研究背景

白蚁肠道中存在多种共生微生物，包括细菌、真菌和原生动物，根据白蚁后肠有无原生动物，可将白蚁分为低等白蚁 (有) 和高等白蚁 (无) 两大类 (Lo and Eggleton, 2011; Ni and Tokuda, 2013)。培菌白蚁是一类能够在蚁巢中专一性培养真菌——鸡枞菌 (Termitomyces) 作为食物的高等白蚁 (Aanen et al., 2009)，其肠道没有共生的原生动物，但是在消化系统中存在寄生的簇虫。簇虫是属于顶复亚门孢子纲的一种单细胞原生动物，主要寄生于无脊椎动物的消化道和体腔等器官中 (Rueckert et al., 2019; Dias et al., 2017)。簇虫是研究寄生虫-宿主协同进化和昆虫生物防治的良好材料 (Dias et al., 2017; Lantova et al., 2014)。同时，簇虫被认为是顶复亚门中早期分化的生物，其研究对了解顶复亚门的系统发育具有重要意义 (Rueckert et al., 2019; Leander et al., 2003)。目前为止在白蚁中发现的簇虫，其物种的描述都是基于其形状和大小等形态学特征 (Costa-Leonardo, et al., 2008)，以此方法鉴定出的簇虫种类要远远低于簇虫实际的多样性。随着分子生物学技术的发展，核酸序列分析 (主要是18S rDNA序列分析) 被广泛应用于簇虫分类鉴定中 (Dias et al., 2017; Lantova et al., 2014)。本文提供从培菌白蚁肠道中分离簇虫并进行分子生物学鉴定的方法，此方法也可用于从其它昆虫中分离鉴定簇虫。

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
2. 乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，上海，分析纯)
3. SSU rDNA通用引物：F1 (5'-GCGCTACCTGGTTGATCCTGCC-3')，R1 (5'-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')，引物合成及PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
4. 2x M5 Taq HiFi PCR MIX (聚合美生物科技有限公司，北京)
5. pMD19-T载体 (TaKaRa)
6. 微量样品基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Mico DNA Kit，DP316，天根生化科技有限公司)
7. DNA纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit 200，D2500-02，Omega Bio-Tek公司)
8. 琼脂 (生工生物工程有限公司，catalog number: A505255)
9. 酵母粉 (Oxoid, England, catalog number: LP0021)
10. 胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，上海，catalog number: A505247)
11. 氯化钠 (生工生物工程有限公司，上海，catalog number: A610476)
12. LB培养基 (见溶液配方)
13. PBS 缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 载玻片，解剖针，移液器
2. 超净工作台 (品牌AIRTCH，catalog number: SW-CJ-2FD)
3. 分析天平 (赛多利斯公司，北京，catalog number: ALC-110.4&1100.2)
4. 高压灭菌器 (申安医疗器械厂，上海，catalog number: LDZM-80L)
5. 恒温培养箱 (精宏实验设备公司，上海，catalog number: DNP-9052)
6. 恒温摇床 (知楚仪器公司，上海，catalog number: ZQZY-BF8)
7. PCR 仪 (品牌TaKaRa，catalog number: TP600)
8. 电泳仪 (六一电泳器材厂公司，北京，catalog number: DYY-10C)
9. 恒温金属浴 (博日科技公司，杭州，catalog number: CHB-100)
10. 凝胶成像仪 (品牌UVItec，catalog number: 97-0094-16)
11. 离心机 (品牌Eppendorf，catalog number: Centrifuge 5417)
12. 体式解剖镜 (品牌Olympus，catalog number: SZ2-ILST)
    

软件和数据库

1. 利用真核生物18S rDNA序列进行菌种鉴定的网站
   https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
   
2. MEGA7.0软件 下载地址MEGA7.0.26_win64_setup.exe
   

实验步骤