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Formaldehyde modified adhesive -Northern blot
Author: Feng Li, updated date: , view: 47, Q&A: 0

Materials and Reagents



琼脂糖

0.6g(1.2%)

无RNase水

36ml

10×MOPS

5ml

37%甲醛

9ml



 

 


Procedure


1制胶

琼脂糖

0.6g(1.2%)

无RNase水

36ml

10×MOPS

5ml

37%甲醛

9ml

将琼脂糖加水用微波炉融化后,加10×MOPS,待胶冷却至60°C左右,再加甲醛,混匀后立即灌入垂直电泳两块玻璃板之间,插入梳子,插入梳子尺长度的三分之二即可,以免拔梳子的时候把胶破坏。


2 备核酸样、上样、垂直电泳

120ug提取样于1.5ml 离心管,真空浓缩机浓缩(10ul/10min);

220ul 50%formamide稀释浓缩后的Sample RNA,用枪头打散(-20℃冰箱保存);

365℃,3~5min变性,冰浴>3min

4add 4 ul loading buffer

5)将凝胶(同玻璃夹层)转移到垂直电泳仪(长玻璃平板朝外),加上适量1X MOPS buffer作为电泳液,拔掉梳子;

6)点样:20ulSample RNA全部点进孔内,每板至少有1Marker

7)电泳:100v恒压,2h,直到下面的染料跑到整个胶的2/3位置miRNA在上面染料下面一点);

 

 

 

3转膜(半干法转膜)

1) 取膜:裁取适当的膜12X13 cm UV N+

2)取滤纸:16张,12X13cm

3)电转:用1XMOPS buffer将滤纸浸润,赶走气泡。

红色底盘(+ 8层滤纸  UV 凝胶   8层滤纸 -)黑色底盘

恒流:电压调到最大,1mA /cm21h30min

【核酸向正极移动,所以NX膜放在凝胶与正极之间】

 

 

 

4紫外交联

1) 将预进行紫外交联的溶液取0.6ul点在N-X膜上,快速点样,尽可能减少在进行紫外交联之前样品干掉。

2) 将上样完毕的N-X放进紫外交联仪【CL-1000 Ultraviolet Crosslinker】(为了避免污染膜可以在交联的时候在N-X膜下面垫上一层滤纸),调整TIME1ENERGY1200,然后进行START

3) 交联两次;

4) 交联完的膜可以用亚甲基蓝染色,查看转膜后样品情况;

5) 交联完成之后的膜装于保鲜袋封口,常温保存。

5探针标记

Biotin-18-dCTP标记

1)于200ul离心管配制如下体系:

Name

Initial Conc

Final Conc

Volume/ul

ddH2O

——

——

4ul

Probe-Hp

10uM

1uM

1ul

Biotin-dCTP

1mM

100uM

1ul

dATP

1mM

100uM

1ul

T4 DNA Pol



1ul

5X T4 DNA Pol Buffer

5X

1X

2ul

2)上述体系,于PCR25℃,15min37℃,1h反应;

34℃,>=10min终止反应;

1) add 50ul phenol chloroform mix,涡旋, 13000rpm离心, 1~2min

2) 取上清,add 50 ul chloroform,涡旋, 13000rpm离心, 1~2min

3) 取上清,探针制作结束,-20℃冰箱保存。


同位素标记实验

 

名称

浓度

用量ul

DNA Oligo

10uM

2

ATP/同位素

10uM

3

PNK Buffer

10 X

1

PNK

10 unit/ul

1

ddH2O

to 10 ul

to 10 ul

 

 

6杂交

1) 交联之后的膜用超纯水润湿,正面朝内卷起来,放进杂交管,使其紧贴杂交管内壁;

2) add 8ml 杂交液(pergectHybhybridazation buffer37℃欲杂交20min

3) add 10ul同位素标记的探针,37℃杂交过夜(8~12h);

4) 杂交完毕后,倒掉杂交液;;

5) 第一次洗膜,用2XSSC /0.1%SDS  3720min

6) 第二次洗膜,用0.5XSSC /0.1%SDS  3720min(生物素杂交完不用进行这两步洗膜)

7) 从杂交管取出膜,用滤纸吸干表面的水分(保鲜袋短时间封存)

 

 

7显影

试剂盒显影(dection of immobilized nucleic acids——10*10cm的膜)(生物素)

1)缓慢预热blocking buffer 4x wash buffer to 37~50℃,直到内部沉淀全部溶解;

2)在容器中加 16ml blocking buffer,轻微晃动温育 15 min ;

3)准备conjugate/blocking buffer

50ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate to 16ml blocking buffer

4)倒出2)中的blocking buffer ,加16ml conjugate/blocking buffer,轻微晃动温育 15 min ;

5)准备1x wash buffer

40ml 4x wash buffer 120ml 超纯水混匀】

6)倒出conjugate/blocking buffer,超纯水清洗容器,加20ml 1x wash buffer,轻微晃动温育 5 min ,共清洗四次;

7)倒出1x wash buffer,超纯水清洗容器,加30ml Substrate Equilibration buffer,轻微晃动温育5 min

8)准备chemiluminescent Substrate Working Solution

12ml Luminol/Enhancer Solution +12ml Stable Peroxide Solution

9)倒掉Substrate Equilibration buffer,超纯水清洗容器,捏住滤纸的一角在滤纸上蘸干多余液体,用12ml chemiluminescent Substrate Working Solution 静置温育5min

10)移走膜,将膜直立在滤纸上,2~5s吸干水分(但不要让膜干掉);

11)用保鲜膜将其完全包裹,等待照膜;

照膜

照胶仪照膜

4) 打开照胶仪,选择Chemidoc XRS ;

5) 打开EPI WHITE”灯,调整焦距,然后将曝光调到最大,“EPI WHITE”灯,关闭“select”——“chemiluminescence”,点“Live/Focus”,调时间和曝光次数;

X片显影

夹片——显影液——水——定影液

显影液配方:D-19型高反差强力显影液

温水 800ml50-60度)

对苯二酚(几奴尼 9g

对甲氨基酚硫酸盐 3.5g

无水碳酸钠 40g

无水亚硫酸钠 60g

溴化钾 3.5g

水定容至1000ml

定影液配方:

温水(60-70度) 600ml

结晶硫代硫酸钠 240g

无水亚硫酸钠 15g

醋酸 48ml

硼砂 7.5g

钾矾 15g

定容至1000ml


同位素显影

1)6中洗完的膜用保鲜膜封起来压磷屏8-12h(正面贴着磷屏)

2)压好的磷屏用仪器扫描显影

9回收膜

1) stripping buffer于杂交管68℃,预热;

2) 预热之后,将膜放进杂交管,68℃,20min,洗两次;

3) 洗膜结束,将膜表面的水吸干,保鲜袋常温保存。


 

 

 


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