acdSf3/acdSr4 Primer pair for Rapid Identification of ACC Deaminase Producing Bacteria

材料与试剂

1. 无菌塑封袋 (170 mm × 120 mm、140 mm × 100 mm)
2. 各种型号的枪头
3. 离心管 (50 ml)
4. 纱布
5. 牙签 (灭菌处理)
6. 冷冻管 (2 ml)
7. 细菌基因组DNA提取试剂盒 (离心柱形) (天根生化科技有限公司，TIANGEN, catalog number: DP302-02)
8. ACC (1-Aminocyclopropane-1-carboxylic Acid) (上海意杰生物科技有限公司，Merck, catalog number: 149101)
9. 16S rRNA基因序列扩增引物 (由上海生物工程技术服务有限公司合成)
10. 琼脂 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DING GOU, catalog number: DH010-1.1)
11. 苯菌灵 (溶剂为二甲基亚砜) (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: B828272)
12. 抑霉唑硫酸盐 (上海振誉生物科技有限公司，阿拉丁，catalog number: I135647)
13. 胰蛋白胨 (杭州微生物试剂有限公司，HANWEI, catalog number: Y0005)
14. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10019318)
15. 酵母提取物 (yeast extract) (Oxoid公司，Oxoid, catalog number: LP0021)
16. 蛋白胨 (杭州微生物试剂有限公司，HANWEI, catalog number: Y0004)
17. 酪蛋白水解物 (Casein acid hydrilysates) (Solarbio公司，Solarbio, catalog number: C8220)
18. KH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10017618)
19. 硼酸 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: B802844)
20. MnSO₄ (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 20026917)
21. ZnSO₄·7H₂O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10024018)
22. CuSO₄·5H₂O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10008218)
23. Na₂MoO₄·2H₂O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10019818)
24. 葡萄糖 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: D810588)
25. 柠檬酸 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司，Diamond, catalog number: A100529)
26. (NH₄)₂SO₄ (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10002918)
27. (NH₄)₂HPO₄ (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10002718)
28. MgSO₄·7H₂O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10013018)
29. FeSO₄·7H₂O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10012118)
30. 细菌琼脂粉 (Bacto-Agar) (碧迪医疗器械 (上海) 有限公司，BD, catalog number: 214010)
31. 葡萄糖酸 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 阿拉丁, catalog number: G111173)
32. 无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 10009218)
33. 次氯酸钠溶液 (≥5.2%活性氯) (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 80010428)
34. 10x PBS粉末 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司，BBI, catalog number: PD0100)
35. 硫酸链霉素 (GENVIEW公司，GENVIEW, catalog number: AS325)
36. 盐酸四环素 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: D807503)
37. 无菌去离子水
38. 超纯水
39. DL2,000 DNA marker (北京康为世纪生物科技有限公司，TAKARA, catalog number: CW2583S)
40. 2x TaqMasterMix (不含染料) (北京康为世纪生物科技有限公司，康为世纪，catalog number: CW0718)
41. 琼脂糖 (电泳级) (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，Genview，catalog number: 9012-36-6)
42. 绿如蓝核酸染料 (北京百奥莱博科技有限公司，百奥莱博，catalog number: BTN 70303)
43. 1/10胰蛋白胨大豆培养基 (Tryptic Soy Agar, TSA) (碧迪医疗器械 (上海) 有限公司，BD, catalog number: GD-236940) (见溶液配方)
44. 假单胞杆菌分离培养基 (Pseudomonas Isolation Agar, PIA) (碧迪医疗器械 (上海) 有限公司，BD, catalog number: GD-292710) (见溶液配方)
45. Luria-Bertani (LB) 培养基 (见溶液配方)
46. PAF液体培养基 (见溶液配方)
47. DF培养基 (以硫酸铵或ACC为唯一氮源) (见溶液配方)
48. ADF培养基 (见溶液配方)
49. 1x PBS缓冲液 (见溶液配方)
50. 75%的乙醇溶液 (见溶液配方)
51. 90%的乙醇溶液 (见溶液配方)
52. 次氯酸钠溶液 (0.5%的活性氯) (见溶液配方)

仪器设备

1. 超净工作台
2. 剪刀
3. 手术刀
4. 镊子
5. 研钵和研棒
6. 酒精灯
7. 4 °C冰箱
8. 涡旋振荡器 (MOBIO公司，MOBIO, catalog number: Vortex-Genie 2)
9. 台式高速冷冻离心机 (Sigma公司，Sigma, catalog number: 3K15)
10. 涂布棒
11. 接种环
12. 全温振荡器 (苏州培英实验设备有限公司，培英，catalog number: THZ-C-1)
    
13. 移液枪
14. -70 °C超低温冰箱
15. 超微量紫外分光光度计 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，Quawell, catalog number: Q5000)
16. MyCycler PCR扩增仪 (Bio-Rad公司，Bio-Rad, catalog number: MyCycler)
17. 电泳仪 (北京六一仪器厂，北京六一，catalog number: DYY-6C)
18. 立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗机器厂，SHENAN, catalog number: LDZF-50KB-Ⅱ)

软件和数据库

1. BioEdit v7.0.9软件 (https://file.org/free-download/bioedit)
2. Genedoc v2.7.0软件 (http://nrbsc.org/gfx/genedoc/)
3. BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
4. GenBank数据库中的BLAST功能 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
5. ClustX1.81软件 (https://www.clustal.org/download/current/)
6. MEGA v5.1软件 (https://www.megasoftware.net/)
7. FigTree v1.4.2软件 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)

实验步骤