用于全基因组测序的真菌基因组DNA的提取
步骤
65℃预热beffer B。准备裂解液:500mg菌体使用17.5ml。
利用液氮充分研磨菌体,转移进入50ml液氮遇冷的离心管中,加入17.5ml裂解液,快速涡旋充分混匀。
65℃水浴30min,每5-10分钟轻轻颠倒一次。
加入5.75ml(0.33vol)KAc(5M),轻轻颠倒混匀,冰浴30min。
4℃,5000g,离心20min。
吸取上清到新的50ml离心管内,加入1 vol氯仿:异戊醇:苯酚(25:24:1)萃取,10min。4℃,4000g,离心10min。
吸取上清到新的50ml离心管内,加入1 vol氯仿:异戊醇(24:1)萃取,10min。4℃,4000g,离心10min。
吸取上清到新的50ml离心管内,加入130 ul RNase A(10mg/ml),37℃水浴2h。
加入1/10 vol KAc(5M)和1 vol异丙醇,轻轻混匀,室温静止5min。4℃,10000g,离心30min。
去上清,用70%乙醇清洗,4℃,10000g离心10min。
去上清,室温下风干15min左右。
加250ul TE,轻弹助融,65℃金属浴2-5min,保存于-80℃。
试剂配制
Buffer A: 0.35M sorbitol (山梨醇)
0.1M Tris-HCl,PH9
5mM EDTA,PH8
Buffer B: 0.2M Tris-HCl,PH9
50mM EDTA,PH9
2M NaCl
2% CTAB
Buffer C: 5% Sarkosyl(N-lauroylsarcosine sodium salt) 十二烷基季胺酸钠
Potassium Acetate 5M (KAc precipitate polysaccharides) PH7.5
RNase A (10mg/ml)
Proteinase K (20mg/ml)
PVP 1% 聚乙烯吡咯烷酮
Chloroforme:Isoamylalcool(24:1)
Sodium Acetate(KAc) 3M
Isopropanol 100% 异丙醇
Ethanol 70%
Lysis Buffer For 17.5ml
2,5 vol of buffer A 6.5ml
2,5 vol of buffer B 6.5ml
1 vol of Buffer C 2.6ml
PVP 1% 1.75ml
Proteinase K 125ul