拟南芥蛋白磷酸化水平检测

IP-Phosphorylation level Assay protocol

1.     取0.5g叶片，将其放入液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨，致其成为细粉状，将粉末放入预冷的2ml离心管中，加入0.5ml lysis buffer.

2.     放入4度，360°摇床50min。

3.     13000rpm 4度15min 吸上清，重复一次。(取50ul作为input)

4.     预处理beads，每个样品加25ul beads，用lysis buffer(不含有cocktail,PMSF 但是添加Triton-100,DTT),500ul 2500g 4度2min。重复一次（注：把lysis buffer加入beads中先轻柔混匀，冰上静置1min 再离心，吸上清过程中不要吸出beads，适当留点液体。）

5.     将上清都加入预处理过的beads中，放入4度，360°摇床3h。

(注：孵育3h这段时间先跑input 作为Actin内参)

6.     离心，2500g 4度2min。

7.     丢弃上清，用lysis buffer(不含有cocktail,PMSF 但是添加Triton-100,DTT),500ul 2500g 4度2min，重复三次。最后一次尽量吸干净上清。

8.     加入50ul elution buffer，室温用手轻柔混匀5min，(若样品多，则分批次做，一次最好操作两个样品)，离心2500g RT 2min。

9.     加入5ul平衡液，加入10ul 6XSDS(提前99度预热的)。37度孵育10min，点样。（后面按照Western Blot 进行操作）

10.  80V预电泳30min，后调成150V电泳。当目的条带电泳至分离胶中间时，停止电泳。用单蒸水轻轻清洗玻璃板，取出蛋白胶，切去浓缩胶，可以在分离胶的左上方切去一个小角以辨别方向。然后迅速置于1xTGM中。ATTENTION: 1 1x Running Buffer 至多使用两次。

 2 若是奇数块胶，注意配平，夹紧。

11.转膜

 1 依次向半干转系统叠放：厚的滤纸(Extra thick blot paper/Filter paper)→3mm滤纸→膜(Nitrocellulose Membranes)→蛋白胶→3mm滤纸→厚的滤纸，每放一层，倒上1xTGM（半干转200ml左右就足够，湿度转需要1.5L，4度保存） 浸湿（缓慢的将膜一点一点的放入，使膜完全浸湿）。叠放完后，用玻璃试管擀气泡，不能太用力。

ATTENTION:   1  厚的滤纸至多使用两次，第一次使用时转膜可以不加3mm滤纸，第二次使用时必须用3mm滤纸，厚滤纸使用一次后用单蒸水浸泡2-3次，再晾干后使用。

               2  膜的大小为8.3cm x 5.6cm（差不多就是胶的大小）。

               3  盖住仪器盖子时请注意对准方向。

               4 电源为高压电泳系统。

               5 蛋白分子质量 M<50KDa，24V，30min

                              M>50KDa，24V，30-40min（实践经验需要1h30min）

                              M.>100KDa，湿转 （24v，过夜） 

12. 1染色脱色

  转膜完成后，取出膜迅速置于旁素染液中，染色1min，回收Ponceau S染料。（Ponceau S，根据使用频率配制一定的量储存，每次使用2-3ml，用完后可回收，每次使用会有损失，带其快用完后再配新的）

  用灭过菌的ddH2O漂洗两遍。拍照（染色这里染得蛋白，看你的转膜效率。拍照需要拍下来rubisco，内参，代老师实验室用的是actin的抗体，更准确相对来说）

  用1x TBST（4度） 漂洗两遍。

2封闭

  用1x TBST 配置5% nonfat milk（一张膜，10ml即可，用摇床摇匀脱脂牛奶再使用），室温，摇床，1h。

  用1x TBST迅速漂洗一次。

3 一抗

用1x TBST 配置1% nonfat milk 10ml，加一抗2ul。4℃，摇床，16h，回收一抗。

ATTENTION: 1 一抗可以使用五次，注意回收。(有的实验室是封闭4度过夜，一抗室温几个小时，你可以自己查查区别)

4 二抗

用1x TBST漂洗，8min。重复一次。

用1x TBST 配置1% nonfat milk 10ml，加二抗1ul。室温，摇床，30min。（二抗不回收，羊抗兔，羊抗鼠根据一抗的来源确定）

用1x TBST漂洗，室温，摇床，8min。重复一次。

六 照膜

显色液配置,体积比Luminal/enhancer Solution：Peroxide Solution = 1：1

（8.3cm x 5.6cm 大小的膜需要1.2ml 显色液），蛋白膜需与此混合液充分接触。

IP Lysis buffer配方：

10% glycrerol

50Mm Tris-HCl(PH7.5)

150mM Nacl

0.5% Triton 100

2mM DTT

1 mM EDTA(PH8.0)

1Xcocktail PMSF

抗体：

一抗：Anti-GFP 1:5000 10ml TBST中加2ul(鼠抗)

Anti-P-Thr 1:1000 10ml TBST中加10ul（兔抗）

Anti-Actin 1:5000 10ml TBST中加2ul（鼠抗）

二抗：

Goat anti Mouse IgG :1:10000 10ml TBST中加1ul

Goat anti Rabbit IgG :1:10000 10ml TBST中加1ul