Navigate this Article


 

Mitochondrial ROS (Reactive Oxygen Species) Assay   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

摘要:ROS (reactive oxygen species) 是生物有氧代谢过程中的副产物,在细胞内产生的活性氧90%来源于线粒体。在线粒体氧化磷酸化过程中,活性氧的产生主要发生在线粒体内膜的电子传递链上。ROS对生理功能的维持起着重要作用,但是当受到外界压力的情况下 (化合物处理,辐射,病理状态) 线粒体活性氧的水平会明显增加,从而引起各种线粒体功能损伤,造成线粒体稳态失衡,严重影响细胞的正常运作。本实验是在神经干细胞上,通过化合物鱼藤酮 (线粒体呼吸链抑制剂) 干预,造成线粒体功能的损伤,然后利用高内涵仪器检测线粒体中产生的活性氧 (MitoROS) 水平。

关键词: ROS, 线粒体, 活性氧, 高内涵

材料与试剂

  1. 96 孔黑边底透板 (costar, catalog number: 3904)
  2. HBSS (Gibco, catalog number: 2185781)
  3. MitoSOX Red mitochondrial superoxide indicator (Invitrogen, catalog number: M36008) 
  4. Poly-D-lysine (Sigma, catalog number: 049M4056V)
  5. Laminin (Sigma, catalog number: SLBP0800V)
  6. Rotenone (Selleck, catalog number: S2348)
  7. Hoechst 33342 (Beyotime, catalog number: C1022)
  8. PBS (见溶液配方)

实验步骤

  1. 铺板 (day1):将人的iPSC来源的神经干细胞贴壁培养在50% Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12, Gibco), 50% Neurobasal (Gibco),1x N2 supplement (Gibco),1x B27 supplement (minus vitamin A, Gibco),1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 1x GlutaMAX (Gibco), 10 ng/ml FGF-Basic [AA 1-155] recombinant human protein (bFGF, Gibco), 10 ng/ml LIF recombinant human protein (hlif, Gibco), 3 μМ CHIR99021 (Selleckchem), 5 μМ SB431542 (Selleckchem) 和200 μМ Ascorbic acid (Sigma) 培养体系中(Lu et al., 2019),在铺板前开始消化,1,000 × g离心5 min,加入培液重悬,铺在预先用PDL和laminin包被过的96 well板子,密度维持在30%-40%左右 (10,000个细胞左右)。放在37度培养箱中24 h。
    注:板子包被。首先每孔用100 µl (0.1 µg/µl) PDL在37度培养箱中处理30 min,接着用ddH2O或者PBS清洗两次,最后用100 μl laminin (细胞培液1:200稀释) 在37度培养箱中处理2 h,待用。
  2. 处理 (day2):显微镜下观察细胞贴壁生长状况,然后进行化合物处理。用真空泵将培液吸走,然后加入新鲜培液配制的Rotenone (10 μM) 以及对照组处理。37度培养2小时。
  3. 染色检测 (day2):将MitoSOX染料和Hoechst配在HBSS中,制备成染料(2.5 μМ)和Hoechst(3 μg/ml)的染色液待用。将孔内培养液吸走,缓慢加入染色液50 μl,37度孵育10 min,然后用PBS清洗两遍 (注意缓慢,不要把细胞洗掉),最后加入100 μl HBSS,进行高内涵成像检测。高内涵拍照:MitoSOX (510/580);Hoechst (350/461)。

结果与分析

  1. Rotenone (鱼藤酮),作为线粒体呼吸链的抑制剂,能显著破坏电子传递链系统,影响ATP的产生,造成大量活性氧的产生。图1中与对照组相比,Rotenone处理组的荧光强度显著升高,说明Rotenone显著提高线粒体活性氧 (MitoSOX) 的水平。


    图1. Rotenone处理后,MitoSOX荧光染色代表性图。

  2. 图像定量分析方法
    为定量分析Rotenone对线粒体活性氧水平的影响,我们使用Operetta高内涵成像分析系统的配套软件Harmony进行图像分析,分析方法如图2。
    首先,利用Hoechst 33342染色定位细胞核。由于核染色的荧光强度一般较强,且不易受实验刺激条件的影响,软件识别相对容易,因此在图像分析的第一步往往是通过核染色圈选细胞核 (图2,step1);然后,基于核的定位,软件根据MitoSOX通道定位细胞边界 (图2,step2),通过调整“Individual Threshold”调整细胞圈选区域的大小与肉眼判断的细胞边界相符合;计算MitoSOX荧光强度 (图2,step3),由于线粒体位于细胞质中,所以“Region”设置为“Cytoplasm”;最后,输出数据分析需要的所有参数 (图2,step4),在此分析过程中,我们输出的参数包括细胞数(Number of Objects) 及细胞质区域MitoSOX染色的平均荧光强度 (MitoSOX Intensity Cytoplasm_Mean)和 (MitoSOX Intensity Cytoplasm_Sum)。
    分析方法设置结束后,软件会自动给出多孔板内各孔的定量分析结果。从图3可以看出,与对照组相比,Rotenone处理组的MitoSOX荧光强度有了明显的提高。


    图2. 利用Harmony定量分析细胞内MitoSOX染色的荧光强度。

  3. 结果与分析
    进行统计分析时要注意几个方面。1)当处理组对细胞的形态没有明显改变时,通过两种分析方法 (Mean_Mean和Sum_Mean) 得到的统计结果是没有明显差异的。此时Mean_Mean分析方法的孔间误差小,更偏向于选择此种方法。2)当处理组明显改变了细胞的形态时,此时要注意对比两种方法分析结果,Sum_Mean更适用此种情况的分析。3)因此,在进行结果统计时,要注意比较两种分析方法,选择更为合适的方法。
    Rotenone作用于细胞时,细胞的形态发生了明显改变,图3是通过Mean_Mean分析方法得到的统计结果,Rotenone处理组的平均荧光强度是对照组的1.71倍。图4是通过Sum_Mean分析方法得到的统计结果,Rotenone处理组的平均荧光强度是对照组的2.01倍。


    图3. 利用Mean_Mean分析方法得到的统计结果。


    图4. 利用Sum_Mean分析方法得到的统计结果。

溶液配方

PBS配方(10x)
KCl 2 g
NaCl 80 g
KH2PO4 2.4 g
Na2HPO4 11.45 g
定容至1 L

致谢

首先感谢赵宏伟老师在我接触这个实验对我进行的指导,以及在统计结果分析时对我的帮助。同时也感谢韩帅老师在我写这篇实验方法时对我的指导和帮助。

参考文献

  1. Lu, J., Li, Y., Mollinari, C., Garaci, E., Merlo, D. and Pei, G. (2019). Amyloid-beta Oligomers-induced Mitochondrial DNA Repair Impairment Contributes to Altered Human Neural Stem Cell Differentiation. Curr Alzheimer Res 16(10): 934-949.
Please login or register for free to view full text
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李义, 赵宏伟, 韩帅, 裴钢. (2021). 利用高内涵检测线粒体活性氧实验. Bio-101: e1010862. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010862.
How to cite: Li, Y., Zhao, H. W., Han, S. and Pei, G. (2021). Mitochondrial ROS (Reactive Oxygen Species) Assay. Bio-101: e1010862. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010862.
Q&A
By submitting a question/comment you agree to abide by our Terms of Service. If you find something abusive or that does not comply with our terms please contact us at eb@bio-protocol.org.

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.

We use cookies on this site to enhance your user experience. By using our website, you are agreeing to allow the storage of cookies on your computer.