小鼠脑组织冰冻切片

1.   OCT（SAKURA, 4583）

2.   刀片（Leica 819 Low profile microtome blades)

3. 带正电荷的载玻片（Fisherbrand Cat 12-550-15）；或加有1XPBS的24/48孔板（国产）

4. 细毛笔（华虹345）

5. 防卷板（Leica, 14047742497）

6. 1XPBS

冰冻切片机（Leica）

1.包埋样品

1）灌流固定及后固定后的样品经10倍体积的30%蔗糖（PBS）在4度脱水至沉底（成年鼠脑通常需要2天；幼年不带颅骨的鼠脑通常需要1天，带颅骨则需更久），更换5-10倍体积的30%蔗糖，4度再度脱水12-24小时。

2）启动冰冻切片机。

3）取出脱水后的脑样品，在无尘擦拭纸上静置，充分去除水分。

4）使用2-3层铝箔纸包裹方形铝块，制作包埋模具（根据脑大小选择制作模具的大小）；或使用购置的cryomold。

5）在模具上标注样品编号和包埋时嗅球朝向的方向（铝箔纸制作的模具需在从铝块上取下之前标注，否则容易变形）。

6）按标注好的方向将鼠脑腹侧向下平放在模具中心，脑的中线与侧边平行。

7）从鼠脑中央匀速滴入OCT至鼠脑完全覆盖。若鼠脑位置有变动，可用镊子或10微升枪头调整。若有气泡，需用枪头吸出。

8）迅速将鼠脑放置到冰冻切片机的快速冷冻位上冷冻至OCT完全凝固。

9）包埋后的样品可放入负80度冰箱低温保存。

注意事项：

1）鼠脑表面必须完全干燥。若不确认，可用OCT迅速润洗一遍再放入模具。表面遗留30%蔗糖将导致切片时OCT与样品分离。

2）OCT中不能有气泡，特别是样品附近的气泡会影响冰冻和切片效果。

3）鼠脑加入OCT后需尽快冰冻，不能长时间在室温浸泡，否则影响冰冻和切片效果。

4）建议保存方式：用12孔板或6孔板，每孔放置一个样品，在板子的盖子与底部做好标注，并做好实验记录。将板子装在去除分隔的冻存盒中，插入铁架保存。不建议散放，容易丢失样品。

2.冰冻切片

1）启动冰冻切片机。将切片机冻头温度设置为-21度，刀片温度设置为-20度 （可按实际切片情况调整）。

图为切片机控制面板，常用按键由左至右分别为：   |速冻时间&按键|机箱温度&按键|冻头温度&按键|时间|照明、锁定|

2）将从-80取出的样品放入切片机中复温至与切片机设置相同。

3）从模具中取出样品，按照切片所需的方向，将样品用OCT固定在底座上，放在速冻台上凝固固定。

4）锁住摇动把手，将刀片、样品、防卷板分别装置固定，调整样品与刀片的距离及角度，使之与刀片及刀片切割的方向平行。装置样品时需打开左部的卡槽。

a.将刀片插入缝隙,前推右侧手柄可固定住刀片，后扳手柄可松开刀片;

b.分别顺时针、逆时针拧冻头右上角的手柄可固定或松开冻头，从而调整冻头的角度；

c.顺时针扳动冻头左侧的手柄可将样品的底座固定在冻头上;

d.将防卷板插入槽内，拧紧螺丝直至固定住防卷板

5）将切片厚度设置为100-200微米，迅速去除多余的OCT，直至接近样品（通常能看到一点肉色透出）。在切片的同时可再次调整角度，获得合适的切面。此时不需放下防卷板。

——切片厚度

——调整切片厚度

——冻头快速后退

——冻头慢速后退

——冻头慢速前进

——冻头快速前进

6）根据实验需求设置正式切片的厚度。RNA原位杂交用贴片通常设为12-20微米；免疫组化用漂片通常设为30-50微米，贴片通常设为20-30微米。

7）放下防卷板，微调后方的旋钮以调整防卷板前后位置，使得切下的切片平滑进入防卷板之下的间并被压平整。

8）若采取漂浮收片，需预先准备加有PBS的24孔或48孔板。使用小毛笔将脑片转移到PBS中，按顺序收取。板子的盖子和侧面均应标注，避免盖板分离，样品混淆。

9）若采取贴片，需使用带正电荷的防脱玻片，将脑片平整的贴在玻片上。

将脑片转移到玻片上主要有两种方法：

a.采用室温玻片，用玻片轻触脑片的一端或中间，使OCT融化，脑片自然贴附

b.将玻片放在切片机中预冷至与样品温度一致，将切片用毛笔转移到玻片上，用毛笔展平，再用手指从玻片背侧加温，使OCT融化，脑片贴附

10）冰冻漂片的保存与振动切片相同；冰冻贴片需在室温晾置30-60分钟，再转移到负80度冻存（短期内使用可在4度保存）。在负80保存的贴片，使用前需再次晾置30分钟。

注意事项

1）检查刀片和防卷板有无豁口，若有需避开或更换

2）调节距离时避免快速撞击防卷板或刀片，以避免产生豁口

3）贴片前注意检查玻片的洁净程度，若有明显杂质附着，需更换或处理后再使用

4）贴片时勿将脑片贴在已有OCT的区域，否则容易在染色或漂洗过程中脱落

5）贴片一般分2-6套（即第一张脑片贴在第1张玻片，第二张脑片贴在第2张玻片，依次类推再循环）,以便染多种抗体组合或杂交不同探针。

6）预先在玻片有色端做好标注，以免出错

7）晾片时摆放在安全的位置，避免被他人误动、撞伤或滴落不明液体

8）负80度保存的样品和切片均应避免反复冻融，因此在取部分样品/切片时动作要快，以避免影响到当次不用的样品和切片

9）切片时若出现脑片碎裂，说明样品温度过低；若出现卷片粘连，说明样品温度过高；应相应调整冻头与机腔温度，优化切片效果。