Mitochondrial ROS (Reactive Oxygen Species) Assay   

材料与试剂

1. 96 孔黑边底透板 (costar, catalog number: 3904)
2. HBSS (Gibco, catalog number: 2185781)
3. MitoSOX Red mitochondrial superoxide indicator (Invitrogen, catalog number: M36008) 
4. Poly-D-lysine (Sigma, catalog number: 049M4056V)
5. Laminin (Sigma, catalog number: SLBP0800V)
6. Rotenone (Selleck, catalog number: S2348)
7. Hoechst 33342 (Beyotime, catalog number: C1022)
8. PBS (见溶液配方)
   

实验步骤

1. 铺板 (day1)：将人的iPSC来源的神经干细胞贴壁培养在50% Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12, Gibco), 50% Neurobasal (Gibco)，1x N2 supplement (Gibco)，1x B27 supplement (minus vitamin A, Gibco)，1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 1x GlutaMAX (Gibco), 10 ng/ml FGF-Basic [AA 1-155] recombinant human protein (bFGF, Gibco), 10 ng/ml LIF recombinant human protein (hlif, Gibco), 3 μМ CHIR99021 (Selleckchem), 5 μМ SB431542 (Selleckchem) 和200 μМ Ascorbic acid (Sigma) 培养体系中(Lu et al., 2019)，在铺板前开始消化，1,000 × g离心5 min，加入培液重悬，铺在预先用PDL和laminin包被过的96 well板子，密度维持在30%-40%左右 (10,000个细胞左右)。放在37度培养箱中24 h。
   注：板子包被。首先每孔用100 µl (0.1 µg/µl) PDL在37度培养箱中处理30 min，接着用ddH2O或者PBS清洗两次，最后用100 μl laminin (细胞培液1:200稀释) 在37度培养箱中处理2 h，待用。
2. 处理 (day2)：显微镜下观察细胞贴壁生长状况，然后进行化合物处理。用真空泵将培液吸走，然后加入新鲜培液配制的Rotenone (10 μM) 以及对照组处理。37度培养2小时。
3. 染色检测 (day2)：将MitoSOX染料和Hoechst配在HBSS中，制备成染料（2.5 μМ）和Hoechst（3 μg/ml）的染色液待用。将孔内培养液吸走，缓慢加入染色液50 μl，37度孵育10 min，然后用PBS清洗两遍 (注意缓慢，不要把细胞洗掉)，最后加入100 μl HBSS，进行高内涵成像检测。高内涵拍照：MitoSOX (510/580)；Hoechst (350/461)。
   

结果与分析

1. Rotenone (鱼藤酮)，作为线粒体呼吸链的抑制剂，能显著破坏电子传递链系统，影响ATP的产生，造成大量活性氧的产生。图1中与对照组相比，Rotenone处理组的荧光强度显著升高，说明Rotenone显著提高线粒体活性氧 (MitoSOX) 的水平。
   
   
   图1. Rotenone处理后，MitoSOX荧光染色代表性图。
   
   
2. 图像定量分析方法
   为定量分析Rotenone对线粒体活性氧水平的影响，我们使用Operetta高内涵成像分析系统的配套软件Harmony进行图像分析，分析方法如图2。
   首先，利用Hoechst 33342染色定位细胞核。由于核染色的荧光强度一般较强，且不易受实验刺激条件的影响，软件识别相对容易，因此在图像分析的第一步往往是通过核染色圈选细胞核 (图2，step1)；然后，基于核的定位，软件根据MitoSOX通道定位细胞边界 (图2，step2)，通过调整“Individual Threshold”调整细胞圈选区域的大小与肉眼判断的细胞边界相符合；计算MitoSOX荧光强度 (图2，step3)，由于线粒体位于细胞质中，所以“Region”设置为“Cytoplasm”；最后，输出数据分析需要的所有参数 (图2，step4)，在此分析过程中，我们输出的参数包括细胞数(Number of Objects) 及细胞质区域MitoSOX染色的平均荧光强度 (MitoSOX Intensity Cytoplasm_Mean)和 (MitoSOX Intensity Cytoplasm_Sum)。
   分析方法设置结束后，软件会自动给出多孔板内各孔的定量分析结果。从图3可以看出，与对照组相比，Rotenone处理组的MitoSOX荧光强度有了明显的提高。
   
   
   图2. 利用Harmony定量分析细胞内MitoSOX染色的荧光强度。
   
   
3. 结果与分析
   进行统计分析时要注意几个方面。1)当处理组对细胞的形态没有明显改变时，通过两种分析方法 (Mean_Mean和Sum_Mean) 得到的统计结果是没有明显差异的。此时Mean_Mean分析方法的孔间误差小，更偏向于选择此种方法。2)当处理组明显改变了细胞的形态时，此时要注意对比两种方法分析结果，Sum_Mean更适用此种情况的分析。3)因此，在进行结果统计时，要注意比较两种分析方法，选择更为合适的方法。
   Rotenone作用于细胞时，细胞的形态发生了明显改变，图3是通过Mean_Mean分析方法得到的统计结果，Rotenone处理组的平均荧光强度是对照组的1.71倍。图4是通过Sum_Mean分析方法得到的统计结果，Rotenone处理组的平均荧光强度是对照组的2.01倍。
   
   
   图3. 利用Mean_Mean分析方法得到的统计结果。
   
   
   图4. 利用Sum_Mean分析方法得到的统计结果。
   
   

溶液配方

PBS配方（10x）
KCl 2 g
NaCl 80 g
KH₂PO₄ 2.4 g
Na₂HPO₄ 11.45 g
定容至1 L

致谢

首先感谢赵宏伟老师在我接触这个实验对我进行的指导，以及在统计结果分析时对我的帮助。同时也感谢韩帅老师在我写这篇实验方法时对我的指导和帮助。

参考文献

1. Lu, J., Li, Y., Mollinari, C., Garaci, E., Merlo, D. and Pei, G. (2019). Amyloid-beta Oligomers-induced Mitochondrial DNA Repair Impairment Contributes to Altered Human Neural Stem Cell Differentiation. Curr Alzheimer Res 16(10): 934-949.