Detection of Trace Endophytic Fungi in Plant Tissues by Nested PCR and its Primers

材料与试剂

1.  各种型号枪头
2.  离心管 (2 ml, 1.5 ml)
3.  pGEM-T Easy载体 (Promega公司, Promega, catalog number: A1360)
4.  感受态细胞Escherichia coli JM109 (Promega公司, Promega, catalog number: L1001)
5.  用于扩增植物组织中内生真菌ITS的引物
   引物包括巢式PCR第一轮扩增引物对和巢式PCR第二轮扩增引物对；
   巢式PCR第一轮扩增引物对：
   
   1)

   正向引物 NSA3: 5′-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3′,
   反向引物 NLC2: 5′-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3′;

   2)

   正向引物 NSI1: 5′-GATTGAATGGCTTAGTGAGG-3′,
   反向引物 NLB4: 5′-GGATTCTCACCCTCTATGAC-3′;

   巢式PCR第二轮扩增引物对为以下任一引物对：
   

   1)

   正向引物 ITS1-F: 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,
   反向引物 ITS2: 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′;

   2)

   正向引物 ITS1-F_KYO2: 5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′,
   反向引物 ITS2_KYO2: 5′-TTYRCTRCGTTCTTCATC-3′;

   3)

   正向引物 fITS7: 5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′,
   反向引物 ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;

   4)

   正向引物 ITS3_KYO2: 5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′,
   反向引物 ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
6.  DNeasy Plant Mini Kit试剂盒 (QIAGEN公司, catalog number: 69104)
7.  AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒 (康宁生命科学有限公司, AxyPrep, catalog number: AP-GX-50)
8.  碎冰
9.  异丙醇 (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 80109218)
10.  无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 10009218)
11.  胰蛋白胨 (杭州微生物试剂有限公司, HANWEI, catalog number: Y0005)
12.  NaCl (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 10019318)
13.  酵母提取物 (yeast extract) (Oxoid公司, Oxoid, catalog number: LP0021)
14.  琼脂 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司, DING GOU, catalog number: DH010-1.1)
15. 氨苄青霉素 (Ampicillin) (生工生物工程 (上海)有限公司, Amresco, catalog number: 0339)
16.  3% X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) (北京索莱宝科技有限公司, Solarbio, catalog number: X8050-25)
17.  20% IPTG (异丙基硫代半乳糖苷) (北京百奥莱博科技有限公司, 百奥莱博, catalog number: GL1590-PYO)
18.  超纯水
19.  DNA Marker (康为世纪公司, cwbio, catalog number: CW2583)
20.  含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB平板 (预先滴加40 μl 3% X-gal和7 μl 20% IPTG) (见溶液配方)
21.  PCR反应液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1.  制冰机 (上海易汇生物科技有限公司，易汇，catalog number: IMS-20)
2.  超净工作台
3.  研钵
4.  移液枪 (2.5 μl、10 μl、20 μl、100 μl、200 μl、1000 μl)
5.  离心机 (杭州卡培恩生物技术公司, SIGMA, catalog number: 3K1S)
6.  超微量核酸蛋白测定仪 (Quawell公司, Quawell, catalog number: Q5000)
7.  -20 °C冰箱
8.  MyCycler PCR扩增仪 (Bio-Rad公司, Bio-Rad, catalog number: MyCycler)
9.  手术刀
10.  电子精密天平 (上海民桥精密科学仪器有限公司, MINQIAO, catalog number: JA1103 FA/JA系列)
    

软件和数据库

1.  VecScreen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)
2.  BLASTN2.2.28+程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
   

实验步骤