研究背景

黄翅大白蚁作为一种培菌白蚁，与特定真菌-鸡枞菌 (Termitomyces) 共生，在白蚁巢内建立菌圃，培养小白球菌 (Termitosphaeria duthiei (Berk.) Ciferri.) 为白蚁提供营养 (Hager et al., 2013；Ramadhar et al., 2014)。培菌白蚁主要分布在非洲和亚洲热带地区，在植物废弃物的降解过程中发挥重要作用 (Aanen et al., 2005)。培菌白蚁自身和菌圃真菌 (鸡枞菌) 易受多种真菌侵染，但在健康的白蚁蚁巢中只有鸡枞菌生长，白蚁或其共生菌必然存在一定的机制来抵制致病菌，其中放线菌作为次级代谢产物主要产生者，可能起着关键的作用 (徐晓 等，2018)。培菌昆虫相关放线菌是天然产物的广泛来源，结构多样的次级代谢物包括多肽、大环内酯、多烯、醌酮和生物碱等，常参与到微生物-宿主的相互作用中 (未建华 等，2019)。昆虫肠道、体表及巢穴作为多种微生物的栖息地，蕴含着丰富的放线菌资源，本文主要介绍从培菌白蚁肠道分离放线菌的方法。

材料与试剂

1. 无菌培养皿
2. 琼脂 (生工生物工程有限公司，产品目录号: A505255)
3. 酵母粉 (Oxoid, England, 产品目录号: LP0021)
4. 胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，产品目录号: A505247)
5. 麸皮琼脂培养基 (索莱宝，北京，产品目录号: LA8720)
6. 无机盐 (NaCl，KCl，Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，KNO₃，K₂HPO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，K₂HPO₄，MgSO₄，(NH₄)₂SO₄，CaCO₃，MnCl₂·4H₂O，ZnSO₄·7H₂O皆购自国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
7. 引物合成，PCR产物测序 (北京六合华大基因科技股份有限公司)
8. 16SrRNA通用引物: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)；1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)
9. 基因组提取试剂盒 (Bacterial DNA Kit 500，Omega bio-tek公司，D3350-01)
10. DNA纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit 200，Omega bio-tek公司，D2500-02)
11. PBS缓冲液 (见溶液配方)
12. 高氏一号培养基 (见溶液配方)
13. 可溶性淀粉培养基 (见溶液配方)
14. 1,000×微量盐溶液 (见溶液配方)
15. 麸皮培养基 (见溶液配方)
16. LB 培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超净工作台 (品牌AIRTCH)
2. 涂布棒
3. 分析天平 (赛多利斯公司，北京，型号: ALC-110.4&1100.2)
4. 高压灭菌器 (爱博公司，山东)
5. 恒温培养箱 (精宏实验设备公司，上海，型号: DNP-9052)
6. 恒温水浴摇床 (知楚仪器公司，上海)
7. PCR仪 (品牌TaKaRa)
8. 电泳仪 (六一电泳器材厂公司，北京，型号: DYY-10C)
9. 恒温金属浴 (博日科技公司，杭州)
10. 凝胶成像仪 (品牌UVItec)
11. 离心机 (品牌Eppendorf，型号: Centrifuge 5417)
12. 移液器
    

软件和数据库

1. 利用细菌16S序列进行菌种鉴定网站https://www.ezbiocloud.net/identify; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
2. 各国菌种保藏中心网址 (可参考各种培养基的配制方法，并且每种微生物都有其对应的培养基)：
   
   2.1

   德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ) Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, https://www.dsmz.de/.
   2.2

   日本菌种保藏中心 (JCM) Japan Collection of Microorganisms, https://jcm.brc.riken.jp/en/.
   2.3

   韩国菌种保藏中心 (KCTC) Korean collection for type cultures, https://kctc.kribb.re.kr/En/Kctc.
3. MAGE7.0 软件，下载地址MEGA7.0.26_win64_setup.exe, https://www.megasoftware.net/.
   

实验步骤