背景

白蚁肠道中存在多种共生微生物，包括细菌、真菌和原生动物如鞭毛虫，根据白蚁后肠有无鞭毛虫，可将白蚁分为低等白蚁 (有) 和高等白蚁 (无) 两大类 (Ni et al.， 2013)。高等白蚁根据食性又分为食木/草白蚁、食土/腐殖质白蚁和培菌白蚁。培菌白蚁属于白蚁科大白蚁亚科，其在蚁巢中专一培养真菌鸡枞菌(Termitomyces) (Aanen et al.，2009)，两者存在共生互惠关系。白蚁取食鸡枞菌的无性孢子—小白球菌(Termitosphaeria duthiei (Berk.) Ciferri.)，获得必需的氮源，而小白球菌在白蚁肠道与木质颗粒混合，经过消化后被排泄到体外形成新的菌圃 (Poulsen，2015)。真菌细胞壁主要由几丁质、葡聚糖和蛋白质组成，因此几丁质代谢是培菌白蚁营养利用以及抑制菌圃上其它杂菌生长的关键环节。通过分离培养能够降解几丁质的肠道微生物，为进一步研究培菌白蚁消化利用真菌和抵御杂菌在菌圃的生长奠定基础。

材料与试剂

1. 琼脂 (生工生物工程有限公司，产品目录号：A505255)
2. 酵母粉 (Oxoid, England, 产品目录号：LP0021)
3. 胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，上海，产品目录号：A505247)
4. 无机盐 (NaCl，KCl，Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，KNO₃，K₂HPO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，K₂HPO₄，MgSO₄，(NH₄)₂SO₄，CaCO₃，MnCl₂·4H₂O, ZnSO₄·7H₂O) (国药集团化学试剂有限公司，上海，分析纯)
5. 几丁质 (Sigma公司，美国，产品目录号：C7170)
6. 盐酸 (国药集团化学试剂有限公司，上海，分析纯)
7. 乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，上海，分析纯)
8. 引物合成及PCR产物测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成
9. 16S rRNA通用引物： 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)
10. 基因组提取试剂盒 (Bacterial DNA Kit 500，D3350-01，Omega Bio-Tek公司)
11. DNA纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit 200，D2500-02，Omega Bio-Tek公司)
12. PBS 缓冲液 (见溶液配方)
13. 胶体几丁质 (见溶液配方)
14. 几丁质培养基 (见溶液配方)
15. LB 培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超净工作台 (品牌AIRTCH，型号：SW-CJ-2FD)
2. 分析天平 (赛多利斯公司，北京，型号：ALC-110.4&1100.2)
3. 高压灭菌器 (申安医疗器械厂，上海，型号：LDZM-80L)
4. 恒温培养箱 (精宏实验设备公司，上海，型号：DNP-9052)
5. 恒温摇床 (知楚仪器公司，上海，型号：ZQZY-BF8)
6. PCR 仪 (品牌TaKaRa，型号：TP600)
7. 电泳仪 (六一电泳器材厂公司，北京，型号：DYY-10C)
8. 恒温金属浴 (博日科技公司，杭州，型号：CHB-100)
9. 凝胶成像仪 (品牌UVItec，型号：97-0094-16)
10. 离心机 (品牌Eppendorf，型号：Centrifuge 5417)
11. 厌氧袋 (品牌MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC，型号：C-43)
    

软件和数据库

1. 利用细菌16S rRNA序列进行菌种鉴定的网站
   
   1.1

   https://www.ezbiocloud.net/identify
   1.2

   https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
2. 各国菌种保藏中心网址(可参考各种培养基的配制方法，并且每种微生物都有其对应的培养基)
   
   2.1

   德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ) Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures.
   https://www.dsmz.de/
   2.2

   日本菌种保藏中心 (JCM) Japan Collection of Microorganisms.
   https://jcm.brc.riken.jp/en/
   2.3

   韩国菌种保藏中心 (KCTC) Korean collection for type cultures.
   https://kctc.kribb.re.kr/En/Kctc
3. MAGE7.0 软件 下载地址MEGA7.0.26_win64_setup.exe
   

实验步骤