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CTAB法微量提取柑橘基因组DNA   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:利用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵) 作为一种阳离子去污剂,在高离子强度的溶液中与蛋白质和多聚糖形成复合物,而在低离子强度溶液中可以沉淀核酸与酸性多聚糖的特性将DNA从柑橘组织样品中分离出来。
实验目的:快速< /b>提取柑橘基因组DNA用于PCR和分子标记筛选等实验。

关键词: 柑橘, DNA, 微量提取, CTAB

材料与试剂

  1. 离心管 (2 ml圆底、1.5 ml)
  2. 0.5 cm直径钢珠
  3. 各种型号的枪头 (1 ml,200 μl,20 μl)
  4. 棕色瓶
  5. CTAB
  6. β-巯基乙醇
  7. Tris-饱和酚
  8. 氯仿 (三氯甲烷)
  9. 异戍醇
  10. 异丙醇
  11. 浓盐酸
  12. NaOH
  13. 无水乙醇
  14. Tris
  15. EDTA
  16. NaCl
  17. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
  18. 0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
  19. 5.0 M NaCl (见溶液配方)
  20. 氯仿:异戍醇 (24:1) (见溶液配方)
  21. 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) (见溶液配方)
  22. TE缓冲液 (见溶液配方)
  23. CTAB buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 加样枪
  2. 离心管架
  3. 震荡磨样机
  4. 恒温水浴锅 (常州润华电器有限公司)
  5. 各种规格的移液器
  6. 离心机 (配备1.5 ml转头,转速大于10,000 rpm)
  7. 4 °C冰箱
  8. -20 °C冰箱

实验步骤

  1. 取0.1 g左右的柑橘叶片放入装有两颗0.5 cm直径钢珠的2 ml离心管中,盖好离心管盖后连同离心管架一起浸入液氮中速冻1 min,取出后迅速放入震荡磨样机载物台上,170 HZ频率震荡3 min至叶片充分磨碎。
  2. 加入700 μl CTAB提取液,颠倒混匀,然后在65 °C水浴锅中温浴60-90 min,隔15 min取出上下轻轻颠倒几次。
  3. 水浴之后,加入800 μl苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1),上下颠倒混匀10 min以上,然后10,000 x g离心10 min。
  4. 吸取上清液转至另一1.5 ml离心管中,加入60 μl 5 M NaCl,再加入-20 °C冰冻无水乙醇1 ml,轻轻颠倒数次,混合均匀后冰冻30 min以沉淀DNA。
  5. 然后10,000 x g离心5 min,弃上清液,加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜,10,000 x g离心5 min,弃酒精之后在工作台上风干DNA,加入120 μl TE缓冲液溶解DNA。

注意事项

  1. 微量法提取DNA纯度不高,若要提高质量,可适当减少组织样品量 (0.05 g),或者重复苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 抽提步骤。
  2. 风干DNA步骤不宜过干,否则DNA不容易溶解。
  3. 提取过程动作要轻柔,防止DNA分子断裂降解。

溶液配方

  1. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
    称取Tris-Base 121 g,加入约800 ml水在磁力搅拌器上搅拌,使其充分溶解后加入浓盐酸调pH至8.0后加水定溶至1,000 ml,灭菌 (121 °C,15 min) 后于室温保存
  2. 0.5 M EDTA (pH 8.0)
    称取EDTA-Na2盐187 g加入约800 ml水,在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH,当EDTA和NaOH均完全溶解,溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右,再用pH试纸略加调整即可,灭菌 (121 °C,15 min) 后于室温保存
  3. 5.0 M NaCl
    称取NaCl 300 g,加入蒸馏水约800 ml于磁力搅拌器上充分搅拌,约5分钟后停止搅拌,静止2~3分钟,倒出上清液,再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤,直到NaCl充分溶解后定溶至1,000 ml,灭菌 (121 °C,15 min) 后于室温保存
  4. CTAB buffer

    DNA Buffer灭菌后于室温下保存3个月左右,使用时取适量Buffer按2%比例 (每100 ml Buffer加入2 g CTAB) 加入CTAB,65 °C水浴锅中充分溶解;在通风橱里加入1%的巯基乙醇 (现配现用)
  5. 氯仿:异戍醇 (24:1)
    500 ml氯仿中加入21 ml异戊醇,混匀,棕色瓶中常温保存
  6. 酚:氯仿:异戍醇 (25:24:1)
    Tris-饱和酚与氯仿:异戍醇 (24:1) 以1:1的比例等体积混合,棕色瓶中4 °C冰箱保存,使用时取下层
  7. TE缓冲液 (100 ml)

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:徐远涛, 余惠文, 程运江, 徐强, 邓秀新. (2018). CTAB法微量提取柑橘基因组DNA. Bio-101: e1010198. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010198.
How to cite: Xu, Y. T., Yu, H. W., Cheng, Y. J., Xu, Q. and Deng, X. X. (2018). Citrus Genomic DNA Microextraction Using CTAB Method. Bio-101: e1010198. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010198.
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