材料与试剂

试剂

杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（dPBS）（Sigma-Aldrich，目录号：SKU D1408
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如 Thermo Fisher、Invitrogen 的片剂，目录号：003002）
多聚甲醛，37%（Fisher Scientific，目录号：F79-500）
Tween 20 洗涤剂（Sigma，目录号：SKU 11332465001）
具有 DAPI 的 Vectashield 抗淬灭封固剂（Vector Laboratories，目录号：SKU H-1200）
荧光素鬼笔环肽（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：F432）

实验室用品

胶原 IV 涂层 8 孔 µ 载玻片，#1.5 聚合物盖玻片，已灭菌（Ibidi，目录号：80822）

设备

转盘共焦装置与 Nikon Ti-E 倒置显微镜和 Zyla 4.2 sCMOS 相机相结合； 405 nm 和 488 nm 激光线； 40× NA 1.15 水浸镜头（Andor、牛津仪器型号：Dragonfly 200）
计算机工作站配备至少 8 GB RAM、AMD 或 NVIDIA 2 GB 显卡以及 1,280 × 1,024 像素的显示器。

软件

Fusion（2.3 版，Andor）。选修的;用于图像采集
Imaris（版本 9.7、9.8、9.9 或 10.0，牛津仪器）。可选，用于细胞核分割
斐济，ImageJ2 发行版（版本 2.14.0）[7,8]
Microsoft Excel（与版本无关）
Anaconda 发行版（版本 3，2023.07-2）

代码

代码可以从 GitHub 获取：https://github.com/Bergstralh-Lab/ALAn（访问日期，03/13/2024）
1. 排序规则_Imaris2ALAn.ipynb
2. ALAn_v3.ipynb

程序

细胞培养和成像（建议方法）
1. 细胞培养、固定和染色
  1. 在 Ibidi 孔中培养哺乳动物细胞。
  2. 所需的培养时间后，取出培养基并用 250 μL dPBS 清洗细胞一次。
  3. 将 200 μL 用 PBS 和 2% Tween 20 稀释的 3.7% 多聚甲醛溶液添加到孔中，并在室温下孵育 10 分钟。
  4. 用 250 μL 含 0.2% Tween 20 的 PBS 清洗细胞 3 次，在清洗步骤之间让清洗溶液在每个孔中静置 10 分钟。
  5. 用 0.2% Tween 20 在 PBS 中按 1:500 稀释荧光素鬼笔环肽，并向每孔中添加 250 μL。在 4 °C 下孵育 12–24 小时。
  6. 除去鬼笔环肽溶液，用含 0.2% Tween 20 的 PBS 冲洗 3 次。
  7. 将大约 500 μL（或至少足以完全覆盖细胞层）的 Vectashield 和 DAPI 添加到孔中。
2. 共焦成像
  1. 使用倒置共聚焦显微镜，可以通过 #1.5 聚合物盖玻片底部直接在 Ibidi 孔中对细胞进行成像。以奈奎斯特分辨率、最小 512 × 512 像素对 XY 中面积至少为 60 μm × 60 μm 的区域进行成像。
  2. 使用 488 nm 线使用 FITC 缀合的鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色，使用 405 nm 线使用 DAPI 对 DNA 进行染色。使用标准成像技术设置采集参数，以确保您利用完整的动态成像范围而不是像素饱和。
    
    注意：任何饱和都会导致 ALAn 的使用失效。
  3. 以不大于 0.5 μm 的间距进行共焦 z 堆栈，最好是奈奎斯特采样（在 Fusion 中的 Z 扫描设置中选择自动步长），从室载玻片底部下方开始，此处没有肌动蛋白 (FITC) 信号被检测到并结束于无法检测到更多肌动蛋白信号的层之上。
准备输入 ALAn 的数据
1. 使用 Imaris 分割细胞核
  1. 使用以下名称格式保存文件：“Identfier1_Identifier2_Identifier3_Identifier4.ims”，其中标识符是您要记录的实验参数（例如，“MDCKcells_GeneKnockOut1_PlatedDensity100k_48hrsGrowth.ims”）。
  2. 使用观察路径功能将要分析的文件加载到 Imaris arena 中。
  3. 选择要分析的图像并在超越视图中打开。
  4. 转至3D 视图菜单并选择单元格。
  5. 选择添加新单元格功能开始分割。
  6. 使用默认设置来分割细胞核和细胞边界（尽管我们将跳过细胞边界分割）并取消选择仅分割感兴趣区域。
  7. 使用蓝色箭头移动到细胞核检测。不要使用绿色箭头。
  8. 将源通道设置为 DNA 染色通道（使用上述协议的 DAPI 染色 405 通道）。
  9. 根据细胞类型设置预期的细胞核直径。（对于 MDCK 细胞，我们建议值为 7.3 μm。）
  10. 确保自动选择平滑特征并将宽度设置为核直径的^{1/10 。}
  11. 选择“按种子点分割核”。
  12. 使用蓝色箭头移动到过滤核种子点。
  13. 将最小品质因数设置为 4。
    
    注意：该值设置得相对较低，因为在分割过程的这个阶段，最好找到尽可能多的核。去除 ALAn 中的核很容易，但添加更多核是不可能的。
  14. 使用蓝色箭头移至核阈值。
  15. 将“核阈值（绝对强度）”设置为可在交互式视图中准确分割核的值（图 2A）。（检查以确保该值不包括直方图上与背景信号峰值相对应的峰值。如果包括，则向上调整阈值，直到超过峰值。）
    
    图 2. 显示协议关键步骤的屏幕截图。 A. Imaris 的屏幕截图，显示核分割步骤。用户必须选择一个细胞核阈值，以便准确分割细胞核，并且分割的种子尽可能不接触。 B 和 C.Jupyter Notebook 的屏幕截图，显示打开的 Collation_Imaris2AlAn (B) 和 ALAn_v3 代码 (C)。
  16. 使用蓝色箭头移至过滤核。
  17. 当阈值结束时，单击橙色 X。除非您不同意分割，否则此时不要进行任何进一步的过滤。
  18. 首先选择“统计信息”选项，然后选择“将所有统计信息导出到文件”选项，保存分段摘要统计信息。将所有 Imaris 分割文件与原始 .ims 图像文件分开保存在一个目录中会很有帮助。 Imaris 输出创建一个文件文件夹，其中包含分段核的位置和体积信息。
  19. 从 Bergstralh 实验室 GitHub下载Collation_Imaris2ALAn.ipynb 。该数据会将 Imaris 统计数据转换为可读入 ALAn 的 .csv 数据文件。
  20. 从 Anaconda 导航器打开Jupyter Notebook 。这将在默认浏览器的新浏览器窗口中打开 Jupyter Notebook。将显示计算机上文件的导航菜单。
  21. 导航到计算机上“Collation_Imaris2ALAn.ipynb”文件的位置并打开此笔记本（图 2B）。
  22. 在 Jupyter Notebook 单元 2 中运行代码，该单元导入必要的 Python 包。
  23. 定义输入目录路径，Imaris 统计文件所在的位置，位于 Jupyter Notebook 单元 3、第 6 行。
  24. 在 Jupyter Notebook 单元 3、第 11 行上定义输出目录名称，并在 Jupyter Notebook 单元 3、第 14 行上定义该目录的目录位置。这将是保存包含必要核位置的 .csv 文件的位置。
  25. 运行“Collation_Imaris2ALAn”文件中的所有代码。
2. 如果您使用不使用第 1 节中所述的 Imaris 的方法分割细胞核，则需要提供数据
  1. 分割核位置并提取有关图像文件中核的体积和质心的信息。
  2. 生成包含四列的 .csv 文件。第1列：核中心的X坐标；第2列：核中心的Y坐标；第3列：核中心的Z坐标；第 4 栏：细胞核体积。行对应于每个分段的核。
  3. 将标题添加到第 1 行。A1 = 核心位置 X； B1 = 核位置 Y； C1 = 核位置 Z； D1 = 细胞核体积。
3. 将 XY 共焦切片缩放至 512 × 512 像素。
  1. 这可以在 Imaris 的“编辑”菜单中通过选择“重新采样 3D”并将 X 和 Y 值调整为 512 来完成。确保选择“固定比率 X/Y”，而不是“固定比率 X/Y/Z”。
4. 确定图像的空间边界。
  1. 使用 FIJI 打开原始图像文件。
  2. 从图像菜单中选择显示信息。
  3. 在“显示信息”面板值 ExtMax0 到 ExtMin2 中标识图像文件的 X、Y 和 Z 空间边界。 ExtMax0 =X 最大值； ExtMax1 = Y 最大值； ExtMax2 = Z 最大值； ExtMin0 = X 最小值； ExtMin1 = Y 最小值； ExtMin2 = Z 最小值。
  4. 使用 Microsoft Excel 打开包含分段核位置的 .csv 文件。
  5. 将 E 列命名为“职位”。
  6. 将值 ExtMax0 到 ExtMin2 粘贴到 Excel 笔记本单元格 E2–E7 中。
5. 将共焦堆栈另存为 .tiff 文件，与包含细胞核分割信息的相应 .csv 文件位于同一文件夹中。这可以通过在 FIJI 中打开专有文件图像并在“文件”菜单中选择“另存为” >“ Tiff”来完成。
6. 确保包含核和层位置信息的相应 .csv 文件与包含共焦堆栈图像的 .tiff 文件具有相同的名称。 ALAn 将读取这两个文件并对这些合作伙伴文件进行分析。
使用ALAn批量处理和分析数据
1. 从 Bergstralh 实验室 GitHub 下载“ALAn_v3.ipynb”。这是主要的数据分析代码。
2. 从 Anaconda 导航器打开 Jupyter Notebook。这将在默认浏览器的新浏览器窗口中打开 Jupyter Notebook。将显示计算机上文件的导航菜单。
3. 导航到计算机上“ALAn_v3.ipynb”文件的位置并打开此笔记本（图 2C）。
4. 在 Jupyter Notebook 单元 2 中运行代码，该单元导入必要的 Python 包。
5. 将 Jupyter Notebook 单元格 3、第 7 行上的代码更改为输入伙伴 .csv 和 .tiff 文件所在的路径。
6. 在 Jupyter Notebook 单元 3 中运行代码。数据将导入到两个列表中。 .csv 文件中的所有信息都将转换为 pandas DataFrame 列表 (list_of_dfs)，所有 .tiff 将作为 4D numpy 数组列表 (list_of_unshuffled_images) 读入。任何没有同名合作伙伴文件的 .tiff 或 .csv 文件都不会添加到这些列表中。将生成第三个列表 (list_of_names) 以跟踪每个元素中存储的图像名称。
7. 检查三个列表的文件名、输入图像数量和尺寸是否相同，如 Jupyter Notebook 单元格下方的输出文本所示。
8. 在 Jupyter Notebook 单元 4 中运行代码。这将加载ALAn 的所有函数。注意：每个函数的描述及其输入和输出的描述位于 Bergstralh-Lab/ALAn GitHub 页面上的 README.md 文件中。
9. 更改代码行 Jupyter Notebook 单元格 5、第 2 行上的 batch_process 函数的输入参数。
  1. 首先，在 .tiff 文件中定义代表图像肌动蛋白信号的通道（这可以通过在 FIJI 中打开 .tiff 来确定）（0 = 第一个通道，1 = 第二个通道等）。
  2. 其次，更改您想要保存输出 .csv 文件的名称。
10. 在 Jupyter Notebook 单元 5 中运行代码。这将批量处理所有输入图像。计时器将输出运行该函数所需的时间。
11. 打开输出 .csv 文件，该文件的名称与 Jupyter Notebook 单元格 5、第 4 行中定义的名称相同，作为 batch_process 函数的最后一个参数。该目录将与您的输入文件相同。检查是否已生成有效的输出。 ALAn 的基本输出是：
  
  A 列：ALAn 对于每个输入使用的元素编号。
  
  B 列：输入 .tiff 和 .csv 文件的根名称。
  
  C栏：层数确定； ALAn 将层分为以下类别：无组织、不成熟、中级 A、中级 B 和成熟。有关这些类别的完整解释，请参阅 Dawney 等人。 [2] 和卡马罗塔等人。 [1]。
  
  D 列：基底组织层中鉴定的细胞数量。
  
  E 列：在基底组织层上方识别的细胞数量。
  
  F 列：单元格总数（D 列和 E 列之和）。
  
  G 列：每单位培养面积已识别组织层的细胞密度。
  
  H 列：已识别组织层的高度。
  
  第一列：层上方总细胞的百分比。
  
  J 列：组织平面中细胞的平均面积。
  
  K 列：组织平面中的平均细胞周长。
  
  L 列：组织平面中的平均细胞圆形度。
使用 ALAn 制作诊断/信息图和视觉效果

对于任何数据集，ALAn 的功能可用于生成诊断和数据输出及图形。在这里，我们提供了一个用于运行函数的协议，这些函数为数据分析提供了信息最丰富的图形输出。可选输入 save_name = “string” 允许您将此图保存为 .pdf。图形应在 Jupyter Notebook 中的嵌入图形中生成（由 Jupyter Notebook 单元格 2、第 16 行上的代码定义：“%matplotlib notebook”）。
1. 从batch_process函数的输出.csv文件中确定感兴趣的数据集的元素编号。
2. 在新的 Jupyter Notebook 单元中，通过键入“I = n”来定义您感兴趣的数据集，其中 n 是所选数据集的元素编号。
3. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过键入“clear_debris(list_of_dfs[i],plot = True)”来运行clear_debris 函数并运行 Jupyter Notebook 单元。该函数提供有关核分割输入识别的对象被视为真实细胞并用于分析的数据。输出显示核体积分布（以 μm ³（X 轴）为单位相对于这些体积的频率的直方图）（图 3A）。作为碎片丢弃的物体以蓝色显示，被识别为有效的核为橙色。包含被识别为真实数据点的核的 pandas DataFrame 被输出（df_cleared）并打印在图下方。
  
  图 3. 自动层分析 (ALAn) 生成的诊断和信息图。答：clear_debris 函数输出一个直方图，显示分段对象相对于输入到 ALAn 的体积的频率。橙色条代表被识别为真实的核，蓝色条代表碎片从分析中删除。虚线表示阈值体积，高于该阈值则认为核是真实的。 B. Nuclear_centroid_actin_overlay 函数输出一个图像，该图像显示叠加到投影在组织 XY 平面上的肌动蛋白信号的 .tiff 图像上的分段核的质心位置。 C. nuclei_distribution 函数输出一个图，显示肌动蛋白的投影信号（红色）和核分布（蓝色），与组织深度的高斯拟合。肌动蛋白信号的组织层顶部、底部和峰值位置由虚线显示。 D. find_shoulders 函数输出肌动蛋白信号（红色）的图以及该图（蓝色）相对于组织深度的一阶导数。肌动蛋白信号的组织层顶部、底部和峰值位置由虚线显示。 E.terrain_map 函数输出投射到组织 XY 平面上的核质心位置图，显示为点。点的大小显示了原子核的相对体积。点的颜色代表细胞核相对于组织深度的相对位置。色标从浅橙色（最基础）到紫色（最顶端）。 F. sub_classify 函数输出一个地图，表示输入 512 × 512 像素 .tiff 的 XY 视场，该图分为 100 × 100 像素部分，并按 ALAn 原始版本确定的图层类别进行颜色编码。 “草坪绿”= 未成熟，“森林绿”= 中级 A，“深绿松石色”= 中级 B，“钢蓝”= 成熟，“橙色”= 杂乱无章。
4. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过键入“nuclear_centroid_actin_overlay(list_of_dfs[i], list_of_unshuffled_images[i])”来运行 Nuclear_centroid_actin_overlay 函数。使用该函数测试输入的核分割和clear_debris函数，以确保ALAn使用的核是合理的。在笔记本中生成一个图，显示组织平面中的核质心位置与肌动蛋白通道重叠，以查看每个细胞内的细胞核位置（图 3B）。黑点表示真实的核，红点表示由clear_debris 定义的假核。
5. 如果您对真实原子核的截止体积不满意，可以更改clear_debris 函数中用于定义真实原子核的值。当前设置为比平均核体积低 1.5 个标准差（在 Jupyter Notebook 单元 4 第 97 行中定义）。
6. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过键入“nuclei_distribution(list_of_dfs[i], list_of_unshuffled_images[i],plot = True)”来运行 nuclei_distribution 函数。此函数确定图层是否组织为单层，并返回“有组织”或“无组织”的分类。在笔记本中生成显示跨层深度的核和肌动蛋白强度（双 Y 轴）的投影数量、Z 位置（以 µm（X 轴）为单位）的图（图 3C）。这是一个有用的图形来询问组织深度的细胞组织。
7. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过输入“find_shoulders(list_of_dfs[i], list_of_unshuffled_images[i],plot = True)”来运行 find_shoulders 函数（图 1D）。该函数确定组织深度上的肌动蛋白强度图是否有肩部。输出是肌动蛋白强度和肌动蛋白轮廓（双 Y 轴）的一阶导数相对于组织深度、Z 位置 (μm)（X 轴）的图。这些图用于根据上皮化的发育系列来识别组织的正确子类别。不成熟层由两个不属于此功能的规则定义；所有其他组织层均由该函数标识。中间 A 层具有单峰肌动蛋白强度导数。中间 B 层和成熟层具有双峰肌动蛋白强度导数。通过计算顶峰与侧峰高度之间的比率，我们可以识别两种层类型之间的差异。小于1的比率被分类为中间B层，而大于1的比率被分类为成熟层。
8. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过键入“terrain_map(list_of_dfs[i], list_of_unshuffled_images[i])”来运行terrain_map 函数（图 3E）。该函数在 XY 平面上绘制共焦堆栈中的所有核，按其 XY 位置定位，根据核大小确定大小，并根据核的 z 位置着色（图 3E）。这允许可视化视野内额外层细胞或杂乱区域的位置。
9. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过键入“sub_classify(list_of_dfs[i], list_of_unshuffled_images[i],plot = True)”来运行 sub_classify 函数（图 3F）。此函数将完整 XY 视野分解为最小的可分类部分 (100 px × 100 px)，并输出all_sections_analyzed列表中每个子部分的 ALAn 分类。该函数输出一个图形，显示整个视野，分为按层类型着色的 25 个正方形网格（图 3F）。
10. 在任何后续的 Jupyter Notebook 单元中，您可以通过键入“xy_segmentation(list_of_dfs[i], list_of_unshuffled_images[i],plot = True)”来运行 xy_segmentation 函数。这仅适用于有组织的图层类型。该功能分割组织平面中底层有组织细胞层的基底肌动蛋白，以输出组织平面中细胞的形状参数。该函数使用 scikit-image 包中的region_props来提取形状参数。该函数将输出四个数字，显示与投影肌动蛋白信号相比的分割阶段。此输出可用于检查肌动蛋白信号是否已正确分割以进行平面内细胞形状分析。如果出现提示，此函数将输出无组织图层的图像，但结果将无法解释，因此请避免在无组织图层上运行此函数。

协议验证

这项工作旨在研究细胞铺板密度和时间的影响，并表征出版物 [2] 和 [1] 中 MDCK 单层的结构发展。我们开发了一种公正且彻底的成像策略来对上皮结构的综合图进行成像，对 1 mm2 孔中的相同 16 个代表性 300 × 300 μm 区域进行成像。我们使用包含 351 个成像区域的 19,000 多个细胞的数据集开发了 ALAn，该数据集来自三种电镀密度的四次重复和 16 个区域的两次重复。我们进一步验证了我们的策略和该工具的广泛应用，以使用 Caco-2 和 MCF-7 细胞分析上皮结构，如 Dawney 等人，[2] 图 S4 所示。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

原则上，该工具可应用于实时成像的培养层。 ALAn 需要对整个层的肌动蛋白进行均匀染色。我们尝试将 ALAn 应用于使用 Hoechst 或 H2B-mCherry 实时成像的 MDCK 层来分割细胞核，使用 SiR-actin 和 LifeAct-GFP 来可视化肌动蛋白，但取得了有限的成功。我们发现 SiR-actin 和 LifeAct-GFP 信号在我们手中是不可预测的；因此，在我们的样品中并不总是能够检测到细胞边界，特别是在较低密度的情况下。 SiR-肌动蛋白图谱通常反映与鬼笔环肽染色不同的层结构图谱，但层上方的背景信号改变了投影的肌动蛋白图谱。我们预计，如果使用替代染料，特别是用于实时成像的染料，则需要修改和优化图层类别分配的规则。由于我们很难获得高质量的电影数据，我们还没有扩展ALAn代码以使其能够自动分析4D电影。然而，4D 电影中的高质量帧可以轻松输入 ALAn 来分析随时间变化的架构变化。
野生型 MDCK 细胞的显微镜数据集示例可供下载：http://tinyurl.com/4kv7jfav。

致谢

我们感谢 Dawney 等人的作者。 [2] 和卡马罗塔等人。 [1] 他的工作导致了该协议的开发。我们感谢 Rene Marc Mege 实验室索取该协议的详细版本。我们感谢 Finegan-Bergstralh 实验室过去和现在的成员的评论。这项工作得到了国家科学基金会职业奖（PI：Bergstralh）和国立卫生研究院拨款 R01GM125839（PI：Bergstralh）的支持。我们承认密苏里大学高级光学显微镜核心设施的显微镜、计算和软件资源，这些资源用于开发和优化该协议。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Cammarota, C.、Dawney, NS、Bellomio, PM、Jüng, M.、Fletcher, AG、Finegan, TM 和 Bergstralh, DT (2023)。致密化对初始上皮结构的机械影响。生物Rxiv。 2023.2005.2007.539758。https://doi.org/10.1101/2023.05.07.539758
Dawney, NS、Cammarota, C.、Jia, Q.、Shipley, A.、Glichowski, JA、Vasandani, M.、Finegan, TM 和 Bergstralh, DT (2023)。一种用于公正表征培养物中上皮单层发育的新工具。摩尔。生物。单元34(4)：ee22–04–0121。https://doi.org/10.1091/mbc.e22-04-0121
Etournay, R.、Merkel, M.、Popović, M.、Brandl, H.、Dye, NA、Aigouy, B.、Salbreux, G.、Eaton, S. 和 Jülicher, F. (2016)。 TissueMiner：一种多尺度分析工具包，用于量化细胞过程如何创建组织动力学。埃莱夫5：e14334。https://doi.org/10.7554/elife.14334
Farrell, DL、Weitz, O.、Magnasco, MO 和 Zallen, JA (2017)。 SEGGA：用于快速自动分析上皮细胞极性和动力学的工具集。发展144（9）：1725-1734。https://doi.org/10.1242/dev.146837
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Vicente-Munuera, P.、Gómez-Gálvez, P.、Tetley, RJ、Forja, C.、Tagua, A.、Letrán, M.、Tozluoglu, M.、Mao, Y. 和 Escudero, LM (2017)。 EpiGraph：一个量化上皮组织的开源平台。生物Rxiv。 e1101/217521。https://doi.org/10.1101/217521
Rueden, CT、Schindelin, J.、Hiner, MC、DeZonia, BE、Walter, AE、Arena, ET 和 Eliceiri, KW (2017)。 ImageJ2：用于下一代科学图像数据的 ImageJ。BMC Bioinf。 18(1)：e1186/s12859–017–1934–z。https://doi.org/10.1186/s12859-017-1934-z
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