Induction of Macrophage Phagocytosis of Tumor Cells in vitro   

材料与试剂

1. 96孔板 (Perkin Elmer, catalog number: 6005550)
2. 50 ml离心管
3. 人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞 (CCRF-CEM) (中国科学院细胞库)
4. 胎牛血清 (Invitrogen-Gibco, catalog number: 10099141)
   
5. FITC-anti-human CD14 (Biolegend, catalog number: 367116)
6. anti-CD47抗体 (即Hu5F9)：实验室参考专利 (WO 2011/143624 A2) 表达
7. 阴性对照抗体：实验室自有抗体 (不结合CD47以及其他细胞膜表面蛋白)
8. 1640培养基 (Invitrogen-Gibco, catalog number: C11875500BT)
9. 抗生素 (HyClone, catalog number: SV30010)
10. Human PBMC (妙顺 (上海) 生物科技有限公司)
11. M-CSF (义翘神州，catalog number: 11792-HNAH)
12. Cell trace (Invitrogen-Gibco, catalog number: C34557)
13. PBS (上海培源，catalog number: B320KJ)
14. 1640完全培养基 (见溶液配方)
15. Staining buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 细胞培养箱 (Thermo, model: 371)
2. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
3. 移液器 (Eppendorf)
4. 光学显微镜 (Olympus, model: CKX41)
5. 细胞计数仪 (Nexcelom, catalog number: Mini-005-0289)
6. 高通量成像设备 (Perkin Elmer, model: Opera)
   

实验步骤

1. 巨噬细胞分化 (Wang et al., 2020)：用含50 ng/ml M-CSF的1640完全培养基稀释Human PBMC，制成细胞浓度为6 × 10⁵ cells/ml的细胞悬液，铺至96孔板，每孔100 μl，分化72 h。轻轻吸走上清，注意不要吸干，每孔留约30 μl，再补充100 μl新鲜的含50 ng/ml M-CSF的1640完全培养基继续分化72 h。观察细胞已贴壁伸展，如长出较长的伪足，则细胞已分化成功。
2. 肿瘤细胞染色 (Gardner et al., 2020)：用离心机400 × g，4 min，收集肿瘤细胞CCRF；用PBS重悬清洗一遍；再用PBS将细胞稀释成10⁶ cells/ml；1:1000加入Cell trace，混匀，在37 °C细胞培养箱中避光染色20 min；加入约10倍体积1640完全培养基混匀，37 °C放置5 min以终止反应；离心收集细胞，用培养基制成6 × 10⁵ cells/ml 细胞悬液。
3. 配制anti-CD47抗体：用1640完全培养基配制anti-CD47抗体和阴性对照抗体，抗体以10倍的浓度梯度配制4个梯度，每个梯度做3个重复，分别配制20，2，0.2，0.02 μg/ml抗体各200 μl。
4. 准备巨噬细胞：步骤1中分化好的巨噬细胞用培养基清洗2-3次。清洗过程中，用排枪吸取200 μl培养基，沿孔壁一侧轻轻加入，再沿另一侧缓缓吸出。在显微镜下观察，直至圆形未分化好的细胞被清洗干净。
   
5. 在抗体刺激下孵育巨噬细胞和肿瘤细胞：将步骤3中配置好的抗体沿孔板壁缓缓加入到巨噬细胞中，每孔50 μl；再将步骤2中准备好的肿瘤细胞沿孔板壁慢慢加入到巨噬细胞和抗体的混合物中，每孔50 μl，使抗体终浓度为10，1，0.1，0.01 μg/ml (肿瘤细胞加入孔板前需混合均匀，加入孔板后切勿摇晃震荡孔板，防止肿瘤细胞聚集)；在细胞培养箱中37 °C避光孵育3 h。
6. 配置抗巨噬细胞抗体：用staining buffer 1:1000稀释FITC-anti-human CD14。
7. 巨噬细胞染色：步骤5中孵育满3 h后，用培养基清洗未被巨噬细胞吞噬的肿瘤细胞，方法如步骤4。将步骤6中准备好的抗体加入到清洗过的细胞中，每孔50 μl，37 °C避光孵育30 min。
8. 如步骤4，清洗细胞两遍，最后每孔加入50 μl 1640培养基，准备高通量拍照。
9. 高通量拍照：采用Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统拍摄孔内细胞，每孔拍摄6-8个视野。设置主要拍摄参数，包括：荧光通道 (绿色荧光通道488 nm，蓝色荧光通道365 nm)，聚焦高度，曝光时间等。
10. 图像分析：首先根据绿色荧光通道 (488 nm) 定位巨噬细胞，并统计巨噬细胞总个数；根据蓝色荧光通道 (365 nm) 计算被巨噬细胞吞噬的肿瘤细胞的个数，并统计发生肿瘤细胞吞噬的阳性巨噬细胞数目；计算发生吞噬的巨噬细胞占总巨噬细胞的比例。具体分析流程见表1及图1。
    
    表1. 利用Columbus图像分析服务器进行图像分析的流程
    
    
    
    图1. 图像分析流程 A. 图像分析步骤及软件圈选情况；B. 图像分析过程关键步骤的圈选情况。
    
    

结果与分析

1. 图像观察：如图2，绿色为FITC标记的巨噬细胞，蓝色是Cell trace标记的肿瘤细胞，图中10 μg/ml组和1 μg/ml组可明显看到绿色荧光包裹蓝色细胞的是巨噬细胞吞噬肿瘤细胞后的现象，说明该CD47抗体在这两个浓度下能有效诱导巨噬细胞的吞噬作用。阴性对照抗体组，大部分未被吞噬的肿瘤细胞都被清洗掉了，少量残留的细胞独立于巨噬细胞存在，说明对照抗体是不能诱导巨噬细胞吞噬作用的。
   
   
   图2. 巨噬细胞吞噬肿瘤细胞图像
   
   
2. 统计结果分析：如图3，统计参与吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞占总巨噬细胞的比例。
   
   
   图3. 巨噬细胞吞噬肿瘤细胞效率统计
   
   

溶液配方

1. 1640完全培养基：RPMI 1640培养基中加入终浓度为10%的胎牛血清和1%的抗生素。
2. staining buffer：PBS中加入终浓度为2%的胎牛血清。
   

致谢

感谢实验室的同学对本实验的方法的帮助和改正。感谢东曜药业有限公司提供资助。感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学平台的老师对数据分析的指导。

参考文献

1. Gardner, M., Turner, J. E., Youssef, O. A. and Cheshier, S. (2020). In vitro macrophage-mediated phagocytosis assay of brain tumors. Cureus 12(10): e10964.
2. Wang, H., Sun, Y., Zhou, X., Chen, C., Jiao, L., Li, W., Gou, S., Li, Y., Du, J., Chen, G., Zhai, W., Wu, Y., Qi, Y. and Gao, Y. (2020). CD47/SIRPalpha blocking peptide identification and synergistic effect with irradiation for cancer immunotherapy. J Immunother Cancer 8(2): e000905.