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一种针对重金属污染土壤的高效DNA提取方法：去腐试剂前处理结合标准试剂盒提取

An Efficient DNA Extraction Method for Soil with Heavy-metal Contaminations: Humus Removal Reagents for Sample Pre-treatment Combined with DNA Standard Kit

郭 郭东毅*
陈 陈泓羽*
李 李方如
占 占迪
董 董海良

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年07月07日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003707 浏览次数: 3501

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：重金属污染矿区环境中的微生物生态研究内容包括鉴别与发现重金属耐受菌属、揭示潜在重金属氧化还原过程、研究重金属污染生物修复策略等，而高效提取污染土壤中的DNA是研究的基础和关键。然而，相比其他土壤生态环境，重金属污染矿区的土壤pH较为极端、重金属浓度高、腐殖质含量高、缺乏碳源氮源等营养物质，因此该类环境中生物量较低且含有大量影响DNA提取的抑制因子，从而导致直接使用商业 DNA 提取试剂盒的提取效率低且 DNA 质量较差。本方法对此进行了改进，利用去腐试剂 (主要成分为EDTA、NaCl等) 对污染矿区土壤样品进行前处理以去除腐殖质与重金属，并加入OptiprepTM细菌分离液通过密度梯度离心对土壤样品中的微生物进行分离，之后使用PowerSoil ® Pro提取试剂盒 (试剂盒A) 的标准方法进行DNA的提取。改进后的方法明显提高了DNA的质量，更利于后续的PCR扩增等实验。

Keywords: 重金属污染 search 矿区土壤 search DNA提取 search

材料与试剂

  1. 1 ml、5 ml枪尖、10 ml移液管
    注：为减小剪切力对核酸的损伤，可将枪尖头部稍剪一下
  2. 50 ml聚四氟乙烯无菌高速离心管 (Nalgene，catalog number: 3114-0050)
  3. 50 ml无菌注射器
  4. 细菌分离液 (OptiPrepTM，LOT#00119，4-30 °C避光保存)
  5. DNA提取试剂盒A：品牌QIAGEN, PowerSoil® Pro Kit, catalog number: 47014-100，15-25 °C保存 (其中CD2保存于4 °C)；试剂盒提供的溶液与材料包括：CD1、CD2、CD3、EA、CD5、CD6，BowerBead Pro离心管，2 ml 无菌离心管、1.5 ml 洗脱管、MB Spain过滤柱
  6. DNA提取试剂盒B：品牌QIAGEN, PowerSoil® DNA Isolation Kit强力土壤DNA提取试剂盒，catalog number: 12988-10；试剂盒提供的溶液与材料包括：PowerBead Solution，C1、C2、C3、C4、C5，2ml、50 ml无菌离心管，DeNase Purmax过滤柱
  7. 去离子水
  8. 1 M Tris-HCl缓冲液：Solarbio，catalog number: T1150，pH 8.0，常温保存
  9. 0.22 µm滤膜 (Millipore, GSW04700)
  10. 磷酸二氢钠二水合物：阿拉丁，S102315-250g
  11. 磷酸氢二钠，无水：阿拉丁，S118443-250g
  12. 氯化钠：阿拉丁，C111535-500g
  13. DL15000 DNA Marker：TaKaRa，LOT#AK90932A，-20 °C保存
  14. 焦磷酸盐：MACKLIN，S817837-500g (见溶液配方)
  15. 吐温20：CAS [9005-69-5]，密封保存 (见溶液配方)
  16. 去腐蚀剂S0 (见溶剂配方)
  17. 3 M乙酸钠 (见溶剂配方)
  18. 70% 乙醇 (见溶剂配方)

仪器设备

  1. 1 ml、5 ml、10 ml移液枪
  2. 高速离心机 (均可至4 °C低温) ：
    1)
    品牌：Eppendorf，model: Centrifuge 5810R
    2)
    品牌：Eppendorf，model: Centrifuge 5417R
  3. 涡旋仪：品牌Scientific Industries，model: Vortex Genie-2
  4. 涡旋仪水平50 ml离心管支架：model: SI-H506
  5. 电子天平：品牌HANGPING，model: JA2003N
  6. 超净工作台：苏净安泰，model: YJ-1340
  7. 纯水仪：美国Milli-Q型
  8. 电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司，model: WGLL-230BE
  9. 高压蒸汽灭菌器：品牌PHCBI，model: MLS-3781L-PC
  10. 循环水式多用真空泵：郑州恒岩仪器有限公司，model: SHB-IIIS
  11. 过滤器：品牌Nalgene，catalog number: 300-4050
  12. 琼脂糖凝胶电泳仪：北京市六一仪器厂，model: DYY-6C
  13. 超微量紫外分光光度计：品牌Thermo Scientific，model: NANODROP 1000
  14. 真空离心浓缩仪：品牌Eppendorf，model: Concentrator plus

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：郭东毅, 陈泓羽, 李方如, 占迪, 董海良. (2021). 一种针对重金属污染土壤的高效DNA提取方法：去腐试剂前处理结合标准试剂盒提取. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003707. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003707.
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How to cite: Guo, D. Y., Chen, H. Y., Li, F. R., Zhang, D. and Dong, H. L. (2021). An Efficient DNA Extraction Method for Soil with Heavy-metal Contaminations: Humus Removal Reagents for Sample Pre-treatment Combined with DNA Standard Kit. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003707. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003707.
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