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酵母双杂交
Author: 杨千惠, updated date: , view: 65, Q&A: 0

Materials and Reagents

1   试剂的配置

1.1   YPAD培养基

1)1* YPAD的培养基(1L为例)

10g   酵母粉(yeast   extract),20g 细菌蛋白胨(Bacteriological   peptone)

调节ph到5.8

0.04g   腺嘌呤硫酸盐(Adenine   sulfate), 补d2H2O到达960mL, 如果是固体培养基加16g Agr

高压蒸汽灭菌

加过滤灭菌的40 mL的50%(W/V) C6H12O6   ;     总体积1L

2)0.5* YPAD的培养液

5g   酵母粉,10g   细菌蛋白胨,调节ph到5.8

0.04g   腺嘌呤硫酸盐,   补d2H2O到达980mL, 如果是固体培养基加16g Agr

高压蒸汽灭菌

加过滤灭菌的20 mL的50%(W/V) C6H12O6   ;     总体积1L

3)2* YPAD的培养液

20g   酵母粉,40g   细菌蛋白胨,调节ph到5.8

0.04g   腺嘌呤硫酸盐,   补d2H2O到达920mL, 如果是固体培养基加16g Agr,

高压蒸汽灭菌

加过滤灭菌的80 mL的50%(W/V) C6H12O6   ;     总体积1L

 

1.2   SD 培养基(500mL为例)

3.33g   酵母氮源(Difco   yeast nitrogen Base)补d2H2O到达430mL, 如果是固体培养基加8.3g Agr

高压蒸汽灭菌

加过滤灭菌的20 mL的50%(W/V) C6H12O6 ;     总体积450 mL

加50mL  Dropout 溶液      总体积450 mL

 

1.3   10*Dropout 溶液

1) Dropout 溶液(四缺)(1L为例)

异亮氨酸(L-Isoleucine) 0.3g; 缬氨酸(L-Valine) 1.5g;

精氨酸硫酸盐(L-Arginine HCl)0.2g;赖氨酸(L-lysine HCl)0.3g;

甲硫氨酸(L-Methianine)0.2g; 苯丙氨酸(L-Phenylalanine) 0.5g

尿嘧啶(L-Uracil)0.2g; 谷氨酸(L-Glutamic   acid) 1g;

丝氨酸(L-Serine) 4g;补d2H2O到达900mL       所有固体融化后倒入1L蓝盖瓶中,再加酪氨酸(L-Tyrosine)0.3g (注意:酪氨酸难溶于水,所以直接加到瓶中,不需要融化)

高压蒸汽灭菌

苏氨酸(Threonine) 2g;天冬氨酸(Aspartic acid) 1g;补d2H2O到达100mL

70℃水浴搅拌,直到所有固体融化后      过滤灭菌,再将其加到高压灭菌的1L蓝盖瓶中       1L (注意:天冬氨酸难溶于水,所以需要水浴)

充分摇匀后,4℃保存

2) 100*四缺溶液(100mL为例)

腺嘌呤硫酸盐(L-Adenine   sulfate) 0.2g, 补d2H2O到达100mL, 固体融化后倒入100mL蓝盖瓶中      高压蒸汽灭菌,充分摇匀后,4℃保存

亮氨酸(L-leucine)1g, 补d2H2O到达100mL, 固体融化后倒入100mL蓝盖瓶中      高压蒸汽灭菌,充分摇匀后,4℃保存

色氨酸(L-Tryptophan) 0.2g, 补d2H2O到达100mL, 固体融化后倒入100mL蓝盖瓶中      过滤灭菌,充分摇匀后,4℃保存

组氨酸盐酸盐(L-Histidine   HCl monohydrate)0.2g, 补d2H2O到达100mL, 固体融化后倒入100mL蓝盖瓶中      高压蒸汽灭菌,充分摇匀后,4℃保存

(注意:筛选培养基的配置:90mL SD + 10mL 10*Dropout 溶液 + 1mL 100*四缺溶液!)

 

1.4   10*LiAc 溶液

1M LiAc ,用醋酸缓冲液调节pH到7.5     高压蒸汽灭菌,充分摇匀后,4℃保存或者室温保存

 

1.5   50%(W/V)PEG 3350

PEG 50g, 补d2H2O到达100mL     高压蒸汽灭菌或者过滤灭菌,充分摇匀后,4℃保存或者室温保存

 

1.6   10*TE buffer

100mM Tris-HCl(pH7.5),10mM   EDTA(pH8.0)     高压蒸汽灭菌,充分摇匀后,4℃保存或者室温保存

 

1.7   X-α-gal

储存浓度:20mg/ mL   1.5 mL棕色离心管,-20℃保存(注意: X-α-gal粉末用DMF溶解!)

工作浓度:40μg/ mL

 

1.8  溶壁酶

储存浓度:50U/ μL     1.5 mL离心管,-20℃保存(注意: 用TE溶解!)

工作浓度:5U/ μL

 


 


Procedure

1   酵母双杂实验方法

2.1 酵母快速转化(单转&双转)

2.1.1实验材料

1)YPAD的平板;50mL YPAD的培养液(250的锥形瓶;)SD平板;

2)使用前不要灭菌的:10mg/μL ssDNA; YH2Gold的原始酵母菌株;96孔板;

3)使用前要灭菌的:

50%(W/V) PEG3500;1ML liAc;,50%(W/V) C6H12O6; d2H2O; 1.5ml离心管; 50ml离心管;镊子;黄枪头;蓝枪头;白枪头;30-60%的甘油;

 

2.1.2实验步骤

1)从-80℃的冰箱中取出YH2Gold的原始酵母菌株,在YPAD的平板上划线,放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。

2)2-3天后,将划线的平板上,取出。将50mL的YPAD的培养液中加入2mL 50%的C6H12O6,摇匀后,吸取1mL的培养液加入1.5ml离心管,备用。

3)用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落,将其刮在含有YPAD溶液的1.5ml离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:振荡这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,使其生长变得缓慢!)

4)将离心管中的菌液吸取到50mL的YPAD的培养液中,封好,放置在30℃,200-230rpm/min的摇床,过夜。(一般16小时左右即可进行下面的实验)

5)从过夜的培养液中吸取1.4mL到1.5ml离心管中,用离心机最大转速离心30s,弃上清,重复一次,即收集2.8mL培养液中的菌体。(一般情况下,一个转化同时做2管!)

6)向1.5ml离心管中菌体加入700mL的双蒸水,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:清洗这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起影响转化效率!)。

7)用离心机最大转速离心30s,弃上清。

8)按照如下顺序加溶液:

50%(W/V) PEG3500

240μL

1ML liAc

36μL

10mg/μL ssDNA

10μL

质粒

4μL

d2H2O

70μL

总体积

360μL

  如果是共转的情况,每个质粒加4μL,d2H2O只加66μL。

  (注意:ssDNA在使用前,必须99℃加热10min,然后冰浴10min,在加ssDNA前必须振荡混匀!)

9)将上面步骤中所有液体加好后,在涡旋仪上振荡1min,使其充分混匀。

10)42℃水浴1小时,每隔10min,将离心管轻轻的上下颠倒几次。(这一步的目的是为了防止菌夜沉入管底,影响转化效率!)

11)用离心机最大转速离心30s,弃上清,加入200μL的d2H2O,在涡旋仪上振荡1min,使其充分混匀。

12)将200μL菌液涂在对应的单缺或者双缺的SD平板上。放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。

13)将平板上长出的酵母菌,挑选几个长势优良的,划在另一块新的SD平板上,进行扩大培养。(这一步主要是方便后面进行mating!)

14)将正确的菌用30-60%的甘油进行-80℃存放。同时如果不确定质粒是否转对,可以进行对应的酵母菌液PCR。

 

 

1.2     Mating(多用于筛库)

2.2.1实验材料

1)SD培养基(已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液):

50块SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(150mm)(一般提前2天倒好,放在超净工作台!);

2块SD/-Trp-Leu平板(90mm);

2块SD/-Leu平板(90mm);

2瓶50mL SD/-Trp的培养液

1瓶10mL SD/-Trp的培养液

2)YPAD的培养液(已经加好了对应的葡萄糖):

  1* YPAD的培养液:50mL

  0.5* YPAD的培养液:2瓶50 mL,2瓶10 mL;

  2* YPAD的培养液:2瓶45 mL,2瓶10 mL ;

3)使用前需要灭菌的: 1.5ml离心管; 50ml离心管;2L的锥形瓶,黄枪头;蓝枪头;白枪头;50%(W/V) C6H12O6; d2H2O;镊子;

4)使用前不需要灭菌的:96孔板;含有bait的Y2HGold的酵母菌株;50μg/mL kanamycin solution ;载玻片;盖玻片;酵母文库;

 

2.2.2实验步骤

1)吸取1mL SD/-Trp的培养液加入1.5ml离心管,备用;

2)单转得到含有bait的Y2HGold的酵母菌株,(承接2.1.2中的13)的内容),在活化的从平板上,用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落,将其刮在含有SD/-Trp溶液的1.5mL离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:振荡这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,使其生长变得缓慢!)

3)将离心管中的菌液吸取到SD/-Trp的培养液中,封好,放置在30℃,200-250rpm/min的摇床,过夜。直到OD值到达0.8(16-20小时)。(注意:根据实验经验,OD值在0.75-0.8之间的mating效率最好!)

4)用50 mL离心管收集菌液, 1000g/min ,离心3min, 弃上清。

5)从10mL SD/-Trp的培养液吸取1-2mL,悬浮菌体,加入2L的锥形瓶中。

6)按照上一步,重复悬浮两次,确保大部分菌体都加到2L的锥形瓶中。

7)向45 mL 2* YPAD的培养液加入50μL 50μg/mL Kanamycin,向10 mL 2* YPAD的培养液加入10μL 50μg/mL Kanamycin。

8)将融化(注意:因为酵母文库放在-80℃冰箱,提前半个小时将其取出,都放在冰上融化后,在放置在室温10min以上!)的酵母文库吸取10μL进行梯度实验,其余的酵母文库都加到2L的锥形瓶中。

 

文库梯度实验:

a:   将10μL菌液加到990μL d2H2O,振荡1min;

b:从a吸取100μL液体到900μL d2H2O,振荡1min;

c:从b吸取100μL液体到900μL d2H2O,振荡1min,吸取100μL液体涂在SD/ -Leu平板;(浓度:1*10-5mL);

d:   从c吸取100μL液体到900μL d2H2O,振荡1min,吸取100μL液体涂在SD/- Leu平板;(浓度:1*10-6mL);

将2块SD/ -Leu平板放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。

9)从10 mL 2* YPAD的培养液(加有Kanamycin)吸取1mL, 悬浮菌体,加入2L的锥形瓶中

10)按照上一步,重复悬浮两次,确保文库都加到2L的锥形瓶中。(注意:尽量使用同一个枪头文库中所有的菌液都加到2L的锥形瓶,不然会影响双杂效果!)

11)将45 mL 2* YPAD的培养液(加有Kanamycin)加到2L的锥形瓶中,封好。

12)放置在30℃,30-50rpm/min的摇床,过夜。(20-24小时)。

13)20小时后,可以取10μL的mating菌液,放在显微镜(40*)下检测,观察是否大规模的出现了像“米老鼠的脸”这样的两个酵母粘在一起的现象,如果出现可以进行下一步,如果没有,则继续在摇床上培育4小时。(一般为了防止菌液的浪费,只有第一次mating时,进行镜检,如果第一次筛库成功,第二次至最后一次筛库,可以不需要镜检!)

14)向2瓶50 mL 0.5* YPAD的培养液加入50μL 50μg/mL Kanamycin,向10 mL 0.5* YPAD的培养液加入10μL 50μg/mL Kanamycin。

15)用50 mL离心管收集mating菌液,编为1号离心管;然后用50 mL 0.5* YPAD的培养液(加有Kanamycin)冲洗2L的锥形瓶,收集冲洗的菌液,编为2号离心管;再重复冲洗一次,收集冲洗的菌液,编为3号离心管。

16)将3瓶菌液,1000g/min ,离心3min, 弃上清。

17)从10 mL 0.5* YPAD的培养液(加有Kanamycin)吸取0.8 mL, 悬浮3号管中菌体,加到1号管中,再重复二次,加到1号管。(注意:尽量使用同一个枪头!)

18)按照上一步,悬浮2号管,加到1号管,再重复二次,加到1号管。(注意:这样做可以尽量减少菌液的损失,减少对酵母双杂的结果的影响!并且尽量使用同一个枪头!)

19)再将1号管的菌液悬浮起来,将10 mL中剩下的 0.5* YPAD的培养液加到1号离心管中,混匀,吸取10μL进行梯度实验。将剩下的菌液涂到50块SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(150mm)。(每次涂布前,吸取的菌液要混匀,涂布的过程尽量快速,因为菌液干的比较快!)

mating梯度实验:

a:   将10μL菌液加到990μL d2H2O,充分混匀, 吸取100μL液体涂在SD/-Trp-Leu平板;(浓度:1*10-4mL);

b:从a吸取100μL液体到900μL d2H2O,充分混匀后,吸取100μL液体涂在SD/-Trp-Leu平板;(浓度:1*10-5mL)

将2块SD/-Trp-Leu平板放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。

20)将50块SD平板放置在30℃的培养箱中,培养5-15天。

 

2.2.3 mating效率计算

由于本人数学不佳,直接采取举例的方法:

公式:

效率=1 mL mating菌液中菌的数目/1 mL文库中菌的数目*100%

 

假设:

在文库梯度实验中,在浓度为1*10-5mL的平板上有200个菌落;在浓度为1*10-6mL的平板上有34个菌落;取200为有效数字,则1 mL文库中菌的数目为:2*107个。

在mating梯度实验中,在浓度为1*10-4mL的平板上有100个菌落;在浓度为1*10-5mL的平板上有7个菌落;取150为有效数字,则1 mL mating菌液中菌的数目为:1*105个。

则mating效率为1*105个/2*107个*100%=5%

(注意:酵母筛库成功的检验方法:在文库酵母数目大于2*107个的前提下,mating效率大于2%,即本次筛库过程中,发上了共转的酵母超过1百万个!)

 

 

1.3    筛到酵母检测

2.3.1实验材料

1)SD培养基(已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液):

SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(150mm)

SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(90mm)

SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板(90mm)

SD/-Trp-Leu/平板(90mm)

10mL SD/-Trp-Leu的培养液

2)使用前需要灭菌的: 1.5ml离心管; 50ml离心管;黄枪头;蓝枪头;白枪头;50%(W/V) C6H12O6; d2H2O;镊子;

 

2.3.2实验步骤

1)将四缺平板上筛库得到的阳性克隆,划在另一块新的SD/-Trp-Leu/平板(90mm)上,进行扩大培养。

2)吸取1mL d2H2O加入1.5ml离心管,备用。

3)从扩大培养的平板上,用黄枪头挑选酵母菌落,将其刮在含有d2H2O的1.5mL离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。

4)测定对应的OD值,根据不同的检测方法,将菌液稀释到对应的OD值

 (注意:检测酵母阴阳性的时候,一般采用点菌的方法,一般是吸取5μL的菌液点在平板上,因为酵母的浓度,会对结果的判断产生影响,尤其是X-α-gal的显色实验!)

a.四缺平板梯度实验:

  一般将浓度稀释成OD值:0.2,  0.02,  0.002,0.0002进行点菌,放置在30℃的培养箱中,培养3-5天。

  如图所示,为点菌72小时后的结果:

 

b. SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板实验:

 

 


 

一般将浓度稀释成OD值:0.2和0.5进行点菌,置在30℃的培养箱中,培养1-3天。(注意:由于X-α-gal需要避光,操作时尽量快速,平板可以用锡箔纸包着,再放到培养箱!阳性和阴性对照是必须的!)

5)将正确的酵母菌用30-60%的甘油进行-80℃存放。

 

 

1.4    酵母质粒的提取

2.4.1实验材料

1)10mL SD/-Trp-Leu培养液(50的锥形瓶)(已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液);

2)使用前不要灭菌的: 96孔板;5U/μL溶壁酶;20%SDS;小提试剂盒;

3)使用前要灭菌的:

50%(W/V) C6H12O6; d2H2O; 1.5ml离心管; 50ml离心管;镊子;黄枪头;蓝枪头;白枪头;30-60%的甘油;

 

2.4.2实验步骤

1) 吸取1mL SD/-Trp-Leu的培养液加入1.5ml离心管,备用。

2)用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落,将其刮在含有SD/-Trp-leu溶液的1.5mL离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:振荡这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,使其生长变得缓慢!)

3)将离心管中的菌液吸取到SD/-Trp-leu的培养液中,封好,放置在30℃,200-250rpm/min的摇床,过夜(16-24小时 )。

4)从过夜的培养液中吸取0.5mL到1.5ml离心管中,加入30-60%的甘油,进行-80℃存放。

5)从过夜的培养液中吸取1.4mL到1.5ml离心管中,用离心机最大转速离心1min,弃上清,重复一次,即收集2.8mL培养液中的菌体。

6)向1.5ml离心管中菌体加入700mL的双蒸水,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:清洗这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,不能充分结合溶壁酶,从而影响质粒提取效率!)。

7)用离心机最大转速离心1min,弃上清,使剩余的液体大约50μL。

8)加入10μL的5U/μL溶壁酶 (Sigma, L2524),在涡旋仪上振荡1min,放在37℃摇床,200-250rpm/min,摇1小时。(注意:酵母细胞壁的厚度约为0.1-0.3微米,其主要组成部分为D-葡聚糖和D-甘露聚糖,所以破壁特别重要!而且以上操作都在超净工作台!)

9)加入10μL的20%SDS,在涡旋仪上振荡1min,放在-20℃,至少20min。

10)在涡旋仪上振荡1min,按照小提试剂盒的步骤,加Buffer E1直到总体积为250μL。

11)按照小提试剂盒的步骤,加250μL Buffer E2,静置10min。(静置特别重要,因为酵母的细胞壁太厚了!)

12)接下来的步骤全部按照小提试剂盒来操作。

13)将10μL的质粒转到DH5α的感受态中,再从DH5α提取质粒,送测序。

(注意:如果觉得上述步骤很繁琐,你可以购买酵母质粒提取试剂盒!)

 

 

1.5    酵母对照实验

阳性对照:Y2HGold [pGBKT7-53] & Y187 [pGADT7-T]

阴性对照:Y2HGold [pGBKT7-Lam] & Y187 [pGADT7-T]

检测是否存在自激活现象:

pGBKT7/Bait + Empty pGADT7, 是否使X-α-gal的平板变蓝,没有变蓝(菌落周围的培养基没有变蓝),则不存在这种现象。


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