Gibson Cloning

Gibson Cloning

1   试剂的准备

1.1  Phusion DNA Polymerase

货号：NEB的#M0530S 2000U/ml  Phusion® Hot Start Flex DNA Polymerase

Catalog #: M0536S , M0536L

Function：High Fidelity DNA Polymerases are important for applications in which the DNA sequence needs to be correct after amplification. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase offers both high fidelity and robust performance, and thus can be used for all PCR applications. Its unique structure, a novel Pyrococcus-like enzyme fused with a processivity-enhancing domain, increases fidelity and speed. Phusion DNA Polymerase is an ideal choice for cloning and can be used for long or difficult amplicons. With an error rate 50-fold lower than that of Taq DNA Polymerase and 6-fold lower than that of Pyrococcus furiosus DNA Polymerase , Phusion is one of the most accurate thermostable polymerases available. Phusion DNA Polymerase possesses 5´→ 3´ polymerase activity, 3´→ 5´ exonuclease activity and will generate blunt-ended products.

作用：高保真DNA聚合酶在DNA序列扩增后的正确匹配性是重要的。该款DNA聚合酶提供高保真度和执行的随意性，因此可用于所有PCR扩增。根据其独特的蛋白结构，一种新型的似球菌的酶与强化过程的结构域组成，提高保真度和速度。DNA聚合酶是一个理想的克隆选择，可用于长片段或困难片段的扩增。Phusion是最精确的热稳定性聚合酶之一，其错误率比Taq DNA聚合酶低50倍，比糠秕焦球菌DNA聚合酶低6倍。DNA聚合酶具有5’到3’聚合酶活性，3’到5’外切核酸酶活性，能够产生平末端产物。

1.2  T5 Exonuclease

货号：NEB的#M0363S 10000U/ml 

Catalog #: M0363S , M0363L

Function：T5 Exonuclease degrades DNA in the 5´ to 3´ direction . T5 Exonuclease is able to initiate nucleotide removal from the 5´ termini or at gaps and nicks of linear or circular dsDNA . However, the enzyme does not degrade supercoiled ds DNA . T5 Exonuclease also has ssDNA endonuclease activity.

作用：T5核酸外切酶从5’至3’降解DNA。T5核酸外切酶能够从5’末端或在线性与环状双链DNA的间隙和缺口中开始去除核苷酸。然而，该酶不降解超螺旋的双链DNA。T5核酸外切酶也具有单链线性DNA核酸内切酶活性。

1.3 Taq DNA Ligase

货号：NEB的#M0208L 4000U/ml 

Catalog #: M0363S , M0363L

Function：Taq DNA Ligase is a thermostable ligase that catalyzes the formation of a phosphodiester bond between the 5´-phosphate and the 3´-hydroxyl of two adjacent DNA strands. The strands to be ligated need to be hybridized and accurately paired, with no gap, to a complementary DNA strand; allowing resolution of single nucleotide variants. Taq DNA Ligase uses NAD as a cofactor and it is active at elevated temperatures (37° C – 75° C).

作用：Taq DNA Ligase是一种热稳定性连接酶，催化两个相邻DNA链的5-磷酸和3-羟基之间形成磷酸二酯键。要连接的链需要杂交，并且精确配对，没有间隙，与互补的DNA链；允许单核苷酸变异体的解析。Taq DNA连接酶使用NAD作为辅因子，它在升高的温度（37°C～75°C）下是活跃的。

1.4 NAD

β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate

 (二磷酸吡啶核苷酸, 辅酶 1, 辅酶 A, 辅酶)

货号：Sigma的V900401-5G

Catalog #: V900401 经验分子式（希尔表示法） C21H27N7O14P2 · xH2O  分子量 663.43 (anhydrous basis) 

Function： Taq DNA Ligase uses NAD as a cofactor and it is active at elevated temperatures (37° C – 75° C).

作用： Taq DNA连接酶使用NAD作为辅因子，它在升高的温度（37°C～75°C）下是活跃的。

1.5 PEG 8000

Poly(ethylene glycol)

中文名：聚乙二醇

货号：vetec的V900156-500G

Catalog #: V900156线性分子式 H(OCH2CH2)nOH

1.6 Tris base

Trizma® 碱

中文名: 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇, THAM, Tris 碱, 三羟甲基氨基甲烷, 氨基丁三醇

货号：Vetec的V900483-500G

Catalog #: V900483线性分子式 NH2C(CH2OH)3  分子量 121.14

1.7 Glycerol

中文名: 甘油，丙三醇

货号：国药的10010618

分子式：C2H3O3  分子量 92.09

1.8 EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

中文名: 乙二胺四乙酸, 亚乙基二次氮基四乙酸, 依地酸

货号：Vetec的V900106

Catalog #: V900106线性分子式 (HO2CCH2)2NCH2CH2N(CH2CO2H)2  分子量 292.24

1.9 NaCl

Sodium chloride

中文名: 氯化钠

货号：Vetec的V900058

Catalog #: V900058 线性分子式 NaCl  分子量 58.44

1.10    DTT

DL-Dithiothreitol

中文名: 二硫苏糖醇

货号：BIOSHARP的???

Catalog #:??? 分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25

1.11    Triton X-100

T-octylphenoxypolyethoxyethanol

中文名: 曲拉通 X-100

货号：生工的A110694-0100

Catalog #: A110694-0100 分子式为C34H62O11，密度 1.06 g/ml(25°C)

1.12    MgCl2·6H2O

Magnesium chloride hexahydrate

中文名: 氯化镁 六水合物

货号：Vetec的V900020

Catalog #: V900020 线性分子式  MgCl2·6H2O  分子量为203.20

1.13    dNTP

dNTP mixture, 10 Mm

中文名: dNTP mixture 溶液（10 mM）

货号：生工的B500056

Catalog #: B500056

10 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP.

2   试剂的配置

2.1  1M Tri-Cl pH 7.5

12.114g Tris base 溶于80ml d₂H₂O,用HCl调节pH到达7.5。补d₂H₂O定容到到100mL；

2.2  50mM NAD

0.03317g NAD(4℃保存), 补d₂H₂O到1 ml，配置好后-20℃保存；

2.3  5×APB (5×Assembly Pre-Buffer)

配置好后-20℃保存，使用前用涡旋仪振荡。

2.4  1M MgCl2

20.32g MgCl2·6H2O，补d₂H₂O定容到到100mL；

2.5  1M NaCl

5.844g NaCl，补d₂H₂O定容到到100mL；

2.6  1M DTT

1.5425g DTT，补d₂H₂O定容到到10mL；使用前将沉淀混匀；

2.7  0.5M EDTA

14.612 g EDTA，溶于100ml d2H2O,用NaOH调节pH到达8。补d2H2O定容到到100mL; 

2.8  T5 Exonuclease Dilution Buffer

配置好后-20℃保存；

2.9  T5(1U/μl)

10μl的T5 Exonuclease溶于90μl T5 Exonuclease Dilution Buffer ，配置好后-20℃保存；

2.10          Gibson buffer

配置好后分装成1.6μl/管，-20℃保存；其中一次反应只需要1.5μl。

3   Gibson 反应

3.1   Gibson 反应体系

X+Y=1.3

 (A* X)/2= (B* Y)/10

3.2   Gibson 反应程序

50℃，反应45min,反应结束后，直接加入感受态中，或者-20℃保存；

申明

此Gibson buffer配置方式可与各种试剂官网说明书，一起看。文中方法不一定适合所有的克隆，因此仅供参考。

    如果有错误，请发送到邮箱1329532528@qq.com ,谢谢！