研究背景：

        宏基因组学和功能基因的高通量测序彻底改变了人类对各类生态环境中微生物的组成和功能的认识和理解，特别是对人类和动物肠道微生物菌群、植物根际微生物菌群在宿主与微生物的共生寄主关系以及健康和疾病之间关系的认识和理解，在此过程中产生了无数未知微生物的序列信息 (Goulde et al.，2018; Schretter et al.，2018; Marynowska et al.，2020)。在这样的时代背景下，许多研究者认为已经过时的微生物纯培养技术又得到了重生。相对于对自然环境中的各种各样的微生物群落的基因组进行研究的微生物组概念，为获取这些复杂环境中的单个微生物的过程相应地产生了一个培养组学 (culturomics) 的概念。只有获得群落中的单个微生物之后，才能理解这些微生物的生物学特征和其在群落中的功能，单个微生物的分离培养对于阐明这些微生物在复杂环境中的作用仍然至关重要。比如，它们能够利用什么营养？它们会产生哪些代谢物？它们在环境中如何与其他微生物相互作用？这些未知的微生物可能具有有用的酶、新的抗菌素和其它的新物质。白蚁是以木质纤维素为主食的昆虫，肠道微生物也在纤维素降解过程中发挥重要的作用 (Tokuda et al.，2018; Marynowska et al.，2020)。通过微电极检测发现直径只有几百微米的肠道，其内容物的氧化还原电位很低，不同于果蝇等昆虫(Douglas, 2018)，是一个严格厌氧的环境。
        从广义上讲，专性厌氧菌 (obligate anaerobes) 可以定义为不能利用氧分子生长的微生物。根据他们与氧气的关系，可进一步分类，如耐氧的厌氧菌 (Aerotolerant anaerobe)、中度厌氧菌 (Moderate anaerobe) 和严格厌氧菌 (Strict anaerobe) 等。耐氧的厌氧菌不能够利用氧气作为末端电子受体，但是对氧气不敏感，部分菌种可在一定时间内耐受空气中的氧气 (耐受时间长短因物种而已)。中度厌氧菌暴露在室温空气中60~90 min后再回接到厌氧状态下，其生存率不会损失太多，比如脆弱拟杆菌等 (Loesche, 1969)。严格厌氧菌对氧气非常敏感，环境中的溶解氧高于5 µM时就会影响它们的生长 (Engelkirk et al.，1992)。短时间内暴露在低浓度的氧气中就会死亡或者停止生长，它们一般含有一套不同于好氧微生物的氧化还原系统。因此，在处理这些微生物的所有步骤中保持缺氧状态非常重要。为了维持严格厌氧菌的生长，要保证培养基的氧化还原电位低于-330 mV，这可以通过添加还原剂实现。大多数厌氧微生物是很苛刻的，需要复杂的添加物才能生长。结合16S高通量测序也发现白蚁肠道内厌氧微生物占据优势。我们团队前期从白蚁肠道中分离了一些厌氧细菌 (Yang et al.，2014)，结合当前兴起的人类肠道培养组学的发展，就白蚁肠道厌氧菌的分离培养方法和注意事项介绍如下。

材料与试剂

1. 一次性医用无菌注射器 (1 ml、5 ml、10 ml)
2. 刃天青 (生工生物工程有限公司, catalog number: A606726 )
3. L-胱氨酸 (生工生物工程有限公司, catalog number: A610088)
4. 半胱氨酸盐酸盐 (生工生物工程有限公司, catalog number: A506578)
5. 维生素K1 (生工生物工程有限公司, catalog number: A606528)
6. 氯化血红素 (生工生物工程有限公司, catalog number: A602521)
7. 诺氟沙星 (生工生物工程有限公司, catalog number: A506250)
8. L-色氨酸 (生工生物工程有限公司, catalog number: A601911)
9. L-精氨酸 (生工生物工程有限公司, catalog number: A600205)
10. 琼脂 (生工生物工程有限公司, catalog number: A505255)
11. 胰酶解蛋白胨 (Oxoid, England, catalog number: LP0042)
12. 酵母粉 (Oxoid, England, catalog number: LP0021)
13. 蛋白胨 (北京奥博星生物技术有限责任公司，catalog number: 01-001)
14. 大豆蛋白胨 (青岛海博生物技术有限公司，catalog number: HB8275)
15. 牛肉浸粉 (青岛海博生物技术有限公司，catalog number: HB8272)
16. 肝浸粉 (青岛海博生物技术有限公司，catalog number: HB8289)
17. 无机盐 (Na₂HPO₄·12H₂O，NaCl，磷酸钠，连二亚硫酸钠(俗称保险粉)及葡萄糖，可溶性淀粉皆购自国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
18. 维生素 (生物素、叶酸、吡哆醇盐酸、硫胺素盐酸、核黄素、烟酸、泛酸钙、维生素B12、对氨基苯甲酸、硫辛酸) (皆购自国药集团化学试剂有限公司，中国，生化试剂)
19. 16S rRNA通用引物: 16S-27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，16S-1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) 合成于北京擎科生物科技有限公司
20. 预还原缓冲液 (0.1 M PBS缓冲液) (见溶液配方)
21. GAM培养基 (见溶液配方)
22. MM14培养基 (见溶液配方)
23. 100倍微生素溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 厌氧工作站 (COY Laboratory Products, INC, United States, model: AC09-086)
2. 厌氧袋 (MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC，model: C-43)
3. 厌氧罐 (OXOID LTD WADE ROAD, ENGLAND品牌THERMO OXOID，model: AG0025A)
4. 厌氧管、丁基胶塞、铝盖、铝盖封口钳子、螺旋口厌氧培养瓶 (50 ml、100 ml、250 ml) 等
5. 超净工作台
6. 高压灭菌锅
7. 恒温培养箱
8. 200 °C烘箱
9. 磁力搅拌器及其转子
10. 分析天平
11. 有机玻璃面罩
12. 气瓶 (德海伟业科技公司，青岛)
13. PCR仪 (伯乐，北京)
    

软件和数据库

1. 利用细菌16S序列进行菌种鉴定网站
   

   https://www.ezbiocloud.net/identify
   https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

2. Lasergene等DNA序列分析软件
3. 各国菌种保藏中心网址 (可参考各种培养基的配制方法，并且每种微生物都有其对应的培养基)
   
   1)

   德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ) Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)
   2)

   日本菌种保藏中心 (JCM) Japan Collection of Microorganisms (https://jcm.brc.riken.jp/en/)
   3)

   韩国菌种保藏中心 (KCTC) Korean collection for type cultures (https://kctc.kribb.re.kr/En/Kctc)
   4)

   BacDive 的数据库，其中罗列了来自34个细菌门和3个古细菌门的超过80,000株培养菌株的特性和培养条件，包括约90%的模式菌株 (https://bacdive.dsmz.de)
   5)

   中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）China General Microbiological Culture Collection Center（http://www.cgmcc.net/）
   6)

   美国典型菌种保藏中心（ATCC）American Type Culture Collection ，可通过国内北纳生物等代理公司购买。

实验步骤