摘要:细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以分裂的方式进行增殖。研究细胞增殖,对于理解细胞发育和分化,探索肿瘤发生和治疗,以及评估细胞健康状况和药物安全性评价等都具有重要意义。在检测细胞增殖的多种方法中,直接测定DNA合成是一种敏感并高精度的分析方法。5-溴-脱氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine,BrdU),是一种胸腺嘧啶核苷的类似物。当细胞处于细胞周期中的DNA合成期 (S期) 时,BrdU可以掺入到新合成的DNA中。利用抗BrdU的单克隆抗体荧光染色,就可通过流式细胞术检测BrdU的含量,从而定量细胞群体的增殖情况 (Davies和Allen, 2007)。另外,结合核酸染料测定单个细胞的DNA含量,还可以定性特定细胞在细胞周期中的具体进程。该实验方案中,运用脱氧核糖核酸酶DNase I消化解开DNA双链,使抗体与DNA链上的BrdU得以接近和结合。与传统的醇固定和强酸变性处理的方法相比,该方案更温和,可同时对细胞表面及胞内的其他标记物进行多色流式分析。
关键词: 细胞增殖检测, 细胞周期, 5-溴-脱氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine,BrdU), 脱氧核糖核酸酶DNase I, 流式细胞术
材料与试剂
仪器设备
软件
实验步骤
结果与分析
流式细胞仪上采集的数据导出后,运用FlowJo软件分析,具体流程及结果如图1所示。 图1. BrdU法检测HeLa细胞的细胞增殖. (A-C) 为没有BrdU掺入的对照组;(D-F) 为10 μM BrdU孵育60分钟后收集的细胞。(A和D) 通过前、侧向散射光信号FSC和SSC散点图,排除细胞碎片,圈出主群细胞。(B和E) 通过DNA染料7-AAD的荧光脉冲信号的宽度W和面积A,进一步排除样本中的粘连体,圈出单细胞群体。(C和F) 使用BrdU (对数显示) 和7-AAD (线性显示) 的散点图显示细胞周期分布,实验组 (F) 呈现典型的马蹄形分布。通过对照 (C) 确定BrdU阳性信号的位置,可以在 (F) 上清楚的区分出G0/G1期、G2/M期和S期,S期比例体现细胞增殖的状态,不同细胞周期的细胞分群明显。
溶液配方
致谢
感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然科学基金 (31401157–丁宇波) 的支持。本方法参考改编自2006年发表在Cytometry Part A的Evaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry (Rothaeusler和Baumgarth,2006)。
参考文献
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