BrdU Assay for Cell Proliferation Analysis by Flow Cytometry   

材料与试剂

1.  15 ml离心管 (BD Falcon, catalog number: 352097)
2. 12 × 75 mm的5 ml聚苯乙烯流式管 (BD Falcon, catalog number: 352008)
3. 200目过滤尼龙网
4.  0.22 μm滤器 (Pall, catalog number: 4612)
5.  HeLa细胞
6. 脱氧核糖核酸酶DNase I (Promega, catalog number: M6101)
7. 胎牛血清FBS (杭州四季青)
8. 小鼠抗BrdU单克隆抗体，克隆号Bu20a (Cell Signaling Technology, catalog number: 5292)
9.  Alexa FluorTM488标记的山羊抗小鼠IgG二抗 (Invitrogen, catalog number: A11001)
10. 核糖核酸酶(RNase) (Roche, catalog number: 11119915001)
11. 5-溴-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Roche, catalog number: 10280879001)
12. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Sigma-Aldrich, catalog number: D8417)
13. 7-氨基放线菌素 (7-AAD) (BD Pharmingen, catalog number: 559925)
14. 皂甙Saponin (Sigma-Aldrich, catalog number: 47036)
15. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)
16. NaCl
17.  KCl
18. Na₂HPO₄
19. KH₂PO₄
20.  多聚甲醛 (PFA) (Sigma-Aldrich, catalog number: 76240)
21. 1× PBS磷酸盐缓冲液 (见溶液配方)
22.  BrdU溶液 (见溶液配方)
23. 10% PFA储液 (见溶液配方)
24. 10% Saponin储液 (见溶液配方)
25.  固定/通透液4% PFA/1% Saponin (见溶液配方)
26. 通透液1% Saponin (见溶液配方)
27.  染色缓冲液3% FBS/0.5% Saponin (见溶液配方)
28. PI染色液 (见溶液配方)
29. 7-AAD染色液 (见溶液配方)
30.  DAPI染色液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. -80 °C冰箱 (Thermo, model: 905)
2. 二氧化碳培养箱 (Heraeus, model: HERAcell 150)
3. 旋涡混匀器 (Scientific Industries, model: Vortex-Genie 2)
4. 水浴锅 (精宏, model: DK-80)
5. 恒温磁力搅拌器 (虹浦, model: 85-2型)
6. 电子天平 (METTLER-TOLEDO, model: PB602-S)
7. pH计 (METTLER-TOLEDO, model: FE-20)
8. 台式冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5810R，配A-4-62水平转子)
9. 流式细胞分析仪 (BD LSRFortessa，配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器)
   

软件

1. FlowJo软件

实验步骤

1. BrdU掺入
   处于对数生长期的HeLa细胞，培养液中加入终浓度10 μM的BrdU，5% CO2培养箱中继续在37 °C下避光培养60分钟。同时，培养一份未加入BrdU的细胞，此后的实验处理与掺入组保持一致，作为实验对照用于流式分析时确定BrdU的阳性圈门位置。
   注：根据细胞和实验目的不同，具体的孵育时间可为30分钟至48小时。在不同时间点短时间掺入 (一般为30分钟到2小时)，可以分析细胞周期。长时间如24小时以上持续的BrdU掺入可以用于确定和分析处于DNA合成活跃状态的细胞，将其与静止期细胞区分开来，从而进行增殖细胞比例的分析。针对具体的细胞类型和状态，BrdU的掺入浓度和培育时间需进行预实验测试确定。实验中，我们对生长旺盛状态的HeLa细胞加10 μM BrdU处理一小时，掺入效果显著。
2. 终止掺入，收集细胞
   
   2.1

   吸净含有BrdU的培养液，PBS清洗细胞两次，用0.05%胰酶消化细胞，得到的单细胞悬液收集至15 ml离心管中，细胞计数确定细胞数量。
   2.2

   4 °C，300 × g离心5分钟，弃上清。
   2.3

   用1× PBS重悬细胞，依据细胞数量调整重悬体积，使细胞浓度控制在约2 × 10⁷细胞/ml。
   2.4

   分装细胞，每个15 ml离心管中装50 μl细胞悬液作为一个反应体系。可选：如想对细胞表面标记进行染色可在此步进行。
   注：消化时不可过度吹打细胞，注意离心转速，操作中减少细胞碎片的产生。如要做表面蛋白染色，可改用0.5 mM EDTA/PBS，37 °C孵育10分钟，再吹打细胞，以获得单细胞悬液。做好细胞计数，确保不同处理的样品用于流式染色的细胞数保持一致。
   
3. 细胞固定与通透
   
   3.1

   1 ml 1× PBS清洗细胞，4 °C，300 × g离心5分钟，弃上清。
   3.2

   先用旋涡混匀器中速转动，将沉在管底的细胞轻轻重悬弹起，再逐滴加入100 μl固定/通透液，充分混匀后，置冰上避光孵育30分钟。
   3.3

   清洗，加入1 ml染色缓冲液，4 °C，300 × g离心5分钟，弃上清。
   可选：该步骤固定清洗后的细胞，可于4 °C避光保存，72小时内继续后面的染色过程即可。这对实验中需要比较加药处理不同时间点的样品，较为适用。
   注：固定及通透步骤对于胞内染色至关重要，为确保工作溶液的稳定和实验的重复性，推荐实验前新鲜配制，并于4 °C避光保存。
4. 通透
   细胞轻轻重悬弹起，加入100 μl通透液，充分混匀后，室温避光孵育10分钟。
   
5. 清洗
   加入1 ml染色缓冲液，4 °C，300 × g离心5分钟，弃上清。
   
6. 二次固定
   重复第3步固定与通透过程，100 μl固定/通透液，置冰上避光孵育30分钟。同第5步方法，清洗一次。
   
7. 脱氧核糖核酸酶DNase I处理
   细胞轻轻重悬弹起，加入500 μl DNase I反应缓冲液，充分混匀后，加入25 μl DNase I，放入37 °C水浴锅中避光反应45分钟。同第5步方法，清洗两次。
   
8. 一抗标记
   小鼠抗BrdU单克隆抗体1:200稀释于染色缓冲液中。细胞轻轻重悬弹起，加入50 μl一抗反应液，充分混匀后，置冰上避光孵育45分钟。同第5步方法，清洗两次。
   
9. 荧光二抗标记
   Alexa Fluor^TM488标记的山羊抗小鼠IgG二抗1:500稀释于染色缓冲液中。细胞轻轻重悬弹起，加入50 μl二抗反应液，充分混匀后，置冰上避光孵育20分钟。同第5步方法，清洗两次。
   
10. 核酸染料染色，检测单个细胞的DNA含量
    细胞轻轻重悬弹起，再加入100 μl染色液，充分混匀后，室温避光孵育30分钟。加入0.5 ml染色缓冲液，无需清洗，样品经200目尼龙网过滤后转移至流式管，放置冰上，等待上机检测。
    注：常见的DNA染料如PI、7-AAD和DAPI，均可用来与BrdU结合分析细胞周期。这三种染料的最大激发和发射波长分别为PI 538 nm/ 617 nm，7-AAD 545 nm/ 650 nm和DAPI 359 nm/ 461 nm。实验设计中，可根据流式细胞仪的配置和蛋白标记物染色所用的荧光素，灵活选择。
11. 上机，采集流式数据分析样本
    实验中所用的BD LSRFortessa流式细胞分析仪，配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器。根据细胞仪配置，BrdU的信号由Alexa Fluor^TM488荧光信号标记，用488 nm激光器激发，采集530/30波段的信号。PI的信号，用561 nm激光器激发，采集610/20波段。7-AAD的信号，用561 nm激光器激发，采集670/30波段。DAPI的信号，用355 nm激光器激发，采集450/50波段。
    注：为确保分析精度，检测细胞浓度应调整为0.5~2 × 10⁶/ml，进样速度为低速，每秒事件数不大于400，记录总数不小于20,000细胞。分析时通过DNA染料的荧光脉冲信号的宽度和面积，区分样本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞的影响。DNA染料，特别是PI具有较强的粘性，样本上机检测之后，必须仔细清洗流式细胞仪，以免对后续的检测造成影响。

结果与分析

流式细胞仪上采集的数据导出后，运用FlowJo软件分析，具体流程及结果如图1所示。


图1. BrdU法检测HeLa细胞的细胞增殖. (A-C) 为没有BrdU掺入的对照组；(D-F) 为10 μM BrdU孵育60分钟后收集的细胞。(A和D) 通过前、侧向散射光信号FSC和SSC散点图，排除细胞碎片，圈出主群细胞。(B和E) 通过DNA染料7-AAD的荧光脉冲信号的宽度W和面积A，进一步排除样本中的粘连体，圈出单细胞群体。(C和F) 使用BrdU (对数显示) 和7-AAD (线性显示) 的散点图显示细胞周期分布，实验组 (F) 呈现典型的马蹄形分布。通过对照 (C) 确定BrdU阳性信号的位置，可以在 (F) 上清楚的区分出G0/G1期、G2/M期和S期，S期比例体现细胞增殖的状态，不同细胞周期的细胞分群明显。

溶液配方

1. 1× PBS磷酸盐缓冲液
   
   1)

   800 ml蒸馏水中溶解NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄ 1.44 g，KH₂PO₄ 0.24 g
   2)

   调节pH值到7.2~7.4
   3)

   加去离子水定容至1 L
   4)

   0.22 μm滤膜过滤后，室温保存
2. BrdU溶液 
   BrdU溶于1× PBS配成10 mg/ml储液，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装成31 μl/管，保存于-80 °C，避免反复冻融。
   实验前，于冰上解冻，每31 μl加入1 ml 1× PBS稀释成1 mM工作液备用
3. 10% PFA储液 
   
   1)

   预先加热80 ml去离子水，烧杯放于通风橱内的磁力搅拌器上，确认水温低于60 °C
   2)

   称取10 g多聚甲醛加入热水中，缓慢搅拌，滴加约200 μl 10 N NaOH使溶液变为碱性以助溶
   3)

   磁力搅拌器加热使溶液温度维持在50 °C左右，持续搅拌约1小时，溶液澄清，显示PFA充分溶解
   4)

   停止加热，加入10 ml 10× PBS，待溶液冷却至室温，加入盐酸调整pH值至7.2~7.4，加去离子水定容到100 ml
   5)

   分装成4 ml/管，冻存于-20 °C，避免反复冻融
   6)

   使用前，在室温充分融化后备用
4. 10% Saponin储液
   用去离子水配制，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 °C避光保存
   
5. 固定/通透液4% PFA/1% Saponin
   将10% PFA和10% Saponin的储液稀释配制于1× PBS溶液中，实验前新鲜配制，4 °C避光保存
   
6. 通透液1% Saponin
   实验前于1× PBS溶液中新鲜配制，4 °C避光保存
   
7. 染色缓冲液3% FBS/0.5% Saponin
   于1× PBS溶液中配制，0.22 μm滤膜过滤后备用
   
8. PI染色液
   50 μg/ml PI，200 μg/ml RNase于1× PBS溶液中配制
   
9. 7-AAD染色液
   储液为1 mg/ml溶于DMSO，4 °C避光保存
   染色时以1:1,000稀释于1× PBS溶液
10. DAPI染色液
    储液为5 mg/ml溶于去离子水，4 °C避光保存
    染色时以1:1,000稀释于1× PBS溶液

致谢

感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然科学基金 (31401157–丁宇波) 的支持。本方法参考改编自2006年发表在Cytometry Part A的Evaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry (Rothaeusler和Baumgarth，2006)。

参考文献

1. Davies, D. and Allen. P. (2007). Chapter 7: DNA Analysis by Flow Cytometry. In: Flow Cytometry. Principles and Applications. Totowa, New Jersey: Humana Press. ISBN: 978-1-58829-691-7.
2. Rothaeusler, K. and Baumgarth, N. (2006). Evaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry. Cytometry A 69(4): 249-259.