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小鼠脑组织冰冻切片
Authors: Yongjie Hou, Yang Chen, JINYUN WU, Yanyun Du, Qi Qi Zhang, TR Zhang and Miao He, updated date: , view: 173, Q&A: 0
Tags: 小鼠 and 切片

Materials and Reagents

1.   OCT(SAKURA, 4583)

2.   刀片(Leica 819 Low profile microtome blades)

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3. 带正电荷的载玻片(Fisherbrand Cat 12-550-15);或加有1XPBS的24/48孔板(国产)

图片.png图片.png

4. 细毛笔(华虹345)

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5. 防卷板(Leica, 14047742497)

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6. 1XPBS







Equipment

冰冻切片机(Leica)

图片.png

Procedure

1.包埋样品

1)灌流固定及后固定后的样品经10倍体积的30%蔗糖(PBS)在4度脱水至沉底(成年鼠脑通常需要2天;幼年不带颅骨的鼠脑通常需要1天,带颅骨则需更久),更换5-10倍体积的30%蔗糖,4度再度脱水12-24小时。

2)启动冰冻切片机。

3)取出脱水后的脑样品,在无尘擦拭纸上静置,充分去除水分。

4)使用2-3层铝箔纸包裹方形铝块,制作包埋模具(根据脑大小选择制作模具的大小);或使用购置的cryomold。

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5)在模具上标注样品编号和包埋时嗅球朝向的方向(铝箔纸制作的模具需在从铝块上取下之前标注,否则容易变形)。

6)按标注好的方向将鼠脑腹侧向下平放在模具中心,脑的中线与侧边平行。

7)从鼠脑中央匀速滴入OCT至鼠脑完全覆盖。若鼠脑位置有变动,可用镊子或10微升枪头调整。若有气泡,需用枪头吸出。

8)迅速将鼠脑放置到冰冻切片机的快速冷冻位上冷冻至OCT完全凝固。

 

9)包埋后的样品可放入负80度冰箱低温保存。

注意事项:

1)鼠脑表面必须完全干燥。若不确认,可用OCT迅速润洗一遍再放入模具。表面遗留30%蔗糖将导致切片时OCT与样品分离。

2)OCT中不能有气泡,特别是样品附近的气泡会影响冰冻和切片效果。

3)鼠脑加入OCT后需尽快冰冻,不能长时间在室温浸泡,否则影响冰冻和切片效果。

4)建议保存方式:用12孔板或6孔板,每孔放置一个样品,在板子的盖子与底部做好标注,并做好实验记录。将板子装在去除分隔的冻存盒中,插入铁架保存。不建议散放,容易丢失样品

2.冰冻切片

1)启动冰冻切片机。将切片机冻头温度设置为-21度,刀片温度设置为-20度 (可按实际切片情况调整)

切片机操作面板1&开冻头.jpg

图为切片机控制面板,常用按键由左至右分别为:   |速冻时间&按键|机箱温度&按键|冻头温度&按键|时间|照明、锁定|

2)将从-80取出的样品放入切片机中复温至与切片机设置相同。

3)从模具中取出样品,按照切片所需的方向,将样品用OCT固定在底座上,放在速冻台上凝固固定。



4)锁住摇动把手,将刀片、样品、防卷板分别装置固定,调整样品与刀片的距离及角度,使之与刀片及刀片切割的方向平行。装置样品时需打开左部的卡槽。

a.将刀片插入缝隙,前推右侧手柄可固定住刀片,后扳手柄可松开刀片;

    安刀片2+圆.jpg

b.分别顺时针、逆时针拧冻头右上角的手柄可固定或松开冻头,从而调整冻头的角度;

    调整冻头角度.jpg

c.顺时针扳动冻头左侧的手柄可将样品的底座固定在冻头上;

d.将防卷板插入槽内,拧紧螺丝直至固定住防卷板

 

5)将切片厚度设置为100-200微米,迅速去除多余的OCT,直至接近样品(通常能看到一点肉色透出)。在切片的同时可再次调整角度,获得合适的切面。此时不需放下防卷板。

切片机操作面板2.jpg

                                   

——切片厚度

——调整切片厚度


——冻头快速后退

——冻头慢速后退

——冻头慢速前进

——冻头快速前进




6)根据实验需求设置正式切片的厚度。RNA原位杂交用贴片通常设为12-20微米;免疫组化用漂片通常设为30-50微米,贴片通常设为20-30微米。

7)放下防卷板,微调后方的旋钮以调整防卷板前后位置,使得切下的切片平滑进入防卷板之下的间并被压平整。

8)若采取漂浮收片,需预先准备加有PBS的24孔或48孔板。使用小毛笔将脑片转移到PBS中,按顺序收取。板子的盖子和侧面均应标注,避免盖板分离,样品混淆。

9)若采取贴片,需使用带正电荷的防脱玻片,将脑片平整的贴在玻片上。

将脑片转移到玻片上主要有两种方法:

a.采用室温玻片,用玻片轻触脑片的一端或中间,使OCT融化,脑片自然贴附

b.将玻片放在切片机中预冷至与样品温度一致,将切片用毛笔转移到玻片上,用毛笔展平,再用手指从玻片背侧加温,使OCT融化,脑片贴附

10)冰冻漂片的保存与振动切片相同;冰冻贴片需在室温晾置30-60分钟,再转移到负80度冻存(短期内使用可在4度保存)。在负80保存的贴片,使用前需再次晾置30分钟。

注意事项

1)检查刀片和防卷板有无豁口,若有需避开或更换

2)调节距离时避免快速撞击防卷板或刀片,以避免产生豁口

3)贴片前注意检查玻片的洁净程度,若有明显杂质附着,需更换或处理后再使用

4)贴片时勿将脑片贴在已有OCT的区域,否则容易在染色或漂洗过程中脱落

5)贴片一般分2-6套(即第一张脑片贴在第1张玻片,第二张脑片贴在第2张玻片,依次类推再循环),以便染多种抗体组合或杂交不同探针。

6)预先在玻片有色端做好标注,以免出错

7)晾片时摆放在安全的位置,避免被他人误动、撞伤或滴落不明液体

8)负80度保存的样品和切片均应避免反复冻融,因此在取部分样品/切片时动作要快,以避免影响到当次不用的样品和切片

9)切片时若出现脑片碎裂,说明样品温度过低;若出现卷片粘连,说明样品温度过高;应相应调整冻头与机腔温度,优化切片效果。



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