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水稻常用分子标记(SSR InDel SNP)检测   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:分子标记(Molecular Markers)是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。
       简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR),又称微卫星序列,其串联重复的核心序列为1-6 bp,重复单位数目一般10-60个,其多态性主要来源于串联基序数目的不同。其原理是根据串联重复序列设计引物,通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小确定基因型。
       插入缺失(Insertion-Deletion,InDel),指不同品种(系)在基因组中有小片段的核苷酸序列的插入或缺失,其原理是根据插入缺失位点设计引物,通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小确定基因型。
       核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异。其原理是根据多态性位点设计引物,通过PCR反应扩增出目标片段,利用测序技术来确定核苷酸差异。
实验目的:利用分子标记可以进行品种的基因型分析,真假杂种鉴定,遗传连锁图谱构建,分子标记辅助选择育种,基因定位、克隆,物种亲缘关系鉴别等。

关键词: 水稻, 分子标记, SSR, InDel, SNP

材料与试剂

  1. PCR试剂
    1)
    10x PCR Buffer (Mg2+ Plus) (Takara Bio, catalog number: R10T1)
    2)
    rTaq (TaKara Bio, catalog number: R10T1)
    3)
    dNTPs Mix (Pharmcia分装)
    4)
    ddH2O

  2. 测序试剂
    1)
    EXOI (New England Biolabs, catalog number: M0293L)
    2)
    SAP (Takara Bio, catalog number: D2660A)
    3)
    BigDye (ABI, catalog number: 4336913)
    4)
    5x Buffer (ABI, catalog number: 4336699)
    5)
    甲酰胺(ABI, catalog number: 4311320)
    6)
    上样用指示剂 (10x loading buffer) (见溶液配方)

  3. 琼脂糖胶电泳试剂
    1)
    琼脂糖Agarose (G-10, BIOWEST)
    2)
    核酸染料GoldView (AMRESCO分装)
    3)
    DNA Marker (DL2000 Plus, TransGen, catalog number: BM111)
    4)
    0.5x TBE溶液
    5)
    5x TBE (见溶液配方)

  4. 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)胶电泳试剂
    1)
    丙烯酰胺 (Acrylamatide, Ultra pure, BIO BASIC INC, catalog number: AB1032)
    2)
    甲叉-丙烯酰胺 (Bis-Acrylamatide, Ultra pure, BIO BASIC INC, catalog number: BB0025)
    3)
    过硫酸铵AP (Ammonium persulfate, Sigma-Aldrich, catalog number: A3678)
    4)
    去离子甲酰胺 (deionized formamid,生工生物, catalog number: F0606)
    5)
    NaOH (分析纯,光复)
    6)
    溴酚蓝 (Bromophonel blue, Sigma-Aldrich, catalog number: B0126)
    7)
    二甲苯氰 (Xylene cyanol FF, Sigma-Aldrich, catalog number: X4126)
    8)
    硅化剂 (Plusone Repel-Silane, Amersham. Biosciences, catalog number: 17-1332-01)
    9)
    反硅化剂 (Plusone Bind-silane, Amersham. Biosciences, catalog number: 17-1330-01)
    10)
    TEMED (Sigma-Aldrich, catalog number: T9281)
    11)
    95%乙醇 (分析纯,沪试,国药化试, catalog number: 10009134)
    12)
    硝酸银 (分析纯,国药化试, catalog number: 10018461)
    13)
    甲醛(分析纯,湖北奥生新材料科技有限公司, catalog number: 83012)
    14)
    Tris粉 (Tris Amino,Angus Chemical Company, catalog number: 77-86-1)
    15)
    硼酸(分析纯,国药化试, catalog number: 10004818)
    16)
    EDTA (分析纯,沪试,国药化试, catalog number: 10009717)
    17)
    尿素(分析纯,国药化试, catalog number: 10023218)
    18)
    1x TBE溶液
    19)
    1.40%的丙烯酰胺胶母液 (见溶液配方)
    20)
    过硫酸胺(AP)溶液 (见溶液配方)
    21)
    4% PAGE胺胶液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. PCR仪 (ABI9700)
  2. 电泳仪 (LIFE TECHNOLOGIES, MODEL 250EX)
  3. 水平电泳槽 (北京六一)
  4. 垂直电泳槽 (北京六一)
  5. 通风橱 (SUNLAB,2004-SFH)
  6. 凝胶成像系统
  7. 测序仪 (ABI,3730)

实验步骤

  1. PCR反应
    1.1
    调整模板浓度至~50 ng/μl。
    1.2
    按下列体系配制反应混合液,混匀,加20 μl矿物油,离心5秒。
    Template DNA
    2 μl
    10x PCR buffer
    2.0 μl
    dNTPs Mix (2 mM)
    1.6 μl
    Primer F (10 µM)
    0.3 μl
    Primer R (10 µM)
    0.3 μl
    rTaq (5 U/μl)
    0.1 μl
    Add ddH2O to
    20 μl
    1.3
    PCR反应程序:
    94 °C
    4 min
    1 cycle
    94 °C 30 sec
    55 °C 30 sec
    72 °C 30 sec 35 cycles
    72 °C
    5 min
    1 cycle
    25 °C
    1 min

    注:以上退火温度可以根据不同引物适当调整。
    1.4
    检测:加~2 μl 10x Loading buffer,短暂离心。

  2. 琼脂糖凝胶电泳(适合InDel标记和多态性较大的SSR标记)
    2.1
    将制胶板洗净、晾干,水平放置在工作台上,两端用封条封口,放置梳子,调整好梳子的高度。
    2.2
    称取1.2 g琼脂糖于120 ml 0.5x TBE中,用微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解,取出冷却至50 °C左右时加入5 μl GoldView混匀,倒入制胶板中。
    2.3
    凝胶凝固后(~30 min),小心拔去梳子,取8 μl PCR样品依次点入加样孔中,最后一孔点入5 μl DNA Marker。
    2.4
    将制胶板小心放入电泳槽中,打开电泳仪电源,使核酸样品向正极泳动,250 V电泳20-30 min (根据多态性大小调整)。
    2.5
    电泳完成后,切断电源,取出凝胶,在清水中短暂漂洗,用保鲜膜包好置于凝胶成像系统中观察照相,读取数据。

  3. PAGE胶电泳(适合一般SSR标记和多态性较小的InDel标记)
    3.1
    胶板的制备
    1)
    将玻璃底板和盖板洗净、晾干。
    2)
    在通风橱中用滤纸片沾上95%乙醇擦拭底板和盖板3-5遍至玻璃板洁净无污渍。
    3)
    取1 ml 95%乙醇至1.5 ml离心管,加入2 μl反硅化剂,于涡旋震荡器上混匀,均匀倒在用(步骤3.1.2)中95%乙醇擦拭过的玻璃底板上,并用滤纸涂抹均匀。
    4)
    取1 ml硅化剂均匀倒在用(步骤3.1.2)中95%乙醇擦拭过的玻璃盖板上,用滤纸涂抹均匀。
    5)
    将底板水平放置(涂抹反硅化剂的一面朝上),在两侧放好压条(spacer),将盖板(涂抹硅化剂一面朝下)重合在底板上,两侧各用两个夹子夹紧。
    6)
    配制胶液:取60 ml 4% PAGE胶液至烧杯中加入500 μl AP液和50 μl TEMED,混匀,将夹好的玻璃底板和盖板倾斜45度,往玻璃底板和盖板之间的缝隙灌胶,待胶液充满整个玻璃板,将玻璃板水平放置,水平插入梳子。胶板制备完后需放置至少1个小时才可使用。 

    3.2
    电泳
    在水槽中清洗胶板,小心拔出梳子(注意不要弄破胶面),用水冲去碎胶,垂直放入电泳槽中,两边用3个夹子夹紧,扭紧下部螺丝,加入1x TBE溶液至胶孔覆盖,电泳条件设置;电压:2,000 V,电流:200 mA,功率:90 W,预热40分钟后插入梳子,取3-5 μl PCR产物点样。
    3.3
    显影
    1)
    硝酸银溶液配制:称取2 g硝酸银于试剂瓶中,加入2,000 ml蒸馏水溶解完全,倒入塑料盆中,盖上盖子避光保存。
    2)
    NaOH溶液配制:称取40 g NaOH于试剂瓶中,加入2,000 ml蒸馏水溶解,加入2瓶盖甲醛溶液,混匀倒入塑料盆中,盖上盖子。
    3)
    取下电泳完毕的胶板,分开玻璃底板和盖板,将胶板用蒸馏水漂洗一遍后置入硝酸银溶液中浸泡10分钟,然后取出用蒸馏水漂洗一遍,再放入含甲醛的NaOH溶液中,至带型清晰显出时捞出,用蒸馏水漂洗4-5遍,平放至胶面干燥,进行照相和数据读取。

  4. SNP标记检测
    4.1
    PCR扩增
    参照前面一般PCR扩增。
    4.2
    PCR产物检测
    制备琼脂糖胶(1%),检测PCR扩增产物。特异性扩增带与预期大小相符,亮度(浓度)与Marker (DL 2000,~50 ng/μl)相仿即可。
    4.3
    PCR产物消化处理
    PCR产物
    5 μl

    10x SAP Buffer
    0.3 μl
    ① 37 °C水浴1 h
    25 mM MgCl2
    0.18 μl
    ② 80 °C水浴20 min灭活
    ExoI(20 U/μl)
    0.25 μl
    ③ 1 Kb左右的片段取3 μl作DNA测序模板
    SAP(2 U/μl)
    0.13 μl
    注*:取PCR产物尽量避免取到上层矿物油
    Add ddH2O to
    8 μl

    4.4
    测序反应
    DNA模板
    3 μl
    反应程序:
    Primer(单引物)
    0.16 μl
    96 °C 3 min;
    5x Buffer
    1.75 μl
    96 °C 10 sec, 50 °C 10 sec, 60 °C 4 min,30~35 Cycles;
    BigDye
    0.5 μl
    25 °C 10 min
    Add ddH2O to
    10 μl

    4.5
    测序产物的纯化
    1)
    1 ml 95%乙醇中加入40 μl 3 M NaAC,混匀后按26 μl/孔分装进测序样品,混匀,放置15 min,3,000 x g离心30 min,弃上清。
    2)
    分装75%乙醇,75 μl/孔,3,000 x g离心10 min。
    3)
    弃上清,于超净工作台吹干,约5 min。
    4)
    分装甲酰胺,7 μl/孔,94 °C变性(~5 min),置于冰上冷却。 

    4.6
    上机(ABI3730测序仪)测序
    按测序仪操作说明进行。

注意事项

  1. 制备PAGE胶之前,用梳子插入两玻璃板之间,检查玻璃板之间空隙是否均匀;若梳子两侧不能顺利插入,务必调整盖板和底板组合,以免出现制胶厚度不均匀或者是梳子插不进去的情况。
  2. 使用SSR标记可以先登录网站http://www.gramene.org/查询标记的退火温度和PCR产物大小,选择合适的退火温度和电泳检测条件。
  3. 同一PAGE胶板进行多道电泳时,应根据PCR产物大小和标记在两亲本之间多态性大小,确定点样顺序和时间间隔。如果标记有拖带现象可以在点样之前将PCR产物进行96°C 3 min 变性。
  4. 把握好显影时间,小心PAGE胶从玻璃底板上脱落;显影完毕后,尽量在水中漂洗多次,以去除甲醛。

溶液配方

  1. 1.40%的丙烯酰胺胶母液
    丙烯酰胺(Acrylamatide)
    380克
    甲叉-丙烯酰胺(Bis- Acrylamatide)
    20克
    加60 °C左右的ddH2O定容至1,000 ml,迅速搅拌至澄清透明。过滤后4 °C保存。
  2. 过硫酸胺(AP)溶液
    终浓度10%,用分析天平称取4 g AP粉末,加ddH2O 40 ml,摇匀溶解,4 °C 保存。
    注:不要超过2个星期,最好新鲜配制。
  3. 上样用指示剂(10x loading buffer)
    甲酰胺(deionized formamid)
    500 ml
    4 N NaOH
    1.32 ml
    溴酚蓝(Bromophonel blue)
    263 mg
    二甲苯氰(Xylene cyanol FF)
    263 mg
    ddH2O
    25 ml
    混匀后放在摇床上摇12小时,4 °C保存。
  4. 5x TBE
    Tris粉
    54 g
    硼酸(Boric acid)
    27.5 g
    0.5M EDTA(PH7.9)
    20 ml
    加ddH2O至
    1,000 ml
    搅匀后室温保存,0.5和1x TBE溶液用此分别稀释10倍和5倍后用。
  5. 4% PAGE胺胶液
    配制一板胶

    40%丙烯酰胺胶母液
    11 ml
    5x TBE溶液
    15 ml
    尿素
    36.04 g
    ddH2O
    22 ml
    配制40板胶

    40%的丙烯酰胺胶母液
    440 ml
    5x TBE溶液
    600 ml
    尿素
    1,441.6 g
    ddH2O
    880 ml
    实际配制时每次配制40板用量,搅拌过夜后过滤,滤液4 °C保存。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:孙文强, 申国境, 余四斌. (2018). 水稻常用分子标记(SSR InDel SNP)检测. Bio-101: e1010108. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010108.
How to cite: Sun, W. Q., Shen, G. J. and Yu, S. B. (2018). Detection of Commonly-used Molecular Markers (SSR InDel SNP) in Rice. Bio-101: e1010108. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010108.
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