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利用显微注射与荧光原位杂交检测哺乳动物细胞中 mRNA的出核

Microinjection and Fluorescence In Situ Hybridization Assay for Studying mRNA Export in Mammalian Cells

朱 朱怡*
陈 陈素丽*
王 王建姝*
程 程红

*Contributed equally to this work 发表时间: 2022年09月25日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010813 浏览次数: 1189

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摘要：显微注射 (Microinjection) 结合荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization)技术是研究哺乳动物细胞mRNA出核转运的有效方法，显微注射克服了传统脂质体转染在不同细胞中转染效率不一致、DNA进入细胞核速度慢及具有一定的细胞毒性等问题。通过这种方法，可以推测mRNA的出核速率，观察异常RNA的出核情况等，值得一提的是这种方法能够有效地检测转录拷贝数低的细胞中的mRNA的出核转运。

Keywords: 显微注射 search 荧光原位杂交 search mRNA出核转运 search

材料与试剂

  1. 显微注射细胞培养皿 (35 mm，内含20 mm直径玻璃底) (Cellvis, catalog number: D35-20-1-N)
  2. 1.5 ml离心管 (Biosharp)
  3. 50 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 339652)
  4. 胎牛血清 (GIBCO, catalog number: 10099141)
  5. DMEM培养基 (GIBCO, catalog number: 1210061)
  6. 质粒抽提试剂盒 (QIAGEN, catalog number: 27106)
  7. 显微注射针 (二氧化硅玻璃针胚管，1.0 mm内径) (World Precision Instruments, catalog number: 1B100F-3)
  8. 显微注射标志物 (70 kDa绿色荧光标记葡聚糖) (Life Technologies, catalog number: D7173)
  9. 探针 (Invitrogen) （本文中所用探针位特异靶标CJUN骨架质粒pcDNA3.0，aaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggctgatcagcgggt，5'端添加Alexa Fluor 546修饰）
  10. KCl (SIGMA, catalog number: P9541)
  11. HEPES (SIGMA, catalog number: H3375)
  12. NaCl (SIGMA, catalog number: S3014)
  13. Na2HPO4 (SIGMA, catalog number: S3264)
  14. KH2PO4 (Fluka, catalog number: 60218)
  15. Paraformaldehyde (SIGMA, catalog number: P6148)
  16. Trisodium citrate (SIGMA, catalog number: S1804)
  17. Formamide (SIGMA, catalog number: F7503)
  18. Dextran sulfate sodium salt (SIGMA, catalog number: D4911)
  19. Bovine serum albumin (Abcone, catalog number: A23088)
  20. Yeast tRNA (Roche, catalog number: 10109525001)
  21. Vanadyl ribonucleoside complexes (SIGMA, catalog number: 94740)
  22. 10×显微注射缓冲液 (见溶液配方)
  23. 1× PBS (见溶液配方)
  24. 10% PFA (见溶液配方)
  25. 50%甲酰胺/1× SSC (见溶液配方)
  26. 杂交缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. CO2培养箱 (Thermo Fisher Scientific，Forma Water Jacketed CO2 Incubator，3111)
  2. 倒置显微镜 (需包含10倍目镜和40倍物镜，需包含荧光光源) (Olympus, model: IX71)
  3. 显微操纵器 (Eppendrof, InjectMan, NI-2)
  4. 微量自动注射仪 (Eppendorf, FemtoJet, 5247)
  5. 拉针仪 (Sutter Instrument, Flaming/Brown Micropipette Puller, P-97)
  6. 玻璃毛细管（World Precision Instruments，1B100F-3 ）
  7. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5424R)
  8. -80 °C超低温冰箱 (Thermo Fisher Scientific, Heto Ultra Freeze)
  9. -25 °C冰箱 (SANYO, model: MDF-U538-C)
  10. pH计 (Mettler Toledo, SevenEasy, 8603)
  11. 紫外分光光度计 (NanoDrop)
  12. 移液器 (Gilson)

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：朱怡, 陈素丽, 王建姝, 程红. (2022). 利用显微注射与荧光原位杂交检测哺乳动物细胞中 mRNA的出核. Bio-101: e1010813. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010813.
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How to cite: Zhu, Y., Chen, S. L., Wang, J. S. and Cheng, H. (2022). Microinjection and Fluorescence In Situ Hybridization Assay for Studying mRNA Export in Mammalian Cells. Bio-101: e1010813. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010813.
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