTATGGACGTG 3’
   URB1：5’GATGGAGGACAGGAGCTTCA 3’
   XRB1：5’GTGAATTACAGGTGACCAGCTC 3’
   URB4：5’TTGCGAAGTTTAAACTATCAGTGT 3’
   XRB3：5’CGGGGGATCCACTAGTTCTA 3’
   

注意事项

1. 本方法所使用的引物是根据创建RMD (http://rmd.ncpgr.cn/)突变体库所使用的T-DNA载体设计的，仅适用于来源于RMD的T-DNA插入突变体侧翼序列的分离。
   
2. 在高通量分离侧翼序列时，可以使用96孔板进行酶切和连接反应。使用96孔板时，应该加盖而不是加矿物油防止水分蒸发。
   
3. 当仅针对少数感兴趣的突变体分离侧翼序列时，含有多个DNA条带的PCR产物可以分别挖胶回收测序。
   
4. 改变内切酶的种类并根据载体序列重新设计引物有可能分离出更多的侧翼序列。
   
   

二、用接头PCR分离水稻插入突变体侧翼序列

实验原理：接头PCR也需要抽提插入突变体的总DNA并进行酶切。酶切后，用连接酶在酶切产物两端连上经过化学修饰并且序列已知的接头。通过锚定于接头和插入元件上的巢式PCR引物，可以扩增与插入元件相邻的基因组DNA片段。由于接头经过化学修饰，锚定于接头上的PCR引物自身不能配对进行指数型扩增，从而抑制了非特异性扩增 (图3)。
实验目的：分离水稻T-DNA和Tos17插入突变体的侧翼序列。


图3. 接头PCR分离T-DNA侧翼序列原理示意图

材料与试剂

1. dNTP (Pharmacia, USA)
   
2. Dra I (Takara, Dalian, China)
   
3. T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)
   
4. rTaq (Takara, Dalian, China)
   
5. BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.1 (Applied Biosystems,USA)
   
6. 50%甘油
   
7. dNTPs
   
8. L14\TRB1
   
9. ADS-1
   

仪器设备

1. 电热恒温水浴锅 (HH SY11-Ni，北京市长风仪器仪表有限公司)
   
2. GeneAmp^® PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA)
   
3. ABI3730xl测序仪 (Applied Biosystems, USA)
   

实验步骤

1. 用2 ml离心管法制备基因组DNA备用 (参见：2 ml离心管法快速制备水稻高质量总DNA [符德保等，2018])。
   
2. 用ddH₂O将接头引物AD-L和AD-S分别稀释到100 μmol/L，等体积混合，94°C水浴变性4 min，自然冷却至室温后即为50 μmol/L的接头。
   
3. 在灭菌的0.5 ml离心管中加入下列反应体系，室温 (25 °C) 孵育16 h：
   

   基因组DNA	1 μl (完整DNA约50-200 ng)
   接头(50 μmol/L)	0.2 μl
   10x M buffer	1 μl
   10x T4 DNA ligase buffer	1 μl
   DraI (15 U/μl)	0.15 μl
   T4 DNA ligase (400 U/μl)	0.04 μl
   灭菌ddH2O	至终体积10 μl

   反应结束后65 °C水浴10 min终止反应。
   
4. 以步骤3中的酶切连接产物作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下：
   

   10x PCR Buffer	2 μl
   50%甘油	2 μl
   dNTP (2 mmol/L)	2 μl
   L14\TRB1 (10 μM)	0.5 μl
   ADS-1 (10 μM)	0.5 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.2 μl
   酶切连接产物	2 μl
   灭菌ddH2O	至终体积20 μl

   反应程序为：94°C, 5 min; (94°C, 30 sec; 72°C, 3 min) x 7 cycles; (94°C, 30 sec; 67°C, 3 min) x 32 cycles; 67°C, 7 min; 25°C, 10 min。
   L14为分离T-DNA左端侧翼序列的引物，TRB1为分离Tos17右端侧翼序列的引物。
   
5. 以步骤4中相应的PCR产物为模板分别对T-DNA左端和Tos17右端的侧翼序列进行第二轮PCR扩增，反应体系如下：
   

   10x PCR Buffer	2 μl
   50% 甘油	2 μl
   dNTP (2 mmol/L	2 μl
   LBT2\TRB2 (10 μM)	0.5 μl
   ADS-2 (10 μM)	0.5 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.2 μl
   上轮PCR产物	2 μl
   灭菌ddH2O	至终体积20 μl

   反应程序为：94°C, 5 min; (94°C, 30 sec; 72°C, 3 min) x 5 cycles, (94°C, 30 sec; 67°C, 3 min) x 20 cycles; 67°C, 7 min; 25°C, 10 min。
   LBT2为分离T-DNA左端侧翼序列的引物，TRB2为分离Tos17右端侧翼序列的引物。
   
6. 取5 μl第二轮PCR的产物于1% (w/v) 0.5x TBE琼脂糖凝胶中电泳检测(图4)，挑选有250 bp以上DNA片段的PCR产物用双脱氧链终止法进行测序。从T-DNA左端得到的PCR产物用LBT2测序，而从Tos17右端得到的产物用TRB2或TosRS测序。
   
   
   图4. 接头PCR第二轮PCR产物电泳检测
   
   
7. 在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLASTN工具将测序结果与水稻基因组序列进行同源比对，以最好的匹配结果为插入位点。
   
8. 接头PCR使用的引物序列如下：
   接头制备引物：
   AD-L：5’CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT 3’
   AD-S：5’Pi-ACCTCCCC-NH2 3’
   ADS-1：5’GGATCCTAATACGAGTCACTATAGCGC 3’
   ADS-2：5’CTATAGCGCTCGAGCGGC 3’
   T-DNA边界引物：
   L14：5’GCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGT 3’
   LBT2：5’ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT 3’
   Tos17边界引物：
   TRB1：5’GCATCTTTCACACGTTCTCATTGTCAG 3’
   TRB2：5’CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTG 3’
   TosRS：5’GAAGGGGGGTGTTAAATATATATAC 3’
   

注意事项

1. 本方法适用于分离来源于RMD(http://rmd.ncpgr.cn/)突变体库的T-DNA和Tos17插入突变体的侧翼序列。
   
2. AD-S要在3’进行加氨基修饰，5’进行加磷酸基团修饰。
   
3. 在高通量分离侧翼序列时，可以使用96孔板进行酶切连接反应。使用96孔板时，应该加盖而不是加矿物油防止水分蒸发。
   
4. 当仅针对少数感兴趣的突变体分离侧翼序列时，参照“用反向PCR分离水稻插入突变体侧翼序列”的注意事项。
   
   

三、用TAIL-PCR分离水稻插入突变体侧翼序列

实验原理：TAIL-PCR是一种基于巧妙的PCR程序设计来分离侧翼序列的方法。该方法利用退火温度高的严谨循环来线性富集带有插入元件侧翼序列的目标DNA片段(锚定于插入元件上的特异引物单引物扩增)，用退火温度低的非严谨循环来指数型扩增所有目标和非目标DNA片段(特异引物和随机引物配对扩增)。通过由严谨循环和非严谨循环组成的超级循环就能实现插入元件侧翼序列的特异性扩增 (图5)。
实验目的：分离水稻T-DNA和Tos17插入突变体的侧翼序列。

图5. TAIL-PCR扩增侧翼序列原理示意图

材料与试剂

1. dNTP(Pharmacia,USA)
   
2. rTaq (Takara, Dalian, China)
   
3. BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.1 (Applied Biosystems, USA)
   
4. 50%甘油
   

仪器设备

1. GeneAmp^® PCR System 9700 (Applied Biosystems,USA)
   
2. ABI3730xl测序仪 (Applied Biosystems,USA)
   

实验步骤

1. 用水稻快速少量DNA抽提法制备基因组DNA备用(参见：2 ml离心管法快速制备水稻高质量总DNA [符德保等，2018])。
   
2. 第一轮PCR反应。反应体系如下：
   

   10x PCR Buffer	2 μl
   dNTP (2 mmol/L)	1.5 μl
   SP1① (10 μM)	0.2 μl
   ADP② (100 μM)	0.12 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.12 μl
   基因组DNA	1 μl
   灭菌ddH2O	至终体积20 μl

   反应程序为：94 °C, 5 min; (94 °C, 30 sec; 62 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min) x 5 cycles; 94 °C, 30 sec; 25 °C, 2 min; 72 °C (32% ramp), 2.5 min; (94 °C, 20 sec; 65 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 20 sec; 65 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 20 sec; 45 °C, 1 min, 72 °C, 2.5 min) x 15 cycles; 72 °C, 7 min; 25 °C, 10 min。
   注^①：SP：Specific Primer。
   注^②：ADP：Arbitrary Degenerate Primer。
   
3. 以步骤2中相应的PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增。反应体系如下：
   

   10x PCR Buffer	2 μl
   50% 甘油	2 μl
   dNTP (2 mmol/L)	1.5 μl
   SP2 (10 μM)	0.2 μl
   ADP (100 μM)	0.12 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.12 μl
   上轮PCR产物	1 μl
   灭菌ddH2O	至终体积20 μl

   反应程序为：94 °C, 5 min; (94 °C, 20 sec; 65 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 30 sec; 65 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 30 sec; 45 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min) x 15 cycles; 72 °C, 7 min; 25 °C, 10 min。
   
4. 以步骤3中相应的PCR产物为模板进行第三轮PCR扩增。反应体系如下：
   

   10x PCR Buffer	2 μl
   50%甘油	2 μl
   dNTP (2 mmol/L)	1.5 μl
   SP3 (10 μM)	0.2 μl
   ADP (100 μM)	0.12 μl
   rTaq (5 U/μl)	0.12 μl
   上轮PCR产物	1 μl
   灭菌ddH2O	至终体积20 μl

   反应程序为：94 °C，5 min；(94 °C，30sec；45 °C，1 min；72 °C，2.5 min) x 35 cycles；72 °C，7 min；25 °C，10 min。
   
5. 取5 μl最后一轮^③PCR的产物于1% (w/v) 0.5x TBE琼脂糖凝胶中电泳检测 (图6)，挑选有大于250 bp以上DNA片段的PCR产物用双脱氧链终止法进行测序。
   注^③：分离T-DNA的侧翼序列一般做三轮PCR反应，分离Tos17侧翼序列做两轮即可，第二轮增加至20个循环。
   
   
   图6. TAIL-PCR第三轮PCR产物电泳检测
   
   
6. 测序结果在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLASTN工具与水稻基因组序列进行同源比对，以最好的匹配结果为插入位点。
   
7. 各轮PCR引物及测序引物：
   
   特异引物(SP)和测序引物
   
   效果较好的ADP主要有AD2-1，AD8和AD11三种，三轮PCR反应使用同一种ADP即可。
   注^④：其它用于分离TAIL-PCR左端侧翼序列的较好引物组合还有LP2，L16，LBT2；LSP2，LBT2，LBT3等。
   
   TAIL-PCR反应中使用的引物序列如下：
   T-DNA左端引物：
   L16：5’CGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTA 3’
   L14：5’GCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGT 3’
   LBT2：5’ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT 3’
   NTLB5：5’AATCCAGATCCCCCGAATTA 3’
   LP2：5’CTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTT；3’
   LSP2：5’GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC；3’
   LBT3：5’CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT 3’。
   T-DNA右端引物：
   PFRB1：5’GAGAAAAGGGTCCTAACCAAGAA 3’
   PFRB2：5’GGGTCCTAACCAAGAAAATGAAG 3’
   PFRB3：5’CAAGAAAATGAAGGAGAAAAACTAGAA 3’
   PFRB4：5’TGCAGGTTCTCTCCAAATGA 3’
   Tos17左端引物：
   TosLP1：5’GTGAAAAGGACAGTGGAGCAGTGGATAA 3’
   TosLP2：5’GACCATTGCTCTGATACCATCTTAACTAACTTGC 3’
   TosLS：5’CTGATACCATCTTAACTAACTTGC 3’
   Tos17右端引物：
   TosRP2：5’TACAAGTCGCTGATTTCTTCACCAAGGC 3’
   TosRP3：5’CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTGGTAGA 3’
   TosRS：5’GAAGGGGGGTGTTAAATATATATAC 3’
   简并引物(ADP)：
   AD2-1：5’(ATCG)GACGA(CG)(AT)GA(ATCG)A(AT)GAA 3’
   AD8：5’AG(AT)G(AGCT)AG(AT)A(AGCT)CA(AT)AGG 3’
   AD11：5’TG(AT)GNAG(GC)ANCA(GC)AGA 3’
   

注意事项

1. 本方法适用于分离来源于RMD(http://rmd.ncpgr.cn/)突变体库的T-DNA和Tos17插入突变体的侧翼序列。
   
2. TAIL-PCR的优点是简便快速，但缺点是效果不稳定。
   
3. 当仅针对少数感兴趣的突变体分离侧翼序列时，更换特异引物和随机引物的组合有时能分离到不同的侧翼序列。
   

参考文献

1. 龙湍，杨莹，符德保，吴昌银. (2018). 2 ml离心管法快速制备水稻高质量总DNA. Bio-101 e1010106. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010106.