一、试剂的配置：
1.磷酸氢钾缓冲液(K-buffer, PH5.3)（200mL）：
45.64g磷酸氢二钾(K2HPO4)加入双蒸水定容至200ml，用H3PO4调PH至5.3，高压蒸汽灭菌。
2.硫酸镁-氯化钠(M-N)（1L）：
七水合硫酸镁(MgSO4∙7H2O) 30g，氯化钠(NaCl) 15g加双蒸水定容1L；高压蒸汽灭菌。
3.1%氯化钙(CaCl2) (W/V)（100mL）：
1g CaCl2.H2O加入双蒸水定容100ml；高压蒸汽灭菌。
4.20%葡萄糖(Glucose) (W/V)（100mL）：
20g Glucose加入无菌水定容100ml，细菌过滤器过滤灭菌。
5．50%甘油(Glycerol)（100mL）：
50ml 100%的Glycerol加入双蒸水定容100ml；高压蒸汽灭菌。
6．1%FeSO4（100mL）：
0.01g的FeSO4加入无菌水定容100ml，细菌过滤器过滤灭菌，现用现配。
7.0.1M的乙酰丁香酮(AS)：
取196.2mg AS，用二甲亚砜(DMSO)溶解，定容至10ml，即为0.1M AS，将其分装于1.5ml离心管中，-20℃贮存备用，使用前无须灭菌。
8.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸钠(MES)：
称取7.812gMES,用40mL无菌水完全溶解,调pH为5.3，细菌过滤器过滤灭菌，配成-20℃贮存备用。
9.100mg/ml头孢霉素：
称取100mg头孢霉素(公司：Biosharp)溶解1ml的灭菌双蒸水中，用细菌过滤器过滤除菌，配成100mg/ml溶液装于1.5ml无菌离心管中，将其置于-20℃贮存备用。
10.Spore element(1L)：
ZnSO4·7H2O 100mg，CuSO4·5H2O 100mg，MnSO4·5H2O 100mg，Na2MnO4·5H2O 100mg，H3BO3 100mg,加双蒸水定容到1L，高压蒸汽灭菌。
11. 20%(NH4)2NO3 (w/v)：
20g (NH4)2NO3加入双蒸水定容100ml。
12.诱导培养基(IM)（1L）:
K-buffer (PH5.3) | 10ml |
M-N | 20ml |
1%CaCl2·2H2O(W/V) | 1ml |
20%(NH4)2NO3(w/v) | 2.5ml |
50%甘油 | 10ml |
Spore element | 5ml |
分装50 ml /瓶，高压蒸汽灭菌 |
用之前加500uL的20%葡萄糖,100uL的0.1M AS，2.5ml的1M MES,5uL的FeSO4。 |
13.共培养培养基(CO-IM)（1L）：
K-buffer (PH5.3) | 10ml |
M-N | 20ml |
1%CaCl2·2H2O(W/V) | 1ml |
20%(NH4)2NO3(w/v) | 2.5ml |
50%甘油 | 10ml |
Spore element | 5ml |
Agar | 15g |
分装200 ml /瓶，高压蒸汽灭菌 |
用之前加1000uL的20%葡萄糖，800uL的0.1M AS，8ml的1M MES,20uL的FeSO4。 |
二、实验方法
1)将质粒转入农杆菌EHA105中，挑取单菌落在LB(含50ug/ml Rif, 50ug/ml Kan)平板上划线活化；
2) 挑取阳性单菌落与5ml LB(50ug/ml Rif, 50ug/ml Kan)中180r/min，28℃摇床培养过夜；
3) 农杆菌生长至OD600=1.0，用IM培养基将农杆菌菌液稀释至OD600=0.15，180r/min，28℃摇床培养5h。离心6000r/min，5min，收集农杆菌，并用50ml IM培养基溶解农杆菌；
4) 用灭菌双蒸水冲洗TM17斜面，离心6000r/min，5min，收集孢子。用含农杆菌的IM培养基稀释孢子至1×106个/ml混匀。在CO-IM平板上铺一层玻璃纸（提前高压蒸汽灭菌），吸取300ul农杆菌与TM17孢子的混合液涂于CO-IM平板上，建议涂4-5块CO-IM。25℃避光培养3d；
5）揭下玻璃纸置于灭过菌的培养皿上，上面倒15mlPDA（ 30ug/ml潮霉素，500ug/ml头孢霉素），25℃培养2d；
6）挑取长出的单菌落至于PDA平板（ 30ug/ml潮霉素）上；
7）将在PDA平板（ 30ug/ml潮霉素）上正常生长的小斑病菌转接到V8培养基上进行培养。