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水稻组织半薄切片法   

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实验原理:使用树脂包埋样品,切成薄片的样品后能在光学显微镜下成像。
实验目的:将树脂包埋的水稻材料切成1-2 μm的切片。

关键词: 半薄切片, 光学显微镜, 组织学

材料与试剂

  1. 2 ml离心管
  2. 吸管
  3. 注射器
  4. 牙签
  5. 1 ml加样器
  6. 200 μl加样器
  7. 细毛笔
  8. 滤纸
  9. 戊二醛
  10. NaH2PO4·2H2O
  11. Na2HPO4·12H2O
  12. 甲苯胺蓝
  13. 乙酸
  14. 滤纸
  15. 伊红
  16. 无水乙醇 (国药试剂)
  17. Technovit 7100
  18. 硬化剂Ⅰ
  19. 硬化剂Ⅱ
  20. 石蜡
  21. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液 (见溶液配方)
  22. 脱水剂 (见溶液配方)
  23. 固定剂 (见溶液配方)
  24. 渗透液 (见溶液配方)
  25. 包埋剂 (见溶液配方)
  26. 染色液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 烘箱 (温度范围25-100 °C,国产)
  2. 磁力搅拌器 (国产)
  3. 干燥器 (国产)
  4. 玻璃刀制刀机 (Leica KMR3,Germany)
  5. 钻石刀 (超薄级,DiTOME,Switzerland)
  6. 超薄切片机 (Leica UC6,Germany)
  7. 透射电子显微镜 (H-7650,Japan)
  8. 用具:手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、包埋模具、酒精灯、玻璃条

实验步骤

  1. 取样:目的水稻组织切成6 mm3的小块,每份样品至少取20个小块,迅速置于2.5%戊二醛固定液中,抽真空2 h,4 °C或室温固定一周以内。
  2. 梯度脱水:依次更换30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇溶液,每个梯度室温放置10min。
    注:更换100%乙醇时,速度要快!
  3. 树脂渗透:室温下,依次更换3:1、1:1、1:3的无水乙醇与7100包埋剂的混合液,每个梯度作用12 h。再更换纯包埋剂,作用12 h。
  4. 包埋聚合:在包埋磨具中加入0.5 ml左右包埋剂,用干燥牙签将样品挑到包埋孔子并定位到合适的位置,缓缓注入包埋剂至包埋孔满。加入的包埋剂以包埋孔的液面凸起不溢出为准,并将样品拨正。加了硬化剂Ⅱ的包埋剂极易凝固,室温下包埋操作可进行5-7 min。样品在38 °C烘箱中聚合过夜。
  5. 修块:用单面刀片切包埋块,使样品稍稍暴露,并使待切部位呈方形或长方形,最后用单面刀片将样品块的切面切平。
  6. 玻璃刀的制备:玻璃条洗净,晾干。用玻璃制刀机将玻璃条对半切成两条等长的,再对半切,制成边长为25 mm的正方块,然后再将每个正方块按对角线切割,切成2把玻璃刀。玻璃刀现制现用较好。
  7. 粘刀槽:将玻璃刀放在Leica EMMP展片台上预热,同时将塑料刀槽放在展片台的溶蜡区预热,以便沾上少许蜡,然后将刀槽固定在刀背上,并用石蜡密封刀槽底部和左右两边,避免漏水。
  8. 固定样品块和玻璃刀:将样品包埋块固定在超薄切片机的固定器上,将有刀槽的玻璃刀固定在刀台上,调整刀的角度为4度,选择切片上下位置。
  9. 切片:用吸管向水槽内加水,使在刀刃处有薄层液体并形成月形水面。粗进刀,靠近样品,然后选择切片厚度1 μm,切片速度3-5 mm/sec,进行切片。
  10. 捞片、展片、粘片:当刀槽水面上有完整的切片时,用头发丝或细铜丝绕成小圈,固定在手柄上捞片,并将切片转移到滴有蒸馏水的载玻片上,然后将载玻片放到展片台上展开,当载玻片上的水滴被蒸干后切片就被粘在载玻片上。
  11. 染色:在载玻片的切片部位上加入1滴甲苯胺蓝染液,染色2-5 min,用蒸馏水冲去多余的染液,滤纸吸干多余的水分,烘干。
  12. 样品块的保存:固化好的样品块放在干燥器中4 °C保存,以免树脂变性。

溶液配方

  1. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液
    A液:NaH2PO4.2H2O 31.21 g 定容到1,000 ml
    B液:Na2HPO4.12H2O 71.64 g 定容到1,000 ml
    取A液28 ml,B液72 ml配制成0.2 M PBS缓冲液,然后用蒸馏水稀释成0.1 M的工作液
  2. 脱水剂
    30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇
  3. 固定剂
    2.5%戊二醛 (进口品质试剂,0.1 M PBS, pH 7.2配制)
  4. 渗透液
    100 ml Technovit 7100加入1 g硬化剂Ⅰ,玻璃棒搅拌约5 min,至白色颗粒完全溶解
  5. 包埋剂
    按照1 ml硬化剂Ⅱ加入15 ml渗透液的比例配制
  6. 染色液
    1)
    1%甲苯胺蓝
    甲苯胺蓝1 g
    95%乙醇4 ml
    10%乙酸10 ml
    搅拌后用滤纸过滤
    2)
    伊红乙醇溶液
    伊红0.5 g
    95%乙醇100 ml

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:曹剑波, 程珂, 袁猛. (2018). 水稻组织半薄切片法. Bio-101: e1010142. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010142.
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