Hi-Tail PCR 克隆T-DNA 侧翼序列
1. PCR 所用引物（此引物根据pTFCM载体设计）
引物 编号 | 序列 |
LB1 PB23 LB2 PB24 LB3 PB25 RB1a PB26 RB2a PB27 RB3a PB28 LAD1 PB18 LAD2 PB19 LAD3 PB20 LAD4 PB21 AC1 PB22 | TTTCTCCATA ATAATgTgTg AgTAgTTCCC AgAT ACgATggACT CCAgTCCggC CgggTTTCgC TCATgTgTTg AgCATATAAg CgTTAATTCA gTACATTAAA AACgTCCgCA AT ggCAATAAAg TTTCTTAAgA TTgAATCCTg T ACgATggACT CCAgTCCggC CTgTTgCCgg TCTTgCgATg ATTATCA gTAATgCATg ACgTTATTTA TgAgATgggT T ACg ATg gAC TCC AgA gCg gCC gC(g/C/A) N(g/C/A)N NNg gAA ACg ATg gAC TCC AgA gCg gCC gC(g/C/T) N(g/C/T)N NNg gTT ACg ATg gAC TCC AgA gCg gCC gC(g/C/A) (g/C/A)N(g/C/A) NNN CCA A ACg ATg gAC TCC AgA gCg gCC gC(g/C/T) (g/A/T)N(g/C/T) NNN Cgg T ACg ATg gAC TCC AgA g |
2.各引物的位置
3.PCR扩增（共扩三次）
用CTAB法提取转化子的DNA为第一次扩增的模板（将浓度稀释至20-30ng/ul），之后的的第二次和第三次扩增均以上一次对应编号反应体系（即2-1的模板是1-1的PCR产物）的PCR产物经稀释后为模板。
第一次扩增（共四个反应）：
第一个反应体系（1-1）： 第二个反应体系（1-2）： 第三个反应体系（1-3）： 第四个反应体系（1-4）：
10×PCR buffer 2ul 10×PCR buffer 2ul 10×PCR buffer 2ul 10×PCR buffer 2ul
2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul
5uMPB18 4ul 5uMPB19 4ul 5uMPB18 4ul 5uMPB19 4ul
5uMPB20 4ul 5uMPB21 4ul 5uMPB20 4ul 5uMPB21 4ul
5uMPB26 1.2ul 5uMPB26 1.2ul 5uMPB23 1.2ul 5uMPB23 1.2ul
Extaq 0.1ul Extaq 0.1ul Extaq 0.1ul Extaq 0.1ul
(20-30ng/ul)DNA 1ul (20-30ng/ul)DNA 1ul (20-30ng/ul)DNA 1ul (20-30ng/ul)DNA 1ul
H2O 6.1ul H2O 6.1ul H2O 6.1ul H2O 6.1ul
20ul 20ul 20ul 20u
第一次扩增的程序：
step | Temperature(℃) | Time(min:s) |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 | 93 95 94 60 72 Go to step3 94 25 Ramping to 72 72 94 58 72 Go to step11 72 End | 2:00 1:00 0:30 1:00 3:00 10times 0:30 2:00 0.5℃/s 3:00 0:20 1:00 3:00 25 times 5:00 |
第二次扩增（共四个反应）：
将第一次的PCR产物稀释40倍为模板
第一个反应体系（2-1）： 第二个反应体系（2-2）： 第三个反应体系（2-3）： 第四个反应体系（2-4）：
10×PCR buffer 2.5ul 10×PCR buffer 2.5ul 10×PCR buffer 2.5ul 10×PCR buffer 2.5ul
2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul
5uMPB22 1.2ul 5uMPB22 1.2ul 5uMPB22 1.2ul 5uMPB22 1.2ul
5uMPB27 1.2ul 5uMPB27 1.2ul 5uMPB24 1.2ul 5uMPB24 1.2ul
Extaq 0.12ul Extaq 0.12ul Extaq 0.12ul Extaq 0.12ul
DNA 1ul DNA 1ul DNA 1ul DNA 1ul
H2O 17.4 ul H2O 17.4ul H2O 17.4ul H2O 17.4ul
25ul 25ul 25ul 25ul
第二次扩增的程序：
step | Temperature(℃) | Time(min:s) |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 | 94 65 72 Go to step1 94 68 72 94 68 72 94 50 72 Go to step5 72 End | 0:20 1:00 3:00 1time 0:20 1:00 3:00 0:20 1:00 3:00 0:20 1:00 3:00 13times 5:00 |
第三次扩增（共四个反应）：
将第二次的PCR产物稀释10倍为模板
第一个反应体系（3-1）： 第二个反应体系（3-2）： 第三个反应体系（3-3）： 第四个反应体系（3-4）：
10×PCR buffer 2.5ul 10×PCR buffer 2.5ul 10×PCR buffer 2.5ul 10×PCR buffer 2.5ul
2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul 2.5mMdNTP 1.6ul
5uMPB22 1.2ul 5uMPB22 1.2ul 5uMPB22 1.2ul 5uMPB22 1.2ul
5uMPB28 1.2ul 5uMPB28 1.2ul 5uMPB25 1.2ul 5uMPB25 1.2ul
Extaq 0.1ul Extaq 0.1ul Extaq 0.1ul Extaq 0.1ul
DNA 1ul DNA 1ul DNA 1ul DNA 1ul
H2O 17.4 ul H2O 17.4ul H2O 17.4ul H2O 17.4ul
25ul 25ul 25ul 25ul
第三次扩增的程序：
step | Temperature(℃) | Time(min:s) |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 | 94 68 72 94 68 72 94 50 72 Go to step1 72 End | 0:20 1:00 3:00 0:20 1:00 3:00 0:20 1:00 3:00 6-7times 5:00 |
PtrpC-hyg -TtrpC 片段自pSKH上SacI 、XhoI双酶切后联入同样双酶切的pCAMBIA1301（原始），构建成为pTFCM，转入农杆菌EHA105 (Str/Rif) 后用于盾壳霉ZS-1的转化。但后来鉴定好像缺失了一个XbaI 位点。
LB1: 5' AGG GTT CCT ATA GGG TTT CGC TCA TG 3' 63.6
LB2: 5' CAT GTG TTG AGC ATA TAA GAA ACC CT 3' 58.8
LB3: 5' GAA TTA ATT CGG CGT TAA TTC AGT 3' 55.1
RB1: 5' GAT TGA ATC CTG TTG CCG GTC TTG 3' 65
RB2: 5' TGT TGC CGG TCT TGC GAT GAT TAT C 3' 65
RB3: 5' GCG CAA ACT AGG ATA AAT TAT C 3' 57
AD-1: 5’ NTC gA(g/C) T(A/T)T (g/C)g(A/T) gTT 3’
AD-2: 5’ NgT CgA (g/C)(A/T)g ANA (A/T)gA A 3’
AD-3: 5’ (A/T)gT gNA g(A/T)A NCA NAg A 3’
AD-4: 5’ Ag(A/T) gNA g(A/T)A NCA (A/T)Ag g 3’
PCR体系：
dNTP 200uM, special primer 0.15uM, AD primer 2uM, Taq 0.8U, glycerol 6%, DMSO 3%.
PCR扩增验证转化子：扩增的目标片段是质粒上的Gus基因，大小约为1165 bp，引物序列如下：
p1：5'-GACCAAAGCCAGTAAAGTAGAAC-3'
p2：5'-CCCACTATCCTTCGCAAGA-3'