小鼠基因型鉴定

1. 刺青/纹身染料（Ketchum）

2.  鼠尾（或其他易消化的组织，如鼠耳、脚趾、胚胎组织等）

3.  鼠尾裂解液（Viagen, Tail lysis buffer,102-T；4C冷柜）

4.  蛋白酶K（生工，P0706—50mg,100×的蛋白酶K浓度为10mg/ml；-20℃冰箱）

5. 3M醋酸钠（SIGMA-ALDRICH,127-09-3，82.03g/mol，若配置50ml的3M醋酸钠，需加入12.3g醋酸钠固体溶于50mlddH₂O）

6.    异丙醇

7.    75%乙醇

8. PCR mix （【1】TIANDZ，90805-9×5；含上样缓冲液、dNTPs、 Mg2+稳定剂等，PCR酶单独包装，使用前加入； -20℃冰箱.【2】Thermo fisher,#K1082，-20℃,含Dream Taq DNA polymerase，optimized Dream Taq Green buffer，MgCl₂ ，dNTPs.【3】 novoprotein，cat:E005-02, 2×Taq Master Mix; -20℃冰箱）

9. PCR引物 （浓度100μM，生工或thermo fisher订购；-20℃冰箱）

10. 琼脂糖 （BIOWEST，111860；室温）

11. TAE（电泳缓冲液）

    50×TAE缓冲液: 配置500 ml 的缓冲液，需加入：121g Tris碱（C₄H₁₁NO₃，121.14g/mol，cat：V900483-500G）28.5ml冰乙酸（C₂H₄O₂，分子量60.05，cat：10000218，国药集团化学试剂有限公司）50ml 0.5 mol /L EDTA（C₁₀H₁₆N₂O ，分子量292.24，cat:10009617，国药集团化学试剂有限公司）调节至pH 8.0（利用pH试纸测定溶液pH:用胶头滴管吸取少量溶液，滴一滴于pH试纸上，与标准比色卡比较，判定溶液pH值；若pH>8.0，则加入适量盐酸降低pH至8.0，若pH<8.0，则加入适量氢氧化钠提高pH至8.0）；电泳时稀释为1×TAE缓冲液；室温）

12. DNA marker （【1】TaKaRa BIO INC,3422A；4℃冷柜.【2】TIANDZ,70503X-50,4℃为使用中，-20℃未使用）

13. 核酸染料（GenGreen GG1301-500UL；4℃冷柜）

14. miniQ H₂O(-20℃冰箱；灭菌后分装保存的)

1. 1ml注射器针头（KDL上海康德莱企业发展集团股份有限公司）

2. 耳洞钳（FST）

3. 碳钢刀片（American Line 66-0089，淘宝订购）

4. 凝胶成像仪（ChemiDoc Touch Imaging System, Bio-Rad, 732BR0844）

1.      小鼠剪尾和标记

a)      新生小鼠（<P7）的剪尾和标记

                 i.          标记方法：用小号注射器针头沾取适量动物用刺青染料，在小鼠脚掌中心穿刺5-8次，确保染料进入伤口，以留下永久性标记。

               ii.          标记顺序：标记时采取先前(F)再后(B)、先右(R)再左(L)的顺序（以下操作中的左右均以小鼠背部向上为基准），按照FR、FL、BR、BL、FRL、BRL、FRBR、FLBL、FRBL、FLBR、FRLBRL、FRLBR、FRLBL、FRBRL、FLBRL、NM（无标记）的顺序依次进行穿刺标记。小鼠数量过多时，可分雄雌或毛色分别进行标记。

              iii.          剪尾方法：在洁净刀片上用记号笔划分5-8个区域，依次使用割取~2mm鼠尾放入标记好的1.5ml无菌EP管中，每只小鼠换用一个区域以避免交叉污染。

              iv.          注意事项：

Ø  新生小鼠无法自行保持体温，请勿长时间在外放置，防止失温死亡。

Ø  母鼠对气味敏感，若连续处理多笼小鼠，其间需更换手套或用酒精喷手，防止小鼠染上它笼气味被母鼠攻击

Ø  鼠尾切勿割取过长！！！

Ø  剪下的组织若不立即使用，可在-20C冰冻保存数周到数月。 

Ø  标记时注意避免染料附于将取组织表面，且在盖EP管时不要碰到盖内侧，以免材料被手套上的染料或其他杂质污染

b)     分笼后小鼠（>P21）的剪尾和标记

                 i.          标记方法：使用耳标钳（F.S.T. ear punch）在小鼠耳朵上打洞。

               ii.          标记顺序：标记时采取从右到左的顺序，按照NH（无洞）、HR、HL、HRL的顺序进行标记。小鼠数量过多时，可分雄雌分别进行标记。

              iii.          剪尾方法：在洁净刀片上用记号笔划分5-8个区域，依次使用割取~2mm鼠尾放入标记好的1.5ml无菌EP管中，每只小鼠换用一个区域以避免交叉污染。或用小剪刀剪~2mm鼠尾，放入标记好的1.5ml无菌EP管中，剪完一只后需用酒精消毒剪刀再剪下一只，防止基因污染

c)      P7-P21小鼠的标记（如非必要，不建议采用，可能影响小鼠行动）

                 i.          标记方法：用右手提起小鼠尾巴将其放在笼盖上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指贴合在小鼠身体靠近尾部位置缓缓向前推进，捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心，无名指和小指压住其尾部，用小剪刀剪其脚趾根部，确保其愈合后断趾明显，留下永久标记。剪下的组织放入标记好的1.5ml无菌EP管中，剪完一只后需用酒精消毒剪刀再剪下一只，防止基因污染。

               ii.          标记顺序：剪中间脚趾，采取先前(F)再后(B)、先右(R)再左(L)的顺序，按照FR、FL、BR、BL、FRL、BRL、FRBR、FLBL、FRBL、FLBR、FRLBRL、FRLBR、FRLBL、FRBRL、FLBRL、NM（无标记）的顺序依次进行。

2.      DNA模板制备

a)      蛋白酶K消化：

                 i.          在鼠尾裂解液中加入蛋白酶K（100X蛋白酶K溶液1:100稀释，即配即用），颠倒混匀，低速离心。

               ii.          在装有鼠尾或其它组织的EP管中加入50μl混合液，13300rpm离心3min，确保组织完全没入液面以下。

              iii.          55℃烘箱消化过夜。

b)     蛋白酶K灭活（多数样品适用）：

                 i.          将烘箱温度调至90℃，保温1h，令蛋白酶K变性失活。

               ii.          13300rpm离心10min，令组织残渣沉淀，取上清作为PCR模板。

              iii.          来源幼鼠的PCR模板可在4C保存一周至数周；来源成年鼠的PCR模板杂质较多，不宜长时间保存。

c)      DNA简单纯化（PCR不稳定或产物长度>1.5kb样品适用；纯化前请勿90℃灭活！）

                 i.          在装有鼠尾或其它组织的EP管中加入50μl含蛋白酶k的鼠尾裂解液，13300rpm离心3min，确保组织完全没入液面以下。

               ii.          55℃烘箱消化过夜。

              iii.          13300rpm离心10~15min，将上清转移到新管中，以去除毛发骨头等各类杂质。

              iv.          向EP管中加入450μl miniQ H₂O和50μl3M醋酸钠（终体积的1/10），充分混匀，13300rpm离心10min。

               v.          在不触动沉淀的前提下，将上清用200μl移液枪转移至新的EP管中，加入预冷的异丙醇500μl，轻柔颠倒混匀，可观察到絮状DNA析出。

              vi.          13300rpm4度离心10~15min，观察到管底部或侧面有白色沉淀。

             vii.          小心吸弃上清，加入800μl的75%乙醇于EP管中，轻柔颠倒EP管，清洗沉淀，13300rpm离心10min。

Ø  清洗后DNA沉淀会变松，极易丢失，离心后需确认沉淀回到管底。

            viii.          小心吸去75%乙醇，切勿将沉淀吸入枪头。

              ix.          低速离心10s，用10μl枪将液体尽量吸干。

                x.          开盖晾干沉淀。

Ø  晾干后DNA会变透明，溶解时需确保将水滴于DNA所在处。

              xi.          待闻不到明显酒精气味时，加入50μl miniQ H₂O，反复吹吸至DNA充分溶解。

d)     DNA酚氯仿抽提（PCR不稳定或产物长度>1.5kb样品适用；纯度高，可较长期保存；抽提前请勿90℃灭活！）

                 i.          在装有鼠尾或其它组织的EP管中按照1:10的质量体积比加入含蛋白酶k的鼠尾裂解液，13300rpm离心3min，确保组织完全没入液面以下。

               ii.          55℃烘箱消化过夜。

              iii.          13300rpm离心10~15min，将上清转移到新管中，以去除毛发骨头等各类杂质。

              iv.          如体积不足200 μl，用miniQH₂O将体积补足到200 μl。若多于，则不必补。

               v.          加入1倍体积酚氯仿，手动剧烈摇晃混匀15-30s。

              vi.          13300rpm4度离心10~15min，将上清转移到新管中。吸取时速度要慢，枪头不能接触中间层（蛋白质层），宁少勿多，杜绝污染。

             vii.          加入1倍体积氯仿，手动剧烈摇晃混匀15-30s。

            viii.          13300rpm4度离心10~15min，将上清转移到新管中。吸取时速度要慢，枪头不能接触下层，宁少勿多，杜绝污染。

              ix.          加入1/10体积的3M醋酸钠，1倍体积异丙醇（或3倍体积乙醇）。

                x.          轻柔颠倒混匀，可观察到絮状DNA析出。

              xi.          13300rpm4度离心10~15min，观察到管底部或侧面有白色沉淀。

             xii.          小心吸弃上清，加入800μl的75%乙醇于EP管中，轻柔颠倒EP管，清洗沉淀，13300rpm离心10min。

Ø  清洗后DNA沉淀会变松，极易丢失，离心后需确认沉淀回到管底。

            xiii.          小心吸去75%乙醇，切勿将沉淀吸入枪头。

            xiv.          低速离心10s，用10μl枪将液体尽量吸干。

             xv.          开盖晾干沉淀。

Ø  晾干后DNA会变透明，溶解时需确保将水滴于DNA所在处。

            xvi.          待闻不到明显酒精气味时，加入50μl miniQ H₂O，反复吹吸至DNA充分溶解。 

3.      PCR

a)      PCR体系：

                 i.          引物配置

Ø  13300rpm离心10min，加入适量灭菌milliQ水，溶解到100μM（储备液，体积在管壁上有标注）或20μM（工作液）。

Ø  在漩涡混合器上剧烈震荡，令引物完全溶解后短暂离心，-20℃（使用中）或-80℃（备用；侯永洁负责）保存。

Ø  -80℃引物转入-20℃后，应立刻通知侯永洁订购备用管。

               ii.          在PCRmix中加入酶，轻柔颠倒混匀，分装为500μl/管，-20℃保存

Ø  使用滤芯枪头、未开封新管分装，以避免污染。

Ø  用完移液枪请调回至最大量程。

              iii.          配比

              iv.          分装入8联管（19μl/管），加入1μl模板，盖盖，桌面离心机离心10s，放入PCR仪。

Ø  从中间向两边盖，以防止不匹配或无法盖牢

Ø  注意盖子和管子的品牌是否一致，否则可能盖不紧或长度不对

b)     PCR程序及优化：

                 i.          93-95℃预变性2-5min （温度和时间应根据订购的酶/PCR mix特性，参考说明书设定）

               ii.          93-95℃变性15-30s，50-72℃退火30s，68-72℃延伸45s，循环30-35次

              iii.          68-72℃延伸2-10min （温度和时间应根据订购的酶/PCR mix特性，参考说明书设定）

              iv.          20℃维持（及时取出，勿长时间放置，否则会损耗PCR仪寿命）

               v.          注意事项：

Ø  不同公司的酶对变性温度及时间、延伸温度及时间的要求不同，请按说明书操作！

Ø  退火温度（Ta）可根据引物Tm进行调整(一般Ta≤Tm-5)

Ø  延伸时间根据产物长度进行调整

Ø  出现杂带可适当升高Ta，必要时进行梯度PCR测试最佳Ta

c)      PCR产物可在4℃保存数天-数周。

4.      电泳与成像

a)      凝胶制备：

                 i.          称量适量琼脂糖，加入1×TAE电泳缓冲液（注意不是PBS！），摇晃混合

Ø  若需分辨1kb以上的PCR产物，可用<1%的琼脂糖

Ø  300bp-1kb PCR产物，可用1%-1.5%琼脂糖（1g-1.5g琼脂糖/100mlTAE）

Ø  若需分辨200bp左右PCR产物（例如分离210bp与250bp），需用1.5-2%琼脂糖

               ii.          微波加热直至溶液清澈透明无悬浮物。

Ø  注意：每加热15s-30s拿出摇晃，防止溶液过热发生喷溅。

Ø  若使用核酸染料，全融后需等待~5min、没有明显蒸气后再加入染料，以防染料挥发；每100ml加入0.5μl染料，摇晃混匀后使用。

              iii.          适当冷却后倒入胶槽，插入梳子（避免梳子被烫弯）

Ø  注意：一般中型琼脂糖可插3排梳子

              iv.          待完全凝固（变白）后方可拔掉梳子；若急用可放入4℃冷柜加速降温。

               v.          不立刻使用的凝胶可用保鲜膜包裹，在4度保存1周-1月。

b)     电泳

                 i.          检测电泳仪中的电泳缓冲液是否干净、液面高度是否足够，决定是否需要更换或添加电泳缓冲液。

               ii.          将凝胶放入电泳仪中，确保缓冲液完全没过胶孔，且孔中无气泡。

              iii.          用专用移液枪在每孔加入8μl完成的PCR体系

Ø  注意：切勿使用配置PCR体系的移液枪加样，防止污染！！！

              iv.          在合适的位置加入5μl marker，每排至少加一孔。

               v.          设置合适的电压与时间，进行电泳。一般使用120V，电泳25min。

              vi.          注意事项：

Ø  负极（黑色）总是接在上样孔一侧；DNA带负电，往正极跑。也要注意检查电源输出端连接是否正确（红色插红色孔、黑色插黑色孔）

Ø  不使用的胶可预先切下，或电泳结束后切下，下次直接使用或重新融化制胶。

c)      成像：

                 i.          若采用EB染色（11楼公共实验室），需将凝胶放入EB溶液（20mg/ml EB，1：100,000稀释）中浸泡30min，然后放入成像系统中观察拍照。

Ø  若泡胶用EB溶液过脏，需重配更换

               ii.          若采用核酸染料进行电泳，在1016房间Biorad成像系统进行观察拍照。

Ø  注意：核酸染料背景较EB高，但对低分子量条带的显色可能比EB敏感

5.      结果分析

a)      图像处理：

                 i.          在Photoshop(PS)中打开图像，菜单栏中选择“图像”à“调整”à“反相”

Ø  反相后条带呈黑色，背景呈白色

Ø  可在菜单栏中选择“图像”à“调整”à“色阶”，调整图像显示，使条带清晰可辨

               ii.          在左侧工具栏中选择剪刀工具，调整图像大小和方向

              iii.          在左侧工具栏中选择文字工具，标注每孔所加样品的名称（调整字体大小、粗细和颜色，保证文字清晰可辨）

              iv.          存储图像

b)     图像打印和粘贴

                 i.          新建word文档，插入标注好的图像，调整至适合粘贴到小鼠记录上的大小

               ii.          打印图像，修剪粘贴

c)      图像分析

                 i.          根据marker的条带判断条带大小

               ii.          对照引物列表，判断条带大小是否符合预期

              iii.          根据条带大小判断小鼠基因型，并及时记录