大肠杆菌DH5alpha感受态细胞制备

所有称量过程需要尽量精确！！！

A. PIPES: 0.5M(PH6.7)  

 15.1 g PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）溶于80 ml ddH2O ，利用5M KOH或者NaOH调PH至6.7，最后定容100 ml，过滤灭菌，存于-20℃。

B．Inoue buffer 配方（1L）

过滤灭菌后保存于-20℃，分成小份备用。

C．灭菌。所有需要用到的锥形瓶，离心管、配装试剂的容器均需利用双蒸水冲洗多次，并灭菌。

所有转接菌、悬菌操作都需要在擦净灭菌的超净工作台进行！！！

1. 从-80℃拿出Ecoli.原液，再LB板子上划线，37℃（12-16 hours）。（早上划线活化）

2. 挑单菌落转接入25ml LB锥形瓶中，置于37℃ 200rpm摇床上，培养6-8 hours。（晚上摇单菌落）

3. 将摇过夜的菌种按照1:15的量接种至装有500ml LB 的2L锥形瓶中，置于18-22℃摇床中培养，每隔一小时测一次OD600值，待其OD600为0.45-0.5时进行下一步操作。

4. 将菌液OD600（0.45-0.5）置于冰上冰浴10 min，离心机遇冷至4℃，Inoue buffer在冰上预冷待用。

5. 收集菌体，4℃ 2000g离心10 min。

6. 尽量将上清倒干净（倒去上清后可在灭菌的吸水纸上沥干，超过1-2 min）。

7. 在冰上按照每250 ml菌液用80 ml 0.5M (PH6.7) Inoue buffer 悬浮菌体洗去菌体上的LB（500ml菌液用160 ml Inoue buffer悬浮菌体）。Gently！

8. 将重悬的菌液2000g 4℃离心10 min。

9. 再按照每80 ml菌液用20 ml 0.5M (PH6.7) Inoue buffer 悬浮菌体（160 ml菌液用40 ml Inoue buffer悬浮菌体）。Gently！

10. 在冰上按照每20 ml菌液加入1.5 ml DMSO（40 ml菌液用3 ml DMSO）。一定要按量加入DMSO（少则达不到保护剂效果，多则毒害细胞）,同时摇匀。Gently！

注意：DMSO切不可放于-20℃或更低，避免爆炸！！！

DMSO不可暴露光下，避免氧化！！！

11. 加入DMSO混匀后置于冰上冰浴10 min。-20℃预冷1.5 ml离心管。

12. 在冰上按照50 ul或者100 ul分装，并立即用液氮速冻，后放于-80℃保存备用。