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拟南芥蛋白磷酸化水平检测
Author: 张报, updated date: , view: 58, Q&A: 0

Procedure

IP-Phosphorylation level Assay protocol

1.     0.5g叶片,将其放入液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨,致其成为细粉状,将粉末放入预冷的2ml离心管中,加入0.5ml lysis buffer.

2.     放入4度,360°摇床50min

3.     13000rpm 415min 吸上清,重复一次。(50ul作为input)

4.     预处理beads,每个样品加25ul beads,用lysis buffer(不含有cocktail,PMSF 但是添加Triton-100,DTT),500ul 2500g 42min。重复一次(注:把lysis buffer加入beads中先轻柔混匀,冰上静置1min 再离心,吸上清过程中不要吸出beads,适当留点液体。)

5.     将上清都加入预处理过的beads中,放入4度,360°摇床3h

(注:孵育3h这段时间先跑input 作为Actin内参)

6.     离心,2500g 42min

7.     丢弃上清,用lysis buffer(不含有cocktail,PMSF 但是添加Triton-100,DTT),500ul 2500g 42min,重复三次。最后一次尽量吸干净上清

8.     加入50ul elution buffer,室温用手轻柔混匀5min(若样品多,则分批次做,一次最好操作两个样品),离心2500g RT 2min

9.     加入5ul平衡液,加入10ul 6XSDS(提前99度预热的)37度孵育10min,点样。(后面按照Western Blot 进行操作)

 

10.  80V预电泳30min,后调成150V电泳。当目的条带电泳至分离胶中间时,停止电泳。用单蒸水轻轻清洗玻璃板,取出蛋白胶,切去浓缩胶,可以在分离胶的左上方切去一个小角以辨别方向。然后迅速置于1xTGM中。ATTENTION: 1 1x Running Buffer 至多使用两次。

 2 若是奇数块胶,注意配平,夹紧。

11.转膜

 1 依次向半干转系统叠放:厚的滤纸(Extra thick blot paper/Filter paper)→3mm滤纸(Nitrocellulose Membranes)→蛋白胶→3mm滤纸厚的滤纸,每放一层,倒上1xTGM(半干转200ml左右就足够,湿度转需要1.5L4度保存) 浸湿(缓慢的将膜一点一点的放入,使膜完全浸湿)。叠放完后,用玻璃试管擀气泡,不能太用力。

ATTENTION:   1  厚的滤纸至多使用两次,第一次使用时转膜可以不加3mm滤纸,第二次使用时必须用3mm滤纸,厚滤纸使用一次后用单蒸水浸泡2-3次,再晾干后使用。

               2  膜的大小为8.3cm x 5.6cm(差不多就是胶的大小)。

               3  盖住仪器盖子时请注意对准方向。

               4 电源为高压电泳系统。

               5 蛋白分子质量 M<50KDa24V30min

                              M>50KDa24V30-40min(实践经验需要1h30min

                              M.>100KDa,湿转 24v,过夜) 

12. 1染色脱色

  转膜完成后,取出膜迅速置于旁素染液中,染色1min,回收Ponceau S染料。(Ponceau S,根据使用频率配制一定的量储存,每次使用2-3ml,用完后可回收,每次使用会有损失,带其快用完后再配新的)

  用灭过菌的ddH2O漂洗两遍。拍照(染色这里染得蛋白,看你的转膜效率。拍照需要拍下来rubisco,内参,代老师实验室用的是actin的抗体,更准确相对来说)

  1x TBST4度) 漂洗两遍。

2封闭

  1x TBST 配置5% nonfat milk(一张膜,10ml即可,用摇床摇匀脱脂牛奶再使用),室温,摇床,1h

  1x TBST迅速漂洗一次。

3 一抗

1x TBST 配置1% nonfat milk 10ml,加一抗2ul4℃,摇床,16h,回收一抗。

ATTENTION: 1 一抗可以使用五次,注意回收。(有的实验室是封闭4度过夜,一抗室温几个小时,你可以自己查查区别)

4 二抗

1x TBST漂洗,8min。重复一次。

1x TBST 配置1% nonfat milk 10ml,加二抗1ul。室温,摇床,30min。(二抗不回收,羊抗兔,羊抗鼠根据一抗的来源确定)

1x TBST漂洗,室温,摇床,8min。重复一次。

照膜

显色液配置,体积比Luminal/enhancer SolutionPeroxide Solution = 11

8.3cm x 5.6cm 大小的膜需要1.2ml 显色液),蛋白膜需与此混合液充分接触。

 

IP Lysis buffer配方:

10% glycrerol

50Mm Tris-HCl(PH7.5)

150mM Nacl

0.5% Triton 100

2mM DTT

1 mM EDTA(PH8.0)

1Xcocktail PMSF

 

抗体:

一抗:Anti-GFP 1:5000 10ml TBST中加2ul(鼠抗)

Anti-P-Thr 1:1000 10ml TBST中加10ul(兔抗)

Anti-Actin 1:5000 10ml TBST中加2ul(鼠抗)

二抗:

Goat anti Mouse IgG :1:10000 10ml TBST中加1ul

Goat anti Rabbit IgG :1:10000 10ml TBST中加1ul

 


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