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小鼠基因型鉴定
Authors: Ma Liang, Xue Liu, Yuchen Liu and Miao He, updated date: , view: 86, Q&A: 0
Tag: 小鼠

Materials and Reagents

  1. 刺青/纹身染料(Ketchum)

  2.  鼠尾(或其他易消化的组织,如鼠耳、脚趾、胚胎组织等)

  3.  鼠尾裂解液(Viagen, Tail lysis buffer,102-T;4C冷柜)

  4.  蛋白酶K(生工,P0706—50mg,100×的蛋白酶K浓度为10mg/ml;-20℃冰箱)

  5. 3M醋酸钠(SIGMA-ALDRICH,127-09-3,82.03g/mol,若配置50ml的3M醋酸钠,需加入12.3g醋酸钠固体溶于50mlddH2O

  6.    异丙醇

  7.    75%乙醇

  8. PCR mix (【1】TIANDZ,90805-9×5;含上样缓冲液、dNTPs、 Mg2+稳定剂等,PCR酶单独包装,使用前加入; -20℃冰箱.【2】Thermo fisher,#K1082,-20℃,含Dream Taq DNA polymerase,optimized Dream Taq Green buffer,MgCl2 ,dNTPs.【3】 novoprotein,cat:E005-02, 2×Taq Master Mix; -20℃冰箱)

  9. PCR引物 (浓度100μM,生工或thermo fisher订购;-20℃冰箱)

  10. 琼脂糖 (BIOWEST,111860;室温)

  11. TAE(电泳缓冲液)

    50×TAE缓冲液: 配置500 ml 的缓冲液,需加入:121g Tris碱(C4H11NO3,121.14g/mol,cat:V900483-500G)28.5ml冰乙酸(C2H4O2,分子量60.05,cat:10000218,国药集团化学试剂有限公司)50ml 0.5 mol /L EDTA(C10H16N2O ,分子量292.24,cat:10009617,国药集团化学试剂有限公司)调节至pH 8.0(利用pH试纸测定溶液pH:用胶头滴管吸取少量溶液,滴一滴于pH试纸上,与标准比色卡比较,判定溶液pH值;若pH>8.0,则加入适量盐酸降低pH至8.0,若pH<8.0,则加入适量氢氧化钠提高pH至8.0);电泳时稀释为1×TAE缓冲液;室温)

  12. DNA marker (【1】TaKaRa BIO INC,3422A;4℃冷柜.【2】TIANDZ,70503X-50,4℃为使用中,-20℃未使用)

  13. 核酸染料(GenGreen GG1301-500UL;4℃冷柜)

  14. miniQ H2O(-20℃冰箱;灭菌后分装保存的)

Equipment


  1. 1ml注射器针头(KDL上海康德莱企业发展集团股份有限公司)

  2. 耳洞钳(FST)

  3. 碳钢刀片(American Line 66-0089,淘宝订购)

  4. 凝胶成像仪(ChemiDoc Touch Imaging System, Bio-Rad, 732BR0844)

Procedure

1.      小鼠剪尾和标记

a)      新生小鼠(<P7)的剪尾和标记

                 i.          标记方法:用小号注射器针头沾取适量动物用刺青染料,在小鼠脚掌中心穿刺5-8次,确保染料进入伤口,以留下永久性标记。

               ii.          标记顺序:标记时采取先前(F)再后(B)、先右(R)再左(L)的顺序(以下操作中的左右均以小鼠背部向上为基准),按照FR、FL、BR、BL、FRL、BRL、FRBR、FLBL、FRBL、FLBR、FRLBRL、FRLBR、FRLBL、FRBRL、FLBRL、NM(无标记)的顺序依次进行穿刺标记。小鼠数量过多时,可分雄雌或毛色分别进行标记。

              iii.          剪尾方法:在洁净刀片上用记号笔划分5-8个区域,依次使用割取~2mm鼠尾放入标记好的1.5ml无菌EP管中,每只小鼠换用一个区域以避免交叉污染。

              iv.          注意事项:

Ø  新生小鼠无法自行保持体温,请勿长时间在外放置,防止失温死亡。

Ø  母鼠对气味敏感,若连续处理多笼小鼠,其间需更换手套或用酒精喷手,防止小鼠染上它笼气味被母鼠攻击

Ø  鼠尾切勿割取过长!!!

Ø  剪下的组织若不立即使用,可在-20C冰冻保存数周到数月。 

Ø  标记时注意避免染料附于将取组织表面,且在盖EP管时不要碰到盖内侧,以免材料被手套上的染料或其他杂质污染

b)     分笼后小鼠(>P21)的剪尾和标记

                 i.          标记方法:使用耳标钳(F.S.T. ear punch)在小鼠耳朵上打洞。

               ii.          标记顺序:标记时采取从右到左的顺序,按照NH(无洞)、HR、HL、HRL的顺序进行标记。小鼠数量过多时,可分雄雌分别进行标记。

              iii.          剪尾方法:在洁净刀片上用记号笔划分5-8个区域,依次使用割取~2mm鼠尾放入标记好的1.5ml无菌EP管中,每只小鼠换用一个区域以避免交叉污染。或用小剪刀剪~2mm鼠尾,放入标记好的1.5ml无菌EP管中,剪完一只后需用酒精消毒剪刀再剪下一只,防止基因污染

c)      P7-P21小鼠的标记(如非必要,不建议采用,可能影响小鼠行动)

                 i.          标记方法:用右手提起小鼠尾巴将其放在笼盖上,在小鼠向前挣扎爬行时,用左手拇指和食指贴合在小鼠身体靠近尾部位置缓缓向前推进,捏住其双耳及颈部皮肤,将小鼠置于左手掌心,无名指和小指压住其尾部,用小剪刀剪其脚趾根部,确保其愈合后断趾明显,留下永久标记。剪下的组织放入标记好的1.5ml无菌EP管中,剪完一只后需用酒精消毒剪刀再剪下一只,防止基因污染。

               ii.          标记顺序:剪中间脚趾,采取先前(F)再后(B)、先右(R)再左(L)的顺序,按照FR、FL、BR、BL、FRL、BRL、FRBR、FLBL、FRBL、FLBR、FRLBRL、FRLBR、FRLBL、FRBRL、FLBRL、NM(无标记)的顺序依次进行。

2.      DNA模板制备

a)      蛋白酶K消化:

                 i.          在鼠尾裂解液中加入蛋白酶K(100X蛋白酶K溶液1:100稀释,即配即用),颠倒混匀,低速离心。

               ii.          在装有鼠尾或其它组织的EP管中加入50μl混合液,13300rpm离心3min,确保组织完全没入液面以下。

              iii.          55烘箱消化过夜。

b)     蛋白酶K灭活(多数样品适用):

                 i.          将烘箱温度调至90℃,保温1h,令蛋白酶K变性失活。

               ii.          13300rpm离心10min,令组织残渣沉淀,取上清作为PCR模板。

              iii.          来源幼鼠的PCR模板可在4C保存一周至数周;来源成年鼠的PCR模板杂质较多,不宜长时间保存。

c)      DNA简单纯化(PCR不稳定或产物长度>1.5kb样品适用;纯化前请勿90℃灭活!

                 i.          在装有鼠尾或其它组织的EP管中加入50μl含蛋白酶k的鼠尾裂解液,13300rpm离心3min,确保组织完全没入液面以下。

               ii.          55烘箱消化过夜。

              iii.          13300rpm离心10~15min,将上清转移到新管中,以去除毛发骨头等各类杂质。

              iv.          向EP管中加入450μl miniQ H2O和50μl3M醋酸钠(终体积的1/10),充分混匀,13300rpm离心10min。

               v.          在不触动沉淀的前提下,将上清用200μl移液枪转移至新的EP管中,加入预冷的异丙醇500μl,轻柔颠倒混匀,可观察到絮状DNA析出。

              vi.          13300rpm4度离心10~15min,观察到管底部或侧面有白色沉淀。

             vii.          小心吸弃上清,加入800μl的75%乙醇于EP管中,轻柔颠倒EP管,清洗沉淀,13300rpm离心10min。

Ø  清洗后DNA沉淀会变松,极易丢失,离心后需确认沉淀回到管底。

            viii.          小心吸去75%乙醇,切勿将沉淀吸入枪头。

              ix.          低速离心10s,用10μl枪将液体尽量吸干。

                x.          开盖晾干沉淀。

Ø  晾干后DNA会变透明,溶解时需确保将水滴于DNA所在处。

              xi.          待闻不到明显酒精气味时,加入50μl miniQ H2O,反复吹吸至DNA充分溶解。

d)     DNA酚氯仿抽提(PCR不稳定或产物长度>1.5kb样品适用;纯度高,可较长期保存;抽提前请勿90℃灭活!

                 i.          在装有鼠尾或其它组织的EP管中按照1:10的质量体积比加入含蛋白酶k的鼠尾裂解液,13300rpm离心3min,确保组织完全没入液面以下。

               ii.          55烘箱消化过夜。

              iii.          13300rpm离心10~15min,将上清转移到新管中,以去除毛发骨头等各类杂质。

              iv.          如体积不足200 μl用miniQH2O将体积补足到200 μl。若多于,则不必补。

               v.          加入1倍体积酚氯仿,手动剧烈摇晃混匀15-30s。

              vi.          13300rpm4度离心10~15min,将上清转移到新管中。吸取时速度要慢,枪头不能接触中间层(蛋白质层),宁少勿多,杜绝污染。

             vii.          加入1倍体积氯仿,手动剧烈摇晃混匀15-30s。

            viii.          13300rpm4度离心10~15min,将上清转移到新管中。吸取时速度要慢,枪头不能接触下层,宁少勿多,杜绝污染。

              ix.          加入1/10体积的3M醋酸钠,1倍体积异丙醇(或3倍体积乙醇)。

                x.          轻柔颠倒混匀,可观察到絮状DNA析出。

              xi.          13300rpm4度离心10~15min,观察到管底部或侧面有白色沉淀。

             xii.          小心吸弃上清,加入800μl的75%乙醇于EP管中,轻柔颠倒EP管,清洗沉淀,13300rpm离心10min。

Ø  清洗后DNA沉淀会变松,极易丢失,离心后需确认沉淀回到管底。

            xiii.          小心吸去75%乙醇,切勿将沉淀吸入枪头。

            xiv.          低速离心10s,用10μl枪将液体尽量吸干。

             xv.          开盖晾干沉淀。

Ø  晾干后DNA会变透明,溶解时需确保将水滴于DNA所在处。

            xvi.          待闻不到明显酒精气味时,加入50μl miniQ H2O,反复吹吸至DNA充分溶解。 

3.      PCR

a)      PCR体系:

                 i.          引物配置

Ø  13300rpm离心10min,加入适量灭菌milliQ水,溶解到100μM(储备液,体积在管壁上有标注)或20μM(工作液)。

Ø  在漩涡混合器上剧烈震荡,令引物完全溶解后短暂离心,-20(使用中)或-80(备用;侯永洁负责)保存。

Ø  -80引物转入-20后,应立刻通知侯永洁订购备用管。

               ii.          在PCRmix中加入酶,轻柔颠倒混匀,分装为500μl/管,-20保存

Ø  使用滤芯枪头、未开封新管分装,以避免污染

Ø  用完移液枪请调回至最大量程。

              iii.          配比

即配即用

体积

X反应个数(样品数+阳性对照+阴性对照+空白对照)X1.05(多配5%体积补偿分装误差

-20保存

批量配置

2XPCR   Mix(含酶)

10μl

2XPCR   Mix(含酶)

500μl

灭菌milliQ水

9μl

灭菌milliQ水

440μl

上游引物(20uM)

0.1μl

上游引物(100uM)

5μl

下游引物(20uM)

0.1μl

下游引物(100uM)

5μl

分装体积

19μl

总体积

990μl

              iv.          分装入8联管(19μl/管),加入1μl模板,盖盖,桌面离心机离心10s,放入PCR仪。

Ø  从中间向两边盖,以防止不匹配或无法盖牢

Ø  注意盖子和管子的品牌是否一致,否则可能盖不紧或长度不对

b)     PCR程序及优化:

                 i.          93-95℃预变性2-5min (温度和时间应根据订购的酶/PCR mix特性,参考说明书设定)

               ii.          93-95℃变性15-30s,50-72℃退火30s,68-72℃延伸45s,循环30-35次

              iii.          68-72℃延伸2-10min (温度和时间应根据订购的酶/PCR mix特性,参考说明书设定)

              iv.          20℃维持(及时取出,勿长时间放置,否则会损耗PCR仪寿命)

               v.          注意事项:

Ø  不同公司的酶对变性温度及时间、延伸温度及时间的要求不同,请按说明书操作!

Ø  退火温度(Ta)可根据引物Tm进行调整(一般Ta≤Tm-5)

Ø  延伸时间根据产物长度进行调整

Ø  出现杂带可适当升高Ta,必要时进行梯度PCR测试最佳Ta

c)      PCR产物可在4℃保存数天-数周。

4.      电泳与成像

a)      凝胶制备:

                 i.          称量适量琼脂糖,加入TAE电泳缓冲液(注意不是PBS!),摇晃混合

Ø  若需分辨1kb以上的PCR产物,可用<1%的琼脂糖

Ø  300bp-1kb PCR产物,可用1%-1.5%琼脂糖(1g-1.5g琼脂糖/100mlTAE)

Ø  若需分辨200bp左右PCR产物(例如分离210bp与250bp),需用1.5-2%琼脂糖

               ii.          微波加热直至溶液清澈透明无悬浮物。

Ø  注意:每加热15s-30s拿出摇晃,防止溶液过热发生喷溅。

Ø  若使用核酸染料,全融后需等待~5min、没有明显蒸气后再加入染料,以防染料挥发;每100ml加入0.5μl染料,摇晃混匀后使用。

              iii.          适当冷却后倒入胶槽,插入梳子(避免梳子被烫弯)

Ø  注意:一般中型琼脂糖可插3排梳子

              iv.          待完全凝固(变白)后方可拔掉梳子;若急用可放入4℃冷柜加速降温。

               v.          不立刻使用的凝胶可用保鲜膜包裹,在4度保存1周-1月。

b)     电泳

                 i.          检测电泳仪中的电泳缓冲液是否干净、液面高度是否足够,决定是否需要更换或添加电泳缓冲液。

               ii.          将凝胶放入电泳仪中,确保缓冲液完全没过胶孔,且孔中无气泡。

              iii.          用专用移液枪在每孔加入8μl完成的PCR体系

Ø  注意:切勿使用配置PCR体系的移液枪加样,防止污染!!!

              iv.          在合适的位置加入5μl marker,每排至少加一孔。

               v.          设置合适的电压与时间,进行电泳。一般使用120V,电泳25min。

              vi.          注意事项:

Ø  负极(黑色)总是接在上样孔一侧;DNA带负电,往正极跑。也要注意检查电源输出端连接是否正确(红色插红色孔、黑色插黑色孔)

Ø  不使用的胶可预先切下,或电泳结束后切下,下次直接使用或重新融化制胶。

c)      成像:

                 i.          若采用EB染色(11楼公共实验室),需将凝胶放入EB溶液(20mg/ml EB,1:100,000稀释)中浸泡30min,然后放入成像系统中观察拍照。

Ø  若泡胶用EB溶液过脏,需重配更换

               ii.          若采用核酸染料进行电泳,在1016房间Biorad成像系统进行观察拍照。

Ø  注意:核酸染料背景较EB高,但对低分子量条带的显色可能比EB敏感

5.      结果分析

a)      图像处理:

                 i.          在Photoshop(PS)中打开图像,菜单栏中选择“图像”à“调整”à“反相”

Ø  反相后条带呈黑色,背景呈白色

Ø  可在菜单栏中选择“图像”à“调整”à“色阶”,调整图像显示,使条带清晰可辨

               ii.          在左侧工具栏中选择剪刀工具,调整图像大小和方向

              iii.          在左侧工具栏中选择文字工具,标注每孔所加样品的名称(调整字体大小、粗细和颜色,保证文字清晰可辨)

              iv.          存储图像

b)     图像打印和粘贴

                 i.          新建word文档,插入标注好的图像,调整至适合粘贴到小鼠记录上的大小

               ii.          打印图像,修剪粘贴

c)      图像分析

                 i.          根据marker的条带判断条带大小

               ii.          对照引物列表,判断条带大小是否符合预期

              iii.          根据条带大小判断小鼠基因型,并及时记录





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