High quality Fungal genomic DNA isolation

用于全基因组测序的真菌基因组DNA的提取

步骤

65℃预热beffer B。准备裂解液：500mg菌体使用17.5ml。

利用液氮充分研磨菌体，转移进入50ml液氮遇冷的离心管中，加入17.5ml裂解液，快速涡旋充分混匀。

65℃水浴30min，每5-10分钟轻轻颠倒一次。

加入5.75ml（0.33vol）KAc（5M），轻轻颠倒混匀，冰浴30min。

4℃，5000g，离心20min。

吸取上清到新的50ml离心管内，加入1 vol氯仿:异戊醇:苯酚（25:24:1）萃取，10min。4℃，4000g，离心10min。

吸取上清到新的50ml离心管内，加入1 vol氯仿:异戊醇（24:1）萃取，10min。4℃，4000g，离心10min。

吸取上清到新的50ml离心管内，加入130 ul RNase A（10mg/ml），37℃水浴2h。

加入1/10 vol KAc（5M）和1 vol异丙醇，轻轻混匀，室温静止5min。4℃，10000g，离心30min。

去上清，用70%乙醇清洗，4℃，10000g离心10min。

去上清，室温下风干15min左右。

加250ul TE，轻弹助融，65℃金属浴2-5min，保存于-80℃。

试剂配制

Buffer A:  0.35M sorbitol （山梨醇）

         0.1M Tris-HCl，PH9

         5mM EDTA，PH8

Buffer B： 0.2M Tris-HCl，PH9

          50mM EDTA，PH9

          2M NaCl

          2% CTAB

Buffer C： 5% Sarkosyl（N-lauroylsarcosine sodium salt）  十二烷基季胺酸钠   

Potassium Acetate 5M （KAc precipitate polysaccharides）  PH7.5

RNase A （10mg/ml）

Proteinase K （20mg/ml）  

PVP 1%     聚乙烯吡咯烷酮

Chloroforme：Isoamylalcool（24:1）

Sodium Acetate（KAc） 3M

Isopropanol 100%   异丙醇

Ethanol 70%

Lysis Buffer        For 17.5ml

2,5 vol of buffer A       6.5ml

2,5 vol of buffer B       6.5ml

1 vol of Buffer C        2.6ml

PVP 1%              1.75ml

Proteinase K           125ul