一、试剂的配置:
1.磷酸氢钾缓冲液(K-buffer, PH5.3)(200mL):
45.64g磷酸氢二钾(K2HPO4)加入双蒸水定容至200ml,用H3PO4调PH至5.3,高压蒸汽灭菌。
2.硫酸镁-氯化钠(M-N)(1L):
七水合硫酸镁(MgSO4∙7H2O) 30g,氯化钠(NaCl) 15g加双蒸水定容1L;高压蒸汽灭菌。
3.1%氯化钙(CaCl2) (W/V)(100mL):
1g CaCl2.H2O加入双蒸水定容100ml;高压蒸汽灭菌。
4.20%葡萄糖(Glucose) (W/V)(100mL):
20g Glucose加入无菌水定容100ml,细菌过滤器过滤灭菌。
5.50%甘油(Glycerol)(100mL):
50ml 100%的Glycerol加入双蒸水定容100ml;高压蒸汽灭菌。
6.1%FeSO4(100mL):
0.01g的FeSO4加入无菌水定容100ml,细菌过滤器过滤灭菌,现用现配。
7.0.1M的乙酰丁香酮(AS):
取196.2mg AS,用二甲亚砜(DMSO)溶解,定容至10ml,即为0.1M AS,将其分装于1.5ml离心管中,-20℃贮存备用,使用前无须灭菌。
8.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸钠(MES):
称取7.812gMES,用40mL无菌水完全溶解,调pH为5.3,细菌过滤器过滤灭菌,配成-20℃贮存备用。
9.100mg/ml头孢霉素:
称取100mg头孢霉素(公司:Biosharp)溶解1ml的灭菌双蒸水中,用细菌过滤器过滤除菌,配成100mg/ml溶液装于1.5ml无菌离心管中,将其置于-20℃贮存备用。
10.Spore element(1L):
ZnSO4·7H2O 100mg,CuSO4·5H2O 100mg,MnSO4·5H2O 100mg,Na2MnO4·5H2O 100mg,H3BO3 100mg,加双蒸水定容到1L,高压蒸汽灭菌。
11. 20%(NH4)2NO3 (w/v):
20g (NH4)2NO3加入双蒸水定容100ml。
12.诱导培养基(IM)(1L):
K-buffer (PH5.3) | 10ml |
M-N | 20ml |
1%CaCl2·2H2O(W/V) | 1ml |
20%(NH4)2NO3(w/v) | 2.5ml |
50%甘油 | 10ml |
Spore element | 5ml |
分装50 ml /瓶,高压蒸汽灭菌 |
用之前加500uL的20%葡萄糖,100uL的0.1M AS,2.5ml的1M MES,5uL的FeSO4。 |
13.共培养培养基(CO-IM)(1L):
K-buffer (PH5.3) | 10ml |
M-N | 20ml |
1%CaCl2·2H2O(W/V) | 1ml |
20%(NH4)2NO3(w/v) | 2.5ml |
50%甘油 | 10ml |
Spore element | 5ml |
Agar | 15g |
分装200 ml /瓶,高压蒸汽灭菌 |
用之前加1000uL的20%葡萄糖,800uL的0.1M AS,8ml的1M MES,20uL的FeSO4。 |
二、实验方法
1)将质粒转入农杆菌EHA105中,挑取单菌落在LB(含50ug/ml Rif, 50ug/ml Kan)平板上划线活化;
2) 挑取阳性单菌落与5ml LB(50ug/ml Rif, 50ug/ml Kan)中180r/min,28℃摇床培养过夜;
3) 农杆菌生长至OD600=1.0,用IM培养基将农杆菌菌液稀释至OD600=0.15,180r/min,28℃摇床培养5h。离心6000r/min,5min,收集农杆菌,并用50ml IM培养基溶解农杆菌;
4) 用灭菌双蒸水冲洗TM17斜面,离心6000r/min,5min,收集孢子。用含农杆菌的IM培养基稀释孢子至1×106个/ml混匀。在CO-IM平板上铺一层玻璃纸(提前高压蒸汽灭菌),吸取300ul农杆菌与TM17孢子的混合液涂于CO-IM平板上,建议涂4-5块CO-IM。25℃避光培养3d;
5)揭下玻璃纸置于灭过菌的培养皿上,上面倒15mlPDA( 30ug/ml潮霉素,500ug/ml头孢霉素),25℃培养2d;
6)挑取长出的单菌落至于PDA平板( 30ug/ml潮霉素)上;
7)将在PDA平板( 30ug/ml潮霉素)上正常生长的小斑病菌转接到V8培养基上进行培养。