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基于反应元件的调控因子筛选——双荧光报告基因法

Dual Fluorescence Reporter-based siRNA Screening of Transcription Regulators of Response Elements

郝 郝子健
李 李正威
杨 杨凡
胡 胡荣贵

发表时间: 2021年07月26日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010839 浏览次数: 4071

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高通量筛选实验手册
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摘要：生命活动的转录调控，有时依赖于信息分子与受体结合后，形成的复合物结合到受体识别的特定DNA序列（反应元件）上，启动下游基因的转录。而转录强弱可以通过启动子下游报告基因的表达水平来体现，比如荧光素酶报告基因(Sun et al., 2017)或绿色荧光蛋白(GFP)(Lingemann et al., 2019)等。但荧光素酶报告基因筛选系统在检测时需要额外加入荧光素作为底物，增加了筛选成本；而单独使用一种GFP报告基因则不易排除由于细胞状态受损或者非特异的转录过程受到抑制而造成的假阳性结果。为了筛选可能影响某条信号通路转录的调节因子，我们构建了可以表达两种荧光蛋白的稳转细胞系，GFP基因在该信号通路特异的反应元件下游，作为报告基因反映该信号通路被激活或抑制的状态；mCherry基因则可以稳定表达，作为内参排除由于非特异性调节引起的假阳性结果。在细胞系中瞬时转染siRNA文库敲低基因后，检测GFP与mCherry的荧光强度，通过二者的比值筛选目的基因，这样既降低了成本，又提高了筛选结果的可靠性。

Keywords: 转录因子 search 反应元件 search 荧光蛋白 search siRNA筛选 search

材料与试剂

  1. ON-TARGETplus Non-Targeting Pool (siNC-OTP, Dharmacon, catalog number: D-001810-10-05)
  2. TOX Transfection Control (si-TOX, Dharmacon, catalog number: D-001500-01-05)
  3. si-PC-1 (Genepharma, 20 μM)
  4. si-PC-2 (Genepharma, 20 μM)
  5. Opti-MEM (Gibco, catalog number: 31985088)
  6. VPSFM (Gibco, catalog number: 11681020)
  7. Lipofectamine RNAiMAX (Gibco, catalog number: 13778150)
  8. Puromycin (Invivogen, ant-pr-5b)
  9. Hygromycin (Merck, catalog number: 400052)
  10. PEI (Polysciences, catalog number: 23966)
  11. 小分子刺激物STI（使用DMSO为溶剂配成100 mM储存液）
  12. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: D4540)
  13. DMEM (Corning, catalog number: 10013035)
  14. FBS (Yeason, catalog number: 40130ES76)
  15. 胰酶 (Gibco, catalog number: 25200072)
  16. DPBS (源培，catalog number: K210704)
  17. 5×siRNA buffer (Thermo Fisher, catalog number: B-002000-UB)
  18. 16% PFA (Alfa Aesar, catalog number: 43368)
  19. Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H3570)
  20. 0.45 μm 滤器 (Sartorius Stedim, catalog number: 16533-K)
  21. 一次性无菌注射器（上海康德莱企业发展集团股份有限公司，10 mL）
  22. 0.5-10 μL排枪（BRAND, catalog number: SP0025）
  23. 透明圆底96孔板 (Corning, catalog number: 3879)
  24. 黑边底透384孔板 (Corning, catalog number: 3764)
  25. 200目尼龙网

仪器设备

  1. Operetta高通量细胞成像分析系统 (Perkin Elmer, Operetta)
  2. Multidrop Combi 自动分液器 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
  3. 通用型离心机 (HermLe, model: Z 300K)
  4. 高速冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
  5. 干细胞多色流式检测仪 (Beckman, CytoFlex LX)
  6. 荧光倒置显微镜 (Olympus, model: IX51)
  7. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX31SF)
  8. 二氧化碳细胞培养箱 (Thermo Fisher, model: 3111)
  9. 全自动细胞分析计数仪 (Beckman Coulter, Z2)
  10. 生物安全柜 (ESCO, model: FHC-1200A)
  11. 离心式自动洗板机 (BlueCatBio, BlueWasher)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：郝子健, 李正威, 杨凡, 胡荣贵. (2021). 基于反应元件的调控因子筛选——双荧光报告基因法. // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010839. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010839.
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How to cite: Hao, Z. J., Li, Z. W., Yang, F., Hu, R. G. (2021). Dual Fluorescence Reporter-based siRNA Screening of Transcription Regulators of Response Elements. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook. Bio-101: e1010839. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010839.
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