农杆菌介导的玉米小斑病菌的遗传转化

一、试剂的配置：

1.磷酸氢钾缓冲液(K-buffer, PH5.3)（200mL）：

45.64g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)加入双蒸水定容至200ml，用H₃PO₄调PH至5.3，高压蒸汽灭菌。

2.硫酸镁-氯化钠(M-N)（1L）：

七水合硫酸镁(MgSO4∙7H2O) 30g，氯化钠(NaCl) 15g加双蒸水定容1L；高压蒸汽灭菌。

3.1%氯化钙(CaCl2) (W/V)（100mL）：

1g CaCl2.H2O加入双蒸水定容100ml；高压蒸汽灭菌。

4.20%葡萄糖(Glucose) (W/V)（100mL）：

20g Glucose加入无菌水定容100ml，细菌过滤器过滤灭菌。

5．50%甘油(Glycerol)（100mL）：

50ml 100%的Glycerol加入双蒸水定容100ml；高压蒸汽灭菌。

6．1%FeSO4（100mL）：

0.01g的FeSO4加入无菌水定容100ml，细菌过滤器过滤灭菌，现用现配。

7.0.1M的乙酰丁香酮(AS)：

取196.2mg AS，用二甲亚砜(DMSO)溶解，定容至10ml，即为0.1M AS，将其分装于1.5ml离心管中，-20℃贮存备用，使用前无须灭菌。

8.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸钠(MES)：

称取7.812gMES,用40mL无菌水完全溶解,调pH为5.3，细菌过滤器过滤灭菌，配成-20℃贮存备用。

9.100mg/ml头孢霉素：

称取100mg头孢霉素(公司：Biosharp)溶解1ml的灭菌双蒸水中，用细菌过滤器过滤除菌，配成100mg/ml溶液装于1.5ml无菌离心管中，将其置于-20℃贮存备用。

10.Spore element(1L)：

ZnSO₄·7H₂O 100mg，CuSO₄·5H₂O 100mg，MnSO₄·5H₂O 100mg，Na₂MnO₄·5H₂O 100mg，H₃BO₃ 100mg,加双蒸水定容到1L，高压蒸汽灭菌。

11. 20%(NH4)₂NO₃ (w/v)：

20g (NH4)₂NO₃加入双蒸水定容100ml。

12.诱导培养基(IM)（1L）:

13.共培养培养基(CO-IM)（1L）：

二、实验方法

1)将质粒转入农杆菌EHA105中，挑取单菌落在LB(含50ug/ml Rif, 50ug/ml Kan)平板上划线活化；

2) 挑取阳性单菌落与5ml LB(50ug/ml Rif, 50ug/ml Kan)中180r/min，28℃摇床培养过夜；

3) 农杆菌生长至OD600=1.0，用IM培养基将农杆菌菌液稀释至OD600=0.15，180r/min，28℃摇床培养5h。离心6000r/min，5min，收集农杆菌，并用50ml IM培养基溶解农杆菌；

4) 用灭菌双蒸水冲洗TM17斜面，离心6000r/min，5min，收集孢子。用含农杆菌的IM培养基稀释孢子至1×10⁶个/ml混匀。在CO-IM平板上铺一层玻璃纸（提前高压蒸汽灭菌），吸取300ul农杆菌与TM17孢子的混合液涂于CO-IM平板上，建议涂4-5块CO-IM。25℃避光培养3d；

5）揭下玻璃纸置于灭过菌的培养皿上，上面倒15mlPDA（ 30ug/ml潮霉素，500ug/ml头孢霉素），25℃培养2d；

6）挑取长出的单菌落至于PDA平板（ 30ug/ml潮霉素）上；

7）将在PDA平板（ 30ug/ml潮霉素）上正常生长的小斑病菌转接到V8培养基上进行培养。