材料与试剂

生物材料

亚麻荠品种 DH55 种子
含有组成型或化学诱导型质粒表达构建体的农杆菌菌株 C58C1。

本研究中使用的质粒包含编码叶绿体-GFP (CD3-995)、过氧化物酶体-mCherry (CD3-983)、高尔基体-mCherry (CD3-967)、ER-mCherry (CD3-959) 的构建体，如 Nelson 等人所述。[9] 和 Dex 诱导型 pBAV150 [10] 质粒，其 DNA 编码由 At3G28580 基因编码的蛋白质的 N 末端（1-32 个氨基酸）区域

试剂

塑料圆顶（Hummert International，目录号：11-33480）和托盘（Hummert International，目录号：11-33480）

号码：11-33010)
盆栽8个电池；宽×长×深：12.34 × 12.34 × 5.77 cm（TO PLASTICS，目录号：715352C）
土壤（Berger 60，目录号：BM2；BM6，按 1:1 比例混合）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP1422-500）
Bacto ^TM蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：211677）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S5-500）
MgSO ₄ ·7H ₂ O（Fisher Scientific，目录号：10034-99-8）
NH ₄ Cl（Sigma，目录号：12125-02-9）
KCl（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
CaCl ₂（Sigma，目录号：C2661）
FeSO ₄ ·7H ₂ O（Sigma，目录号：F-7002）
NaH ₂ PO ₄ ·H ₂ O（JT Baker，目录号：JTB-3818-05）
Na ₂ HPO ₄（Fisher Scientific，目录号：7558-79-4）
葡萄糖（Sigma，目录号：G7021）
MES（Sigma，目录号：M8250）
MgCl ₂ ·6H ₂ O（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
Murashige 和 Skoog 培养基（Sigma，目录号：M5519）
漂白剂（高乐氏浓缩杀菌漂白剂）
乙醇（Decon Labs Inc.，目录号：2701）
琼脂糖（GOLDBIO，目录号：9012-36-6）
Silwet L-77（Vac-In-Stuff，目录号：VIS-30）
Tween ^® 20（Hoefer，目录号：9005-64-5，GR128-500）
抗生素：硫酸卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）（Fisher Scientific，目录号分别：BP906-5、13292-46-1）
Nalgene ^TM Rapid-Flow ^TM无菌一次性过滤装置（Thermo Fisher Scientific，目录号：568-0020）
地塞米松（Sigma，目录号：D1756）
全氟萘烷（Strem Chemicals，目录号：09-5960）
二甲亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D8418）
琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423-500）
乙酰丁香酮（Sigma，目录号：D134406）

解决方案

洗涤液（参见配方）
渗透溶液（参见配方）
农杆菌生长培养基（参见食谱）
含有 0.04% Tween-20 的 30 μM 地塞米松 (Dex) 溶液（参见配方）
70% 乙醇（参见配方）
0.1% 琼脂培养基（参见食谱）
磷酸盐缓冲液（50 mM，25×，pH 5.5）（参见配方）

食谱

配方1、2和3改编自Zhang等人。[1]。

清洗液（1升）

试剂最终浓度体积

氯化镁₂ (1 M) 10毫米 10毫升

乙酰丁香酮 (0.1 M) 100μM 1毫升

水蒸气不适用 989 毫升

全部的不适用 1升

渗透液（1升）

注意：水应以 100 mL 的增量添加。在添加更多水之前让溶液完全混合。Murashige 和 Skoog 培养基和蔗糖完全溶解后会占用大量体积。使用 1 M KOH 将 pH 调节至 6.0；使用新鲜准备的。

试剂	最终浓度	数量或体积
Murashige 和 Skoog 介质	1/4×（重量/体积）	1.1克
蔗糖	1%（重量/体积）	10克
乙酰丁香酮 (0.1 M)	100 µM	1毫升
锡尔韦特 L-77	0.01%（体积比）	100微升
水蒸气	不适用	看注释
全部的	不适用	1升

农杆菌生长培养基 (1 L)

注意：使用 1 M KOH 将 pH 调节至 5.5，并对介质进行高压灭菌。高压灭菌后，添加过滤的诱导缓冲液成分。乙酰丁香酮在 DMSO 中制备。

试剂	最终浓度	数量或体积
酵母抽提物	0.1%（重量/体积）	1.0克
Bacto ^TM蛋白胨	0.5%（重量/体积）	5.0克
蔗糖	0.5%（重量/体积）	5.0克
MgSO ₄ ·7H ₂ O	2.03毫米	0.5克
琼脂糖	1%（重量/体积）	10.0克
氯化铵	18.70毫米	1.0克
氯化钾	2.01毫摩尔	0.15克
氯化钙₂	90.10μM	0.01克
FeSO ₄ ·7H ₂ O	8.99μM	0.0025克
水蒸气	不适用	889 毫升（见注释）
诱导缓冲液成分：
磷酸盐缓冲液（50 mM，25×，pH 5.5）	1×	40毫升
葡萄糖（20%，20×）	1×	50毫升
MES（1 M，50×，pH 5.5）	1×	20毫升
乙酰丁香酮（200 mM，1,000×）	1×	1毫升
全部的	不适用	1升

含 0.04% Tween-20 的 30 μM 地塞米松 (Dex) 溶液 (100 mL)

注意：Dex 在 DMSO 中制备。

试剂	最终浓度	体积
地塞米松 (30 mM)	30μM	100 μL（见注释）
吐温-20	0.04%	40微升
水蒸气	不适用	99.86 毫升
全部的	不适用	100毫升

70% 乙醇 (100 毫升)

试剂最终浓度体积

乙醇 (95%) 70% 73.7 毫升

水蒸气不适用 26.3毫升

全部的不适用 100毫升
0.1% 琼脂培养基 (100 mL)

注意：将介质高压灭菌并在冷却前搅拌。

试剂最终浓度体积

琼脂 0.1% 100毫克

水蒸气不适用 100毫升

全部的不适用 100 毫升（见注释）

磷酸盐缓冲液（50 mM，25×，pH 5.5；100 mL）

注意：使用 1 M KOH 将 pH 调节至 5.5。

试剂	最终浓度	体积
磷酸二氢钠	48.02毫米	662.7毫克
磷酸二氢钠	1.98毫米	28.05毫克
水蒸气	不适用	100毫升
全部的	不适用	100 毫升（见注释）

实验室用品

实验室玻璃器皿
移液器吸头：10 μL、200 μL 和 1,000 μL（USA Scientific，目录号：1111-3700、1111-1700、1112-1720）
黑色记号笔（Sharpie Permanent Markers，目录号：33861PP）
Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：06-666A）
15 mL 和 50 mL 离心管（Fisher Scientific，目录号：14-959-53A、14-432-22）
9 厘米圆形培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
1.5 mL 微量离心管（Fisher Scientific，目录号：01-549-746）
1 mL 无针结核菌素注射器（BD Biosciences，目录号：309659）
湿纸巾（Georgia-Pacific，目录号：P200）
无菌双蒸水
微量移液器 20 μL、200 μL 和 1 mL（Gilson，目录号：F144056M、F144058M、F144059M，分别）
1 L 烧杯（Pyrex，目录号：1000）

设备

软木塞钻孔器直径 4 毫米
高压灭菌器（Primus Sterilizer Co. Inc. 1317，目录号：09415.1256）
Fisher vortex Genie 2（Fisher Scientific，目录号：12-812）
植物生长室或步入式生长室，湿度保持在  50%。土壤水平光照强度应为135–145 μmols ^-1 ·m ^-2
冷冻柜 (-80 °C)（松下 VIP Plus，型号：MDF-V76VC-PA）
天平（梅特勒-托利多，型号：PB1501）
分光光度计（Bio-Mini，型号：SHIMADZU）
层流罩（SterilGARD，型号：3 Advance）
28 °C 培养箱（VWR，型号：3020）
用于称量化学品的分析天平
pH 计（SevenCompact，序列号：B408309625）
共焦显微镜（蔡司，型号：LSM 800）

软件和数据集

斐济（ImageJ，版本 2.15.0，2023 年 10 月 12 日）
Photoshop（Adobe PS，22.4.3，2021 年 7 月 19 日）
Prism v10.1（GraphPad，2023 年 7 月 1 日）
BioRender.com 在线工具

程序

植物生长和维护
1. 将未灭菌的干燥亚麻荠种子 (~100–150) 浸泡在 15 mL falcon 管中的 4–6 mL 0.1% 无菌琼脂中，并在黑暗中于 4 °C 下保存 3–7 天。本研究中使用的亚麻荠种子在温室室内进行繁殖和膨化。
2. 在巴斯德吸管的帮助下，在单独的含有土壤混合物的盆（12.34 × 12.34 × 5.77 厘米）中播种大约 18-20 粒种子，并盖上透明塑料盖以保持水分。将盆放在植物生长室或生长室中，在 12 小时光照和 12 小时黑暗条件下，22 ± 2 °C 日/夜温度制度和〜135–145 μmols ^-1 ·m ^-2的光强度。我们在 50%–70% 相对湿度下混合使用 50/50 钠灯和金属卤化物灯（但其他灯可能也适用）。
3. 4-5 天后，将幼苗稀疏至每盆 9 株，然后取下盖子。选择看起来相似的幼苗并丢弃其余的（图S1）。
4. 让幼苗在接下来的 5-7 天内生长，直到第一片真叶完全张开（图 1）。
  
  图 1. 描绘农杆菌渗透的亚麻荠DH55 品种植物的代表性图像。用携带所需构建体的农杆菌菌株 C58C1 浸润真叶打开的 10 至 12 天大的植物。白色箭头表示渗透后立即成像的代表性叶子。叶子的背面部分将呈现湿润的外观，直到注入的含有农杆菌的液体蒸发。比例尺以厘米为单位。
用于渗透的农杆菌菌株悬浮液制备
1. 农杆菌悬浮液的制备
  1. 在层流柜内含有适当抗生素和 200 μM 乙酰丁香酮的农杆菌生长培养基的无菌板上，将具有所需结构的农杆菌菌株 C58C1进行划线。
    
    将含有细菌的平板在 28°C 下放置 24-36 小时。在这项工作中，质体-GFP (CD3-995)、过氧化物酶体-mCherry (CD3-983)、高尔基体-mCherry (CD3-967)、ER-mCherry (CD3-959) 和 N 端 ER 的标记质粒使用 At3G28580 编码蛋白的信号 (1–32 aa) 区域，平板含有 Rif (34 mg/mL) + Kan (50 mg/mL)。
  2. 使用 200 μL 移液器吸头从每个平板上刮下一层薄薄的农杆菌细胞，并通过涡旋将细菌重新悬浮在 1.5 mL 微量离心管中的 1 mL 洗涤液（参见配方）中。
  3. 将 100 μL 重悬农杆菌等分试样稀释 10 倍，以测量 OD _600。最终渗透溶液中需要等于或大于 0.6 的值。将此 OD 值乘以 10 即可确定原始未稀释重悬农杆菌的OD _{600 。}这样做是为了获得足够的接种物，足以渗透每个构建体每盆的所有真叶。之后，使用渗透溶液将农杆菌的原始悬浮液调整至 OD _{600为 0.6（参见配方）。}对于共定位研究，以 1:1 的比例混合菌株，每个菌株的 OD ₆₀₀为 0.6，并立即渗透到叶子中。
2. 亚麻荠农杆菌浸润
  1. 借助 1 mL 无针塑料注射器将渗透溶液中的农杆菌渗透到亚麻荠叶（每株真叶 2 个）的背面。每个结构使用四株或更多植物进行渗透。将植物放在光照下 1 小时，让水浸过的叶子干燥，然后使用塑料托盘将植物在室温下置于黑暗中 24 小时。
  2. 将农杆菌渗透的植物放回生长室或生长室再培养 3-5 天，然后使用共焦显微镜观察叶子。如果使用诱导型启动子，请在检查前 21 小时将诱导剂喷洒在叶子上，如 Banday 等人所述。[11]，使用共焦显微镜（图2A和2B）。在图 2A 的示例中，应用了 30 μM Dex 和 0.04% Tween-20。
    
    图2.亚麻荠DH55品种中农杆菌介导的瞬时亚细胞定位。A. 上图：共聚焦显微照片显示叶绿体-GFP (CD3-995)、过氧化物酶体-mCherry (CD3-983) 和高尔基体-mCherry (CD3-967) 的定位。下图：ER-mCherry (CD3-959)、N-Term-ER-GFP（Dex：At3G28580；1-32 aa 区域）的共聚焦显微照片，以及 N-Term-ER-GFP（Dex：At3G28580）与ER-mCherry（CD3-959；以洋红色显示）。对于定位和共定位研究，分别在转移到光照条件后 3 天和 5 天拍摄图像。叶绿体自发荧光显示为蓝色。黄色箭头表示叶绿体自发荧光（如插图所示），洋红色箭头表示叶绿体-GFP 与叶绿体自发荧光重叠，白色箭头表示 N-Term-ER-GFP（Dex：At3G28580）和 ER-mCherry（CD3-959）的共定位。比例尺，100 μm。B. 各个共焦显微照片的单独通道的详细信息：叶绿体自发荧光（蓝色）、GFP 信号（绿色）和 mCherry 信号（红色）。对于共定位，mCherry 信号以洋红色显示。比例尺，100 μm。C. 每个瞬时表达构建体的效率。数据代表从不同天进行的实验获得的平均值±SE（n = 8），以百分比（％）表示。每个独立实验的四张图像用于计算。详细信息请参见表 S1。

数据分析

共焦显微镜方法改编自 Banday 等人。[11]。Zeiss LSM 800 用于可视化 GFP 和 mCherry 荧光（氩激光/激发：488 nm；发射收集：GFP 为 505–530 nm；氩激光/激发：594 nm；发射收集：mCherry 为 610–630 nm）和叶绿素自发荧光（He-Ne 激光/激发：633 nm；发射收集：650–750 nm 或 645–700 nm）。使用 EC Plan-Neofluar 40/1.3 Oil DIC M27 物镜、每个通道 1 AU 的针孔以及 450 至 700 之间的光电倍增管主增益捕获叶背面图像。图像是以 1,024 × 1,024 像素扫描分辨率捕获的光学切片在最大速度模式下。GFP、mCherry 和叶绿素的荧光以顺序采集模式采集。将植物叶子固定在全氟萘烷中以进行光学增强[12]。使用 ImageJ（斐济）和 Adobe PS 来处理图像。每个苜蓿成像实验每个构建体包括四个独立样本，并且实验进行两次。每个实验使用来自不同植物叶子的四张图像来计算每个图像的细胞转化效率。使用该方案，所有渗透的叶子均显示各自构建体的表达。然而，老植物叶子中细胞转化/成像的效率较低（表 S1）。

对于效率分析的计算，公式改编自Zhang等人。[1]。该图是使用 Prism 软件绘制的（图 2C 和表 S1）。

效率（%）=瞬时转化细胞数*100/细胞总数

协议验证

该协议改编自Zhang等人。[1] 并针对亚麻荠作物进行了优化。使用五种不同的组成型或化学诱导型质粒表达构建体对该方案进行了验证。
每个亚麻荠成像实验的每个构建体都包含四个独立样本，并且实验进行两次。每个实验使用来自不同植物叶子的四张图像来计算每个图像的细胞转化效率。
学生的 t 检验表明，老植物叶子中细胞转化/成像的效率明显较低（表 S1）。

一般注意事项和故障排除

植物的年龄非常重要。老亚麻荠植物的叶子需要针刺才能成功渗透，但转化效率会下降（表 S1）。
实验过程中盆必须充分浇水以保持湿度。
一盆里只放九株植物；植物密度影响植物的生长。植物数量较多会导致生长较慢。相反，每盆植物数量较少会加速植物的生长。
细菌培养物保存时间不要超过 36 小时。
为了更好的渗透，渗透溶液应引入叶片的背面。
拍摄远轴表面的共焦图像，以获得同一焦平面中更多数量的细胞。
使用全氟萘烷可防止叶子干燥并获得更好的成像效果。
在使用 70% 乙醇制备农杆菌悬浮液之前清洁工作台。随后，在植物中完成渗透后，剩余的细菌悬浮液必须用漂白剂处理24小时，然后才丢弃到水槽中。

致谢

这项工作得到了授予 PK 的 Dropkin 博士后奖学金以及阿诺德和梅布尔贝克曼基金会授予捷豹路虎的本科生奖学金的支持。该协议改编自Zhang等人。[1] 并针对亚麻荠作物进行了修改。我们感谢 Isobel Parkin 博士（加拿大农业和农业食品部）提供亚麻荠种子。我们感谢 Joanna Jelenska 博士提出的宝贵建议。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

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补充资料

可以在此处下载以下支持信息：

图 S1：5 天龄幼苗的可见外观。
表 S1：效率分析的详细信息（百分比）。