Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

细胞增殖的流式检测（BrdU法）

BrdU Assay for Cell Proliferation Analysis by Flow Cytometry

丁 丁宇波
王 王雪冬
边 边玮

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010330 浏览次数: 12934

返回专辑目录

流式细胞术实验手册
pdf PDF PDF
ask 提问与回复
引用
收藏
被引用
摘要：细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。研究细胞增殖，对于理解细胞发育和分化，探索肿瘤发生和治疗，以及评估细胞健康状况和药物安全性评价等都具有重要意义。在检测细胞增殖的多种方法中，直接测定DNA合成是一种敏感并高精度的分析方法。5-溴-脱氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine，BrdU)，是一种胸腺嘧啶核苷的类似物。当细胞处于细胞周期中的DNA合成期 (S期) 时，BrdU可以掺入到新合成的DNA中。利用抗BrdU的单克隆抗体荧光染色，就可通过流式细胞术检测BrdU的含量，从而定量细胞群体的增殖情况 (Davies和Allen, 2007)。另外，结合核酸染料测定单个细胞的DNA含量，还可以定性特定细胞在细胞周期中的具体进程。该实验方案中，运用脱氧核糖核酸酶DNase I消化解开DNA双链，使抗体与DNA链上的BrdU得以接近和结合。与传统的醇固定和强酸变性处理的方法相比，该方案更温和，可同时对细胞表面及胞内的其他标记物进行多色流式分析。

Keywords: 细胞增殖检测 search 细胞周期 search 5-溴-脱氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine，BrdU) search 脱氧核糖核酸酶DNase I search 流式细胞术 search

材料与试剂

  1.  15 ml离心管 (BD Falcon, catalog number: 352097)
  2. 12 × 75 mm的5 ml聚苯乙烯流式管 (BD Falcon, catalog number: 352008)
  3. 200目过滤尼龙网
  4.  0.22 μm滤器 (Pall, catalog number: 4612)
  5.  HeLa细胞
  6. 脱氧核糖核酸酶DNase I (Promega, catalog number: M6101)
  7. 胎牛血清FBS (杭州四季青)
  8. 小鼠抗BrdU单克隆抗体，克隆号Bu20a (Cell Signaling Technology, catalog number: 5292)
  9.  Alexa FluorTM488标记的山羊抗小鼠IgG二抗 (Invitrogen, catalog number: A11001)
  10. 核糖核酸酶(RNase) (Roche, catalog number: 11119915001)
  11. 5-溴-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Roche, catalog number: 10280879001)
  12. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Sigma-Aldrich, catalog number: D8417)
  13. 7-氨基放线菌素 (7-AAD) (BD Pharmingen, catalog number: 559925)
  14. 皂甙Saponin (Sigma-Aldrich, catalog number: 47036)
  15. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)
  16. NaCl
  17.  KCl
  18. Na2HPO4
  19. KH2PO4
  20.  多聚甲醛 (PFA) (Sigma-Aldrich, catalog number: 76240)
  21. 1× PBS磷酸盐缓冲液 (见溶液配方)
  22.  BrdU溶液 (见溶液配方)
  23. 10% PFA储液 (见溶液配方)
  24. 10% Saponin储液 (见溶液配方)
  25.  固定/通透液4% PFA/1% Saponin (见溶液配方)
  26. 通透液1% Saponin (见溶液配方)
  27.  染色缓冲液3% FBS/0.5% Saponin (见溶液配方)
  28. PI染色液 (见溶液配方)
  29. 7-AAD染色液 (见溶液配方)
  30.  DAPI染色液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. -80 °C冰箱 (Thermo, model: 905)
  2. 二氧化碳培养箱 (Heraeus, model: HERAcell 150)
  3. 旋涡混匀器 (Scientific Industries, model: Vortex-Genie 2)
  4. 水浴锅 (精宏, model: DK-80)
  5. 恒温磁力搅拌器 (虹浦, model: 85-2型)
  6. 电子天平 (METTLER-TOLEDO, model: PB602-S)
  7. pH计 (METTLER-TOLEDO, model: FE-20)
  8. 台式冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5810R，配A-4-62水平转子)
  9. 流式细胞分析仪 (BD LSRFortessa，配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器)

软件

  1. FlowJo软件

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：丁宇波, 王雪冬, 边玮. (2019). 细胞增殖的流式检测（BrdU法）. Bio-101: e1010330. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010330.
ris ris 下载引用格式
How to cite: Ding, Y. B., Wang, X. D. and Bian, W. (2019). BrdU Assay for Cell Proliferation Analysis by Flow Cytometry. Bio-101: e1010330. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010330.
ris ris Download Citation in RIS Format

分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

细胞生物学 > 细胞成像 > 固定细胞成像

您对这篇实验方法有问题吗？

在此处发布您的问题，我们将邀请本文作者来回答。同时，我们会将您的问题发布到Bio-protocol Exchange，以便寻求社区成员的帮助。

post 发布问题
0 Q&A