材料与试剂

生物材料

免疫后肝素化的美洲驼血液

免疫前和免疫后美洲驼血清

电感受态 TG1（安捷伦，目录号：200123）

CM13K 胰蛋白酶敏感辅助噬菌体（Antibody Design Laboratories，目录号：PH050L）

Stellar TM感受态细胞（Takara Bio，目录号：636766）

大肠杆菌（Migula）Castellani 和 Chalmers，菌株 WK6（ATCC，目录号：47078）

用于体内生物素化的BL21(DE3)-R3-pRARE2-BirA大肠杆菌细胞，SGC（结构基因组学联盟）

HeLa 细胞（ATCC，目录号：CCL-2）

试剂

Gerbu佐剂F（Biotechnik GmbH，目录号：3030）。储存于 4°C

NeutrAvidin TM生物素结合蛋白（Invitrogen，目录号：A2666）。储存于-20°C

10× PBS（Fisher BioReagents，目录号：BP399-20），一般用途。室温保存 (RT)

脱脂奶粉（Oxoid，目录号：LP0031）。储存于 RT

Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）。储存于 RT

BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）。储存于 4°C

山羊抗美洲驼 IgG (H+L) HRP（Invitrogen，目录号：A16060）。以 5 µL 等份储存于 -20 °C

KPL ABTS 过氧化物酶溶液 A（SeraCare，目录号：5120-0034）。储存于 4°C

KPL 过氧化物酶底物溶液 B（SeraCare，目录号：5120-0037）。储存于 4°C

Chemgene TM（Chemgene&Trade，目录号：XTM308）。储存于 RT

注意：该化学品具有腐蚀性。

乙醇（EtOH）（Fisher BioReagents，目录号：E/0650DF/17）。储存在 RT 的易燃液体储存柜中

注意：该化学品易燃。

Virkon ®（Rely+on TM，目录号：12358667）。储存于 RT

注意：该化学品具有腐蚀性。

PBS，pH 7.4，用于多形核细胞（PMNC）分离（Gibco，目录号：10010015）。储存于 4°C

Histopaque ® -1077（Sigma-Aldrich，目录号：10771）。储存于 4°C

RNase Zap TM RNase 去污溶液（Invitrogen，目录号：AM9782）。储存于 RT

台盼蓝溶液，0.4%（Sigma-Aldrich，目录号：T8154-20ML）。储存于 RT

注意：该化学物质具有潜在的致癌性。

TRIzol TM试剂（Invitrogen，目录号：15596026）。储存于 4°C

注意：该化学品具有腐蚀性和毒性。

氯仿（Fluorchem，目录号：D007F）。储存在 RT 的易燃液体储存柜中

注意：该化学品易燃。

2-丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）。储存在 RT 的易燃液体储存柜中

注意：该化学品易燃。

无核酸酶水（未经 DEPC 处理）（Invitrogen，目录号：AM9932）。储存于 RT

SuperScript TM IV 一步式 RT-PCR 系统（Invitrogen，目录号：12594025）。储存于-20°C

CALL_001 引物 5' GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

CALL_002 引物 5' GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

6×DNA凝胶上样缓冲液（New England Biolabs，目录号：B7024S）。储存于 4°C

10× TBE 缓冲液（Thermo Scientific，目录号：B52）。储存于 RT

琼脂糖（Fisher BioReagents，目录号：BP1356-500）。储存于 RT

1,000× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂（Invitrogen，目录号：S33102）。储存于 RT

GeneRuler 1 kb DNA 梯子（Thermo Scientific，目录号：SM0311）。储存于 4°C

Nucleospin 凝胶和 PCR 清理试剂盒（Macherey-Nagel，目录号：740609.50）。储存于 RT

Purelink PCR 纯化试剂盒（Invitrogen，目录号：K310002）。储存于 RT

HyperLadder TM 1 kb DNA 梯子（Meridian Bioscience ®，Bioline，目录号：BIO-33053）。储存于 4°C

Phusion flash 高保真 PCR 主混合物（Invitrogen，目录号：F548L）。储存于-20°C

VHHFor2 引物 5' TACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT GGRGGA 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

VHHRev 引物 5' GTGATGGTGTTGGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCTGG 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

pADL23c载体（Antibody Design Laboratories，目录号：PD0111）。储存于-20°C

SfiI（New England Biolabs，目录号：R0123S）。储存于-20°C

10× rCutSmart TM缓冲液（New England Biolabs，目录号：B6004S）。储存于 4°C

ClonExpress II一步克隆试剂盒，包含5×CEII缓冲液和Exnase II（Vazymbiotech，目录号：C112-02）。储存于-20°C

恢复介质（Sigma-Aldrich，目录号：S1797）。储存于 4°C

LB 培养基混合物（Formedium，目录号：LBL0103）。储存于 RT

Bacto 胰蛋白胨（Melford，目录号：T60065-2000.0）。储存于 RT

酵母提取物（Melford，目录号：Y20020-1000.0）。储存于 RT

Bacto 琼脂（Formedium，目录号：AGR10）。储存于 RT

氨比西林（Formedium，目录号：AMP100）。储存于 4°C

注意：氨苄青霉素是一种致敏剂。

25 mM dNTP（Thermo Scientific，目录号：R1122）。以 30 µL 等分试样储存于 -20 °C

Taq聚合酶与标准Taq反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0273X）。储存于-20°C

Doctor_seq_Fwd 引物 5' GCTTCCGGCTCGTATGTTG 3'。储存于-20°C

Doctor_seq_Rev 引物 5' GTCGTCTTTCCAGACGTTAG 3'。储存于-20°C

甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-1L）。储存于 RT

PEG 6000（Sigma-Aldrich，目录号：81260）。储存于 RT

氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）。储存于 RT

卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）。储存于 4°C

注意：卡那霉素是一种致敏剂，可能会损害生育能力。

StartingBlock TM (PBS) 封闭缓冲液（Invitrogen，目录号：37538）。储存于 4°C

Dynabeads TM M-280 链霉亲和素（Invitrogen，目录号：11205D）。储存于 4°C

Tris 碱（Melford，目录号：T60040-100.0）。储存于 RT

CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）。储存于 RT

胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1426）。储存于-20°C

抗M13 HRP（Sino Biological，目录号：11973-MM05T-H）。以 5 µL 等份储存于 -20 °C

Highprep PCR 磁珠（Magbio，目录号：AC60050）。储存于 4°C

葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）。储存于 RT

MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）。储存于 RT

IPTG（NeoBiotech，目录号：NB-45-00030）。储存于-20°C

硫酸多粘菌素 B（Gibco，目录号：21850029）。储存于 RT

注意：硫酸多粘菌素 B 有毒。

2×Laemmli缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）。储存于 4°C

20×NuPAGE TM MES SDS运行缓冲液（Invitrogen，目录号：NP000202）。储存于 RT

Mark12 TM未染色标准品（Invitrogen，目录号：LC5677）。储存于 4°C

InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂（Abcam，目录号：ab119211）。储存于 4°C

Ni-NTA 旋转柱（QIAGEN，目录号：31014）。储存于 4°C

咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I202-500g）。储存于 RT

注意：咪唑有毒、有腐蚀性、有刺激性，可能会损害生育能力。

Zeba TM旋转脱盐柱，7K MWCO，0.5 mL（Thermo Scientific，目录号：89882）。储存于 4°C

兔抗骆驼VHH HRP（金斯瑞，目录号：A01861-200）。以 5 µL 等份储存于 -20 °C

pOPINVHH_his 载体（Addgene，目录号：210405）。储存于-20°C

pOPINVHH_cys_his 载体（Addgene，目录号：210403）。储存于-20°C

pOPINVHH_BAP_his 载体（Addgene，目录号：210402）。储存于-20°C

pOPINVHH_sort_his 向量（Addgene，目录号：210406）。储存于-20°C

pOPINVHH_flag_his 载体（Addgene，目录号：210404）。储存于-20°C

pOPINVHH_myc_his 载体（Addgene，目录号：210526）。储存于-20°C

pOPINVHH_snap_his 载体（Addgene，目录号：210407）。储存于-20°C

pOPINE-3C-eGFP 载体（Addgene，目录号：41125）。储存于-20°C

pOPINE-3C-eYFP 载体（Addgene，目录号：214028）。储存于-20°C

pOPINE-3C-mCherry 载体（Addgene，目录号：214060）。储存于-20°C

通用正向引物 5' GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAG 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

他的 FLAG Rev 引物 5' GTGATGGTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

Cys Rev 引物 5' ATGGTGACAGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

BAP Rev 引物 5' ATCATTCAAGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C 下。

排序 Rev 引物 5' CGGCAGGCCGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

Myc Rev 引物 5' GTGATGGTGGTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

SNAP Rev 引物 5' GTCCTTGTCGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

pOPINE 通用正向引物 5' AGGAGATATACCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAG 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

pOPINE 通用 Rev 引物 5' CAGAACTTCCAGTTTTAGGGGAGACGGTGACCTGGGTC 3'。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

Bsu36I（New England Biolabs，目录号：R0524S）。储存于-20°C

NcoI（New England Biolabs，目录号：R01093S）。储存于-20°C

X-gal 即用型（Thermo Scientific，目录号：R0941）。储存于 4°C

QIAprep 旋转小量制备试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）。储存于 RT

密码子优化后的抗 GFP 纳米抗体 [9] 在大肠杆菌中表达的 DNA 序列。CAG GTC CAA TTA GTG GAG TCC GGT GGG GCA CTT GTC CAG CCT GGA GGT TCA CTT CGC TTG TCT TGC GCA GCG TCT GGA TTC CCG GTG AAC CGC TAT AGT ATG CGT TGG TAC CGT CAA GCT CCG GGG AAA GAA CGT GAA TGG GTA GCA GGG ATG TCT TCC GCC GGT GAC CGC TCT TCA TAC GAG GAC TCG GTC AAG GGG CGC TTC ACA ATC TCT CGT GAT GAT GCC CGT AAC ACC GTT TAC TTG CAA ATG AAC AGC CTG AAA CCG GAA GAC ACT GCG GTG TAT TAC TGC AAT GTT AAT GTA GGG TTT GAA TAC TGG GGT CAA GGT ACA CAA GTT ACA GTT TCG TCA。从 IDT 订购了 gBlock。在 TE 缓冲液中重构之前储存在 RT 下，在 50°C 下孵育 20 分钟，然后储存在 -20°C 下

氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C1919）。储存于 4°C

注意：氯霉素有毒，可导致眼睛损伤，并且是一种致癌物质。

大观霉素二盐酸盐五水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S4014）。储存于 4°C

注意：大观霉素有刺激性。

羧卞西林二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：C3416）。储存于 4°C

注意：羧苄青霉素是一种致敏剂。

生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4639）。储存于 4°C

链霉亲和素，Alexa Fluor TM 488 缀合物（Invitrogen，目录号：S11223）。储存于-20°C

BenchMark TM荧光蛋白标准品（Invitrogen，目录号：LC5928）。储存于-20°C

密码子优化后在大肠杆菌中表达的抗波形蛋白 (VB3) 纳米抗体 [10] 的 DNA 序列： CAG GTC CAA CTT GTA GAG TCA GGA GGT GGA AGC GTG CAA GCT GGG GAC TCT CTG CGC CTG TCT TGT GCT TCG AGC GGA AAT ACC TTC TCG ATC AAA GTC ATG GGA TGG TAC CGC CAG GCA CCT GGA AAG CAA CGT GAA TTA GTC GCG GTT TCA ACC AAT AGC GGG GCC TCT GTT AAT TAT GCC AAC TCT GTG AAG GGA CGC TTT ACC ATT TCT ATT GAT TCA GTA AAA AAA ACA ACC TAC TTA CAG ATG AAT TCC TTG AAG CCA GAA GAT ACA GCC GTC TAC TTT TGC AAT GCA TAT GAT GGG CGT TAT GAG GAC TAT TAC GGT CAG GGG ACC CAA GTG ACA GTA TCA TCA。从 IDT 订购了 gBlock。在 TE 缓冲液中重构之前储存在 RT 下，在 50°C 下孵育 20 分钟，然后储存在 -20°C 下

TCEP，盐酸盐（Merck，Millipore ®，目录号：580567-5GM）。储存于 RT

Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺（Invitrogen，目录号：A20347）。储存于-20°C

Zeba TM染料和生物素去除柱（Thermo Scientific，目录号：A44296）。储存于 4°C

PageRuler TM预染色蛋白梯（Thermo Scientific，目录号：26616）。储存于 4°C

DMEM，高葡萄糖，HEPES，无酚红（Gibco，目录号：21063-029）。储存于 4°C

胎牛血清（FBS）（Biowest，目录号：S00NB1001Y）。储存于-20°C

100×GlutaMAX TM（Gibco，目录号：35050-038）。储存于-20°C

100×青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15140-122）。储存于-20°C

PBS 中的 4% 多聚甲醛（Thermo Scientific 化学品，目录号：J61899.AK）。储存于 4°C

注意：多聚甲醛是一种眼睛刺激物、皮肤致敏物和致癌物。

Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-250mL）。储存于 RT

带有 DAPI 的 Fluoroshield（Abcam，目录号：ab104139）。储存于 RT

指甲油。储存于 RT

F 型浸没液体（Leica，目录号：11513859）。储存于 RT

Fugene 转染试剂（Promega，目录号：E2311）。储存于 4°C

解决方案

0.5 mg/mL neutrAvidin 生物素结合蛋白（参见配方）

10 µg/mL neutrAvidin 用于包被 ELISA 板（参见配方）

1× PBS（参见配方）

封闭液（参见配方）

洗涤缓冲液 (PBST)（参见配方）

0.1% (w/v) BSA-PBS（参见配方）

5% (v/v) Chemgene（参见配方）

70% (v/v) 乙醇 (EtOH)（参见配方）

2% (w/v) Virkon（参见配方）

75% (v/v) EtOH（参见配方）

1× TBE 缓冲液（参见配方）

含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的 0.7% (w/v) 琼脂糖凝胶（参见配方）

含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的 1% (w/v) 琼脂糖凝胶（参见配方）

2× YT 培养基（参见食谱）

LB 培养基（参见食谱）

100 mg/mL 氨苄西林（参见配方）

含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% (w/v) 琼脂 LB 平板（参见配方）

含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2% (w/v) 琼脂 LB 平板（参见配方）

50% 甘油（参见食谱）

2× 含有 25% 甘油的 YT 培养基（参见配方）

不含抗生素的 1% (w/v) 琼脂 LB 平板（参见配方）

2× 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 YT（参见配方）

50 mg/mL 卡那霉素（参见配方）

2× 含有 25 µg/mL 卡那霉素的 YT（参见配方）

PEG/NaCl 沉淀溶液（参见配方）

2× YT，含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 25 µg/mL 卡那霉素（参见配方）

TBSC（参见食谱）

1 mg/mL 胰蛋白酶（参见食谱）

250 µg/mL 胰蛋白酶（参见配方）

很棒的肉汤（见食谱）

20% (w/v) 葡萄糖（参见食谱）

1 M MgCl 2 ·6H 2 O（参见配方）

极好的肉汤，含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、0.1% 葡萄糖、2 mM MgCl 2 ·6H 2 O（参见配方）

1 M IPTG（参见配方）

1 mg/mL 硫酸多粘菌素 B 的 PBS 溶液（参见配方）

1× NuPAGE TM MES SDS 电泳缓冲液（参见配方）

平衡缓冲液（参见配方）

洗脱缓冲液（参见配方）

八位组稀释缓冲液（参见配方）

含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、2 mM IPTG、40 µg/mL X-gal 的 1% (w/v) 琼脂 LB 板（参见配方）

34 µg mL 氯霉素（参见配方）

50 µg/mL 大观霉素（参见配方）

50 µg/mL 羧苄西林（参见配方）

1% (w/v) 琼脂 LB 板，含有 34 µg/mL 氯霉素、50 µg/mL 大观霉素、50 µg/mL 羧苄青霉素（参见配方）

0.2 M 生物素（参见食谱）

含有 50 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素的绝佳肉汤（参见食谱）

1 mg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物（参见配方）

50 µg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物（参见配方）

500 mM TCEP，pH 8.0（参见配方）

1 mM TCEP，pH 8.0（参见配方）

10 mg/mL Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺（参见配方）

不含酚红的 DMEM 培养基、10% (v/v) FBS、1× GlutaMAX TM、1× 青霉素-链霉素（参见配方）

共焦封闭缓冲液（参见配方）

共聚焦稀释缓冲液（参见配方）

食谱

0.5 mg/mL neutrAvidin 生物素结合蛋白

准备 200 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

中性亲和素TM0.5毫克5毫克

水蒸气不适用10毫升

全部的不适用10毫升

10 µg/mL neutrAvidin 用于包被 ELISA 板

使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

neutrAvidin TM（配方1）10微克/毫升200微升

PBS (1×)1×9.8毫升

全部的不适用10毫升

1×PBS

准备无菌（通过高压灭菌）和非无菌 PBS。储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

PBS (10×)1×100毫升

水蒸气不适用900毫升

全部的不适用1,000 毫升

封闭液

使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

牛奶2%（重量/体积）2克

PBS（配方 3）（或与蛋白质兼容的缓冲液）不适用100毫升

全部的不适用100毫升

洗涤缓冲液（PBST）

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（配方 3）1×1000毫升

吐温-200.05%（体积比）500微升

全部的不适用1,000 毫升

0.1% (w/v) BSA-PBS

使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

牛血清白蛋白0.1%（重量/体积）50毫克

PBS（配方 3）1×50毫升

全部的不适用50毫升

5% (v/v) 凯凯

储存于室温。

试剂最终浓度数量或体积

凯凯 (100%)5%（体积/体积）50毫升

水分子不适用950毫升

全部的不适用1,000 毫升

70% (v/v) 乙醇

储存于室温。

试剂最终浓度数量或体积

乙醇（绝对）70%（体积/体积）70毫升

水分子不适用30毫升

全部的不适用100毫升

2% (w/v) 卫康

每周准备并储存在室温下。

试剂最终浓度数量或体积

维康粉2%（重量/体积）100克

水分子不适用5,000 毫升

全部的不适用5,000 毫升

75% (v/v) 乙醇

储存于室温。

试剂最终浓度数量或体积

乙醇（绝对）75%（体积/体积）75毫升

水分子不适用25毫升

全部的不适用100毫升

1×TBE缓冲器

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

待定 (10×)1×100毫升

水分子不适用900毫升

全部的不适用1,000 毫升

含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的0.7% (w/v) 琼脂糖凝胶

在微波炉中加热直至所有琼脂糖溶解，并在添加凝胶染色剂之前冷却至 55°C。倒入 DNA 铸造装置中并使其凝固。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

琼脂糖0.7%（重量/体积）0.7克

待定（配方 11）1×100毫升

全部的不适用100毫升

SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂 (1,000×)1×10微升

含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的 1% (w/v) 琼脂糖凝胶

在微波炉中加热直至所有琼脂糖溶解，并在添加凝胶染色剂之前冷却至 55°C。倒入 DNA 铸造装置中并使其凝固。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

琼脂糖1%（重量/体积）1克

待定（配方 11）1×100毫升

全部的不适用100毫升

SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂 (1,000×)1×10微升

2× YT 培养基

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

细菌胰蛋白胨16克/升4克

氯化钠5克/升1.25克

酵母抽提物10克/升2.5克

水蒸气不适用250毫升

全部的不适用250毫升

LB培养基

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

水蒸气不适用250毫升

全部的不适用250毫升

100 mg/mL 氨苄青霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

注意：氨苄青霉素是一种致敏剂。

试剂最终浓度数量或体积

氨苄青霉素100毫克/毫升2克

水蒸气不适用20毫升

全部的不适用20毫升

含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% (w/v) 琼脂 LB 板

高压灭菌 LB 培养基和细菌琼脂混合并冷却至 55°C，然后添加抗生素。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其在室温下冷却。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂1%（重量/体积）2.5克

水蒸气不适用250毫升

全部的不适用250毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升250微升

含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2% (w/v) 琼脂 LB 板

高压灭菌 LB 培养基和细菌琼脂混合并冷却至 55°C，然后添加抗生素。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其在室温下冷却。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂2%（重量/体积）5克

水蒸气不适用250毫升

全部的不适用250毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升250微升

50% (v/v) 甘油

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

甘油50%（体积/体积）100毫升

水蒸气不适用100毫升

全部的不适用200毫升

2× 含有 25% (v/v) 甘油的 YT 培养基

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2× YT 培养基不适用20毫升

甘油（配方 19）25%（重量/体积）20毫升

全部的不适用40毫升

1% (w/v) 不含抗生素的琼脂 LB 平板

高压灭菌并冷却至 55 °C。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其冷却并在室温下凝固。4°C 保存两周。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂1%（重量/体积）2.5克

水蒸气不适用250毫升

全部的不适用250毫升

2× 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 YT

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2× 收益不适用100毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升100微升

全部的不适用100毫升

50 mg/mL 卡那霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

卡那霉素50毫克/毫升0.5克

水蒸气不适用10毫升

全部的不适用10毫升

2× 含有 25 µg/mL 卡那霉素的 YT

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2× 收益不适用100毫升

卡那霉素（配方 23）25微克/毫升50微升

全部的不适用100毫升

PEG/NaCl沉淀溶液

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

聚乙二醇600020%（重量/体积）200克

氯化钠2.5M146.1克

水蒸气不适用补足至 1,000 mL

全部的不适用1,000 毫升

2× YT，含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 25 µg/mL 卡那霉素

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2× 收益不适用100毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升100微升

卡那霉素（配方 23）25微克/毫升50微升

全部的不适用100毫升

TBSC

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

Tris碱基10毫米0.788克

氯化钠137毫米4克

CaCl 2 ·2H 2 O1毫米73.5毫克

水蒸气不适用500毫升

全部的不适用500毫升

1 毫克/毫升胰蛋白酶

准备 130 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

胰蛋白酶1毫克/毫升50毫克

水蒸气不适用50毫升

全部的不适用50毫升

250 µg/mL 胰蛋白酶

使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

胰蛋白酶（配方 28）250微克/毫升125微升

TBSC（食谱 27）不适用375微升

全部的不适用500微升

很棒的肉汤

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

细菌胰蛋白胨12克/升3克

酵母抽提物24克/升6克

甘油0.4%（体积比）1毫升

KH 2 PO 40.17米0.5775克

K 2 HPO 40.72M3.135克

水蒸气不适用250毫升

全部的不适用250毫升

20% (w/v) 葡萄糖

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

葡萄糖20%（重量/体积）20克

水蒸气不适用补足至 100 mL

全部的不适用100毫升

1M MgCl 2 ·6H 2 O

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

MgCl 2 ·6H 2 O1M4.066克

水蒸气不适用20毫升

全部的不适用20毫升

含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、0.1% 葡萄糖、2 mM MgCl 2 ·6H 2 O的极好的肉汤

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

很棒的肉汤（食谱30）不适用99.2毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升100微升

葡萄糖（食谱 31）0.1%（体积比）500微升

MgCl 2 ·6H 2 O（配方32）2毫米200微升

全部的不适用100毫升

1M IPTG

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

IPTG1M4.766克

水蒸气不适用20毫升

全部的不适用20毫升

1 mg/mL 硫酸多粘菌素 B 的 PBS 溶液

准备 1 mL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

硫酸多粘菌素B1毫克/毫升2毫克

PBS（配方 3）1×2毫升

全部的不适用2毫升

1× NuPAGE TM MES SDS 电泳缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

制造执行系统（20×）1×100毫升

水分子不适用1,900 毫升

全部的不适用2,000 毫升

平衡缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

咪唑30毫米0.51克

PBS（配方 3）1×250毫升

调节pH值至7.4

全部的不适用250毫升

洗脱缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

咪唑300毫米2.04克

PBS（配方 3）1×100毫升

调节pH值至7.4

全部的不适用100毫升

八位组稀释缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

牛血清白蛋白0.1%（重量/体积）50毫克

PBS（配方 3）（或与蛋白质兼容的缓冲液）1×50毫升

全部的不适用50毫升

1% (w/v) 琼脂 LB 板，含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、2 mM IPTG、40 µg/mL X-gal

在添加添加剂之前，进行高压灭菌并冷却至 55 °C。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其冷却并在室温下凝固。4°C 保存两周。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂1%（重量/体积）2.5克

水蒸气不适用补足至 250 mL

全部的不适用250毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升250微升

IPTG（配方 34）2毫米500微升

X-半乳糖 (20 毫克/毫升)40微克/毫升500微升

34 毫克/毫升氯霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

氯霉素34毫克/毫升34毫克

乙醇100%1毫升

全部的不适用1毫升

50 mg/mL 壮观霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

二盐酸盐大观霉素五水合物50毫克/毫升50毫克

水蒸气不适用1毫升

全部的不适用1毫升

50 mg/mL 羧苄青霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

羧苄青霉素二钠盐50毫克/毫升50毫克

水蒸气不适用1毫升

全部的不适用1毫升

1% (w/v) 琼脂 LB 板，含有 34 µg/mL 氯霉素、50 µg/mL 大观霉素、50 µg/mL 羧苄青霉素

高压灭菌器 LB 培养基和细菌琼脂混合并冷却至 55 °C，然后添加添加剂。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其冷却并在室温下凝固。4°C 保存两周。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升2.5克

细菌琼脂1%（重量/体积）1克

水蒸气不适用补足至 100 mL

全部的不适用100毫升

氯霉素（配方 41）34微克/毫升100微升

大观霉素（配方 42）50微克/毫升100微升

羧苄青霉素（配方 43）50微克/毫升100微升

0.2 M 生物素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

生物素0.2M0.488克

氢氧化钠 (1 M)不适用添加以溶解生物素

水蒸气不适用补足至 10 mL

全部的不适用10毫升

含有 50 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素的极好的肉汤

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

很棒的肉汤（食谱30）不适用998 毫升

大观霉素（配方 42）50微克/毫升1毫升

羧苄青霉素（配方 43）50微克/毫升1毫升

全部的不适用1000毫升

1 mg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物

避光，制备 10 µL 等分试样，并保存在 -20°C 下。稳定六个月。

试剂最终浓度数量或体积

链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物1毫克/毫升1毫克

PBS（配方 3）1×1毫升

全部的不适用1毫升

50 µg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物

避光并在使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 缀合物 (1 mg/mL)50微克/毫升1微升

PBS（配方 3）1×19微升

全部的不适用20微升

500 mM TCEP，pH 8.0

储存于 4°C。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

TCEP500毫米1.433克

水蒸气不适用10毫升

调节pH值至8.0

全部的不适用10毫升

1 mM TCEP，pH 8.0

使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

TCEP（配方 49）1毫米2微升

水蒸气不适用998微升

全部的不适用1毫升

10 mg/mL Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺

避光并储存于-20°C。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺10毫克/毫升1毫克

二甲基亚砜1×500微升

全部的不适用500微升

不含酚红的 DMEM 培养基、10% (v/v) FBS、1× GlutaMAX TM、1× 青霉素-链霉素

储存于 4°C。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

DMEM培养基不适用88毫升

胎牛血清10%（体积/体积）10毫升

GlutaMAX ™ (100×)1×1毫升

青霉素-链霉素（100×）1×1毫升

全部的不适用100毫升

共焦封闭缓冲液

储存于 4°C。1个月内使用。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（配方 3）1×10毫升

牛血清白蛋白5%（重量/体积）0.5克

海卫一 X-1000.25%（体积比）25微升

全部的不适用10毫升

共焦稀释缓冲液

储存于 4°C。1个月内使用。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（配方 3）1×10毫升

牛血清白蛋白1%（重量/体积）0.1克

海卫一 X-1000.25%（体积比）25微升

全部的不适用10毫升

实验室用品

Vacuette®管4 mL CAT血清凝块激活剂采血管（Greiner，Bio-one，目录号：454204）

Vacuette®管9 mL NH肝素钠采血管（Greiner，Bio-one，目录号：455051 ）

微量离心管，0.5 mL、1.5 mL、2 mL（Greiner，Bio-one，目录号：667201、616201、623201）

1.5 mL 微量离心管，不含 RNase（SARSTEDT，目录号：72.706.700）

PCR 管和盖子（VWR，目录号：20170-010）

50 mL锥形离心管（Greiner Bio-One，目录号：227261）

血清移液器，2 mL、5 mL、10 mL、50 mL（Greiner Bio-One，目录号：710180、606180、607180、760180、768160）

螺旋盖微管（SARSTEDT，目录号：72.694.305）

Microlance TM 3 针，21G（BD，目录号：304432）

2.5 mL注射器（Greiner Bio-One，目录号：SYR2）

8.5 厘米培养皿（Greiner，Bio-one，目录号：633181）

移液器吸头，过滤，20 µL、200 µL、1,000 µL（Mettler Toledo，Ranin，目录号：17005861、17005863、30389211）

Gene Pulser 电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙（Bio-Rad，目录号：1652083）

聚苯乙烯半微量比色皿（Fisherbrand，目录号：FB55147）

125 mL 带挡板烧瓶（VWR，目录号：214-0458）

250 mL 带挡板烧瓶（VWR，目录号：214-0460）

1 L 带挡板烧瓶（VWR，目录号：214-0464）

微型石英吸收比色皿（Merck，Hellma® ，目录号：Z600210）

方形生物测定皿（Nunc，目录号：240845）

试剂槽，非无菌（VWR，目录号：613-1176）

无菌试剂槽（Axygen，目录号：RES-V-25-S）

深孔 96 孔 2 mL 板（Fisherbrand，目录号：11391555）

深孔 96 孔 1 mL 板（Greiner，Bio-one，目录号：780215）

深孔 96 孔 0.5 mL 板（Greiner，Bio-one，目录号：786261）

细胞培养粘合密封（Azenta Life Sciences，目录号：4ti-0517）

用于 ELISA 和一般孵化的粘合膜（VWR，目录号：60941-062）

PCR 箔密封（Azenta Life Sciences，目录号：4ti-0550）

刚性半裙边96孔PCR板（Thermo Scientific，目录号：AB-0990）

Framestar ® 96孔裙边PCR板（Azenta Life Sciences，目录号：4ti-0960）

96孔ELISA微孔板（Greiner Bio-One，目录号：655061）

Octet SA 生物传感器（Sartorius，目录号：18-5019）

96孔黑色板，聚丙烯（Greiner Bio-One，目录号：655209）

96孔微量滴定板（Greiner Bio-One，目录号：65101）

250 mL PPCO 离心管（Nalgene，目录号：3141-0250）

25 mL高速 PPCO 离心管（Nalgene，目录号：3119-0010）

NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶（Invitrogen，目录号：NP0323BOX）。合适的替代品是自制 12% 电泳和 4% 堆积 SDS-PAGE 凝胶

0.22 μm 注射器过滤器（Agilent，目录号：5190-5116）

µ-Slide 8 孔高分子底室盖玻片（同上，目录号：80807）

带磨边的显微镜载玻片（Fisherbrand，目录号：11572203）

显微镜盖玻片，直径 12 mm，编号 1.5（科学实验室用品，目录号：MIC3334）

6孔细胞培养皿（Greiner Bio-One，目录号：657160）

杜蒙镊子样式 5（电子显微镜科学，目录号：0203-5-PS）

设备

Pipetboy acu 2 移液器控制器（Ingetra，目录号：I155017）

单通道移液器入门套件（Mettler Toledo，Ranin，目录号：30386738）

多通道移液器 1–10 µL、20–200 µL、100–1,200 µL（Mettler Toledo，Ranin，目录号：17013802、17013805、17014496）

微孔板清洗机（Thermo Fisher，Wellwash TM，目录号：5165000）。如果没有可用的洗井器，可以使用多通道移液器或使用装有 PBST 的洗瓶手动清洗孔

CLARIOstar plus 读板器（BMG Labtech，目录号：430-501S-FL）

2 级微生物安全柜（简称安全柜并称为层流）（Contained Air 解决方案，目录号：BioMAT 2）。如果没有可用的安全柜，则使用本生灯工作是一个合适的替代方案。使用易燃乙醇进行明火作业时应小心谨慎

PCR 工作站柜（Bigneat，目录号：MW520-20）

NanoDrop TM One/One C微量紫外-可见分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND-ONE-W）

DynaMag TM 96 面磁铁（Invitrogen，目录号：12331D）

PCR热循环仪（Applied Biosystems，Veriti TM，目录号：4375305）

Eporator（Eppendorf，目录号：4309000027）

ChemiDoc TM成像系统（Bio-Rad，目录号：12003154）

细胞密度计（Fisherbrand，目录号：A0）

多子电泳系统（Flowgen，目录号：FMMS10）

SDS-PAGE 设备，迷你凝胶槽（Invitogen，目录号：A25977）

PowerPac 基本电源（Bio-Rad，目录号：1645050EDU）

JB Nova 水浴（Grant，目录号：JBN5）

干加热块（Grant，目录号：QBD2）

双 LED 蓝/白光透射仪（Thermo Fisher，目录号：LB0100）

Safe Imager TM观察眼镜（Thermo Fisher，目录号：S37103）

HulaMixer TM样品混合器（Invitrogen，目录号：15920D）。使用此样品混合器的搅拌使用以下设置进行：轨道 = 5，rpm = 1

DynaMag TM -2 磁铁（Invitrogen，目录号：12321D）

LSE TM数字微孔板摇床（Corning，目录号：4782-4）。使用微孔板摇床以 500 rpm 的转速进行搅拌

Multifuge X4 Pro-MD（Thermo Scientific，目录号：75009500）。在所有离心步骤中，除非另有说明，否则均使用最大加速度和减速度

Fresco TM 21 微量离心机（Thermo Scientific，目录号：75002555）

轨道振荡培养箱（Shel Lab，目录号：SI6/SI6R）（用于 600 rpm 搅拌步骤）

44R 培养摇床（New Brunswick，Innova ®，目录号：M1282-0006）（用于 200 和 250 rpm 搅拌步骤）

Octet ® R8（Sartorius，目录号：30-0518）

SP8 Lightning 共焦显微镜（徕卡显微系统有限公司）

Heracell TM VIOS 160i CO 2培养箱（Thermo Scientific，目录号：51033559）

Stuart TM SSM3 回转摇杆（Cole-Parmer，目录号：51900-26）

软件和数据集

SnapGene（7.1.0 版，2023 年，2023 年 11 月 28 日发布）；需要许可证

Octet® Analysis Studio 软件（版本12.2.2.26）；需要许可证

用于共焦显微镜的 LasX 软件（版本 5.2.1）；需要许可证

程序

美洲驼免疫

通过使用多达八种不同的蛋白质并行进行肌内免疫，可以在美洲驼中产生抗体。蛋白质的特性取决于预期的应用。我们已经将纳米抗体转化为整合膜蛋白（例如 PEPT2 [4]）、细胞表面糖蛋白（例如 GPC3 [7]）和病毒抗原（例如 SARS-CoV-2 刺突蛋白 [6]）。

将蛋白质抗原以 3 × 200 µg 等分试样储存在 -80 °C 下，优选每等分试样 200 µL 1 mg/mL，储存在 PBS 或最适合该蛋白质的缓冲液中（例如，如果在去污剂溶解的膜蛋白中，则缓冲液中应包含所需量的适当去污剂）。

免疫前，在不含抗凝剂的血管中采集5 mL血液，制备免疫前血清样本。免疫前血清样品的制备详见步骤 C2。

解冻免疫接种中要包含的每种蛋白质的等分试样。将每种蛋白质与等体积的 Gerbu 佐剂轻轻混合，并在骆驼的颈底/肩部皮下注射（每个部位最多 2 mL）。

美洲驼在第 0 天进行免疫，然后在第 28 天和第 56 天进行两次抗原加强。最后一次加强后十天，将来自颈静脉的 170 mL 血液收集到肝素化管中（以防止凝血），用于分离多形核细胞（ PMNC）。另外，在不含抗凝剂的血管中采集5 mL血液，制备免疫后血清样本。步骤 C2 中描述了如何制备免疫后血清样品的详细信息。

血清转化酶联免疫吸附试验

进行血清转化 ELISA 来确认美洲驼的免疫是否成功地产生了对注射抗原的反应。强烈的 ELISA 信号强烈表明可以通过噬菌体展示从创建的文库中分离结合纳米抗体。

在 96 孔 ELISA 微孔板中涂上 100 µL/孔的 10 µg/mL neutrAvidin TM（用 PBS 稀释），并在 4 °C 下孵育过夜。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 100 µL/孔稀释于 PBS 中的 50 nM 生物素化靶蛋白，并在微孔板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。参见一般说明 1。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 250 µL/孔的封闭溶液，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

将 110 µL 在封闭溶液中按 1:10 稀释的免疫前或免疫后血清添加到 96 孔板的第一个孔中。通过向第二个孔中添加 100 µL 封闭溶液并添加第一个孔中的 10 µL 溶液来制备板中血清的系列稀释液。对第三个孔重复上述操作，使血清稀释至十分之一、百分之一和百分之一,000；包括无血清对照。在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 100 µL/孔在 0.1% BSA-PBS 中按 1:2,500 稀释的抗美洲驼-HRP，并在微板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

每孔添加 100 µL ABTS 底物，该底物是通过以 1:1 的比例混合溶液 A 和溶液 B 制备的。避光并在 15 分钟后测量 405 nm 处的吸光度。参见一般说明 2。

VHH文库制备

下面（表 1）是准备 VHH 文库所需的建议实验时间表。协议可以被中断/保持的实例由“暂停点”指示。

表1 VHH文库制备实验时间表

任务1任务2任务3

第一天

PMNC 的分离

(步骤C1)

免疫血清的分离

(步骤C2)

RNA 提取（步骤 C3a–g）暂停点

第二天

RNA提取

（步骤 C3h–i）

VHH1 的反转录和 PCR 扩增（步骤 C4）VHH2 的产生（步骤 C5）暂停点

第三天

pADL23c 的消化（步骤 C6）

暂停点

第 4 天

文库大小测试

（步骤 C7a–g）

第五天

文库大小测试

（步骤 C7h–n）

暂停点

第六天规模化文库制备（步骤 C8a–i）

第 7 天

规模化文库制备（步骤 C8j）

暂停点

PMNC 的分离

以下说明基于在 17 × 10 mL 血管中接收 170 mL 美洲驼血液（不含抗凝剂）。PMNC 的分离应在抽血当天进行。所有工作均在喷洒 5% Chemgene 和 70% EtOH 后在安全柜中进行。

注意：用 2% Virkon 净化所有血液污染的消耗品和液体，然后进行高压灭菌。

使用 10 mL 血清移液器将血液从 2 × 10 mL 血管转移到 1 × 50 mL 锥形离心管中。

将 10 mL PBS 添加到每个空血液瓶中，然后将 20 mL 血液转移到锥形离心管中（步骤 C1a），使每 50 mL 锥形离心管的总体积为 40 mL 稀释血液，或总体积340毫升稀释血液。轻轻翻转试管以确保混合物均匀。

在新鲜的 23 × 50 mL 锥形离心管中，添加 15 mL Histopaque ® -1077，然后轻轻地将 15 mL 稀释血液涂在顶部。参见一般说明 3。添加血液时，将管子与水平面成 45° 角。参见一般说明 4。

关键：此时避免搅动管子以维持正在形成的密度梯度。

使用加速度 = 1 和减速度 = 0将锥形离心管在 18°C 下以 800× g离心 20 分钟。

关键：加速度和减速度非常重要，因为它们将创建并保持所需的梯度。PMNC层的密度梯度和定位结果如图1所示。

图 1. 使用密度梯度从美洲驼血液中分离多形核细胞 (PMNC)。将稀释的美洲驼血液覆盖在 Histopaque ® -1007 上，并在离心后形成 PMNC 和红细胞 (RBC) 层。

从 23 个准备好的血液-Histopaque ® -1077 管中，收集血浆-Histopaque ® -1077 界面处的 PMNC 层（图 1 中的红色方块）。这是通过使用 25 mL 血清移液器并将其放置在界面上方，在移动穿过表面界面的同时向上吸取液体来实现的。任何用 PMNC 吸取的Histopaque ® -1077 或血清都将在接下来的步骤中被洗掉。

将 2× 锥形离心管中分离的 PMNC 转移到单个 50 mL 锥形离心管中。通常，从每个锥形离心管中回收 15–20 mL 的 PMNC。如果收集更多，请确保将 20 mL 分离的 PMNC 添加到新鲜的 50 mL 锥形离心管中。此时应有 23 至 25 × 50 mL 锥形离心管。

向每个含有分离 PMNC 的锥形离心管中添加 PBS 至总体积 40 mL。只要不接触锥形离心管，就可以从 PBS 瓶中倒出。轻轻翻转锥形离心管数次，并在 18°C 下以 250× g离心10 分钟。

倒出上清液，并使用每个颗粒的新 5 mL 血清移液器轻轻地将每个锥形离心管中的颗粒重新悬浮在 5 mL PBS 中。将细胞在 18°C 下以 100× g离心 5 分钟。

注意：此时，开始使用 RNaseZap TM擦拭工作台面、手套以及任何带入安全柜的物品。

使用 5 mL 血清移液器从每个 50 mL 锥形离心管中取出上清液。使用 2 mL 血清移液器轻轻地将总共 1 mL PBS 中的三个锥形离心管中的颗粒重新悬浮到单个 50 mL 锥形离心管中。使用该血清移液管中的最终液体量并将其分配到 1.5 mL 微量离心管中。此时应该有六个 50 mL 锥形离心管和六个 1.5 mL 微量离心管。

从安全柜中取出六个 1.5 mL 微量离心管。在每个 1.5 mL 微量离心管的盖子中，添加 20 μL 细胞和 20 μL 台盼蓝并轻轻混合。使用自动细胞计数器确定细胞数量和活力。从每个锥形离心管中取出的每个样品预计有大约 1×10 7 个细胞，其活力为 98%–100%。因此，预计总产量为 6×10 7个细胞。参见一般说明 5。

注意：喷洒 RNaseZap TM并使用无 RNase 吸头和 1.5 mL 微量离心管后，可以在实验室工作台或 PCR 柜中执行以下步骤。

将细胞悬浮液从每个 50 mL 锥形离心管（步骤 C1i）转移到各自的 1.5 mL 微量离心管中。总共应该有六个 1.5 mL 微量离心管。将细胞在 4°C 下以 100× g沉淀5 分钟。丢弃上清液。现在可以从沉淀中分离 RNA（步骤 C3a）。

关键：立即执行 RNA 提取（步骤 C3）。

免疫前和免疫后血清的分离

血清分离必须在抽血当天进行。这些步骤可以在实验室工作台上分离 PMNC 期间完成。

将凝固的血液在 RT 下孵育 30 分钟。

将血清和血凝块转移至 50 mL 锥形离心管中。这是通过使用 2 mL 血清移液管在血凝块上刺孔并使用条带将凝块和血清引导至 50 mL 锥形离心管中来实现的。将锥形离心管在 4°C 下以 1,000× g离心 10 分钟。

将血清转移至 15 mL 锥形离心管中。可能需要在 4 °C 下以 1,000× g离心10 分钟以获得澄清血清。在螺旋盖微管中制备 500 μL 等份血清，然后储存在 -20°C 下。

RNA提取

注意：所有工作均应在喷洒 RNaseZap TM后在实验室工作台或 PCR 柜中完成。使用不含 RNase 的耗材和带有 RNaseZap TM 的喷雾手套。参见一般说明 6。

向六个 1.5 mL 微量离心管中的每个细胞沉淀（步骤 C1k）中添加 1 mL 冷 TRIzol TM试剂。使用 21 G 针头和 2.5 mL 注射器，通过针头抽吸和分配十次，均化每个 1.5 mL 微量离心管的内容物。

注意：使用针时要小心。

将所得裂解物在冰上孵育 5 分钟，以允许核蛋白复合物完全解离，然后向每个 1.5 mL 微量离心管中添加 0.2 mL 氯仿。

剧烈涡旋每个微量离心管约 10 秒。应出现均匀的粉红色乳状溶液。在冰上孵育 3 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000× g离心15 分钟。混合物分成下层红色苯酚-氯仿层、中间层和无色上层水相。如果上层仍然混浊或未正确形成，请再次涡旋并离心。

使用 200 μL 移液器将约 500 μL 含有 RNA 的上水相转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。可以留下一些上层水层以确保不包含来自界面的沉淀物。加入 0.5 mL 异丙醇，轻轻翻转每个管数次，并在冰上孵育 10 分钟。

在 4°C 下以 12,000× g离心 10 分钟以沉淀 RNA。将 1.5 mL 微量离心管的盖子在转子中朝外，以帮助离心后白色凝胶状颗粒的可视化。使用 200 μL 移液器去除约 900 μL 含有异丙醇的上清液，以确保颗粒不会受到废物的干扰或意外吸入。

将 1 mL 75% 乙醇添加到 1.5 mL 微量离心管中，短暂涡旋，然后在 4 °C 下以 7,500× g离心5 分钟。RNA 沉淀会比上一步结束时看起来更白、更大。使用 200 μL 移液器去除约 900 μL 上清液，以确保沉淀不会受到干扰或意外吸入。

添加 1 mL 75% EtOH，并将纯化的 RNA 储存于-20°C。参见一般注释 7。

暂停点。

从 -20 °C 中取出一支 RNA 微量离心管，并在 4 °C 下以 7,500× g离心5 分钟。使用 200 µL，然后使用 10 µL 移液器丢弃 EtOH，以去除所有 EtOH，而不会意外吸入颗粒。在室温下干燥 10 分钟。

将 RNA 沉淀溶解在 30 µL 无核酸酶水中，并使用 Nanodrop测量 A 260 。每 1.5 mL 管的预期浓度为 500 至 800 ng/μL，A 260/280和 A 260/230的值约为 2.0 。

关键：使用 PCR 柜中的无 RNase 吸头和移液器来测量 RNA 浓度，以避免 Nanodrop 使用的公用吸头和移液器引入 RNase。分离出 RNA 后，尽快进行步骤 C4 以产生比 RNA 更稳定的 cDNA。

VHH1的反转录和PCR扩增

注意：喷洒 RNaseZap TM后，在实验室工作台或 PCR 柜中工作。使用不含 RNase 的耗材和带有 RNaseZap TM 的喷雾手套。参见一般说明 6。

在 PCR 管 (1 × 50 µL) 中准备以下反应（表 2）。

表 2. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用9.5微升

10 µM CALL 001 引物0.5微米2.5微升

10 µM CALL 002 引物0.5微米2.5微升

2× Platinum TM SuperFi TM RT-PCR Master Mix1×25微升

1 µg 模板 RNA（步骤 C3i）200纳克10微升

SuperScript TM IV RT 混合液0.5微升

全部的不适用50微升

短暂涡旋并离心反应管并置于冰上。

如下设置热循环仪并执行 PCR（表 3）。

表 3. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

逆转录5510分钟1

逆转录失活/初始变性982分钟

变性9810秒30

退火6610秒

扩大7230秒

最终延期725分钟1

抓住12无限保持-

注意：从此时起无需维持无 RNase 条件。在实验室工作台上工作。

将 10 µL 6× DNA 凝胶上样缓冲液添加到反应管中，并在含有 1× SYBR TM安全DNA 凝胶染色剂的 0.7% 琼脂糖凝胶上沿着 1× GeneRuler 1 kb DNA 梯子的泳道运行。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。

使用 LED 蓝色透照仪可视化扩增的 700 bp 片段 (VHH-CH2)，使用手术刀从凝胶中切除，并根据制造商的方案使用 Nucleospin 凝胶和 PCR 清理套件进行凝胶提取。在 50 µL NE 缓冲液的最终体积中洗脱。

注意：在从琼脂糖凝胶中切除条带的过程中观察 DNA 时，请使用 Safe Imager TM观察眼镜，并在使用手术刀时要小心。

使用 Purelink PCR 纯化试剂盒，将 4 倍体积的 B2 缓冲液 (200 µL) 添加到凝胶提取的产物中，并使用 Purelink PCR 纯化试剂盒中的一根 Purelink 柱进行纯化，并在 25 µL E1 缓冲液中洗脱。测量 A 280，预计浓度约为 40–50 ng/μL。

将 6× DNA 凝胶上样缓冲液与 120 ng VHH1（步骤 C4f）混合至 1× 终浓度，并在含有 1× SYBR TM安全DNA的 1% 琼脂糖凝胶上与 1× HyperLadder TM 1 kb DNA 梯子孔一起运行凝胶染色以确定纯度。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 2 所示。

图 2. 约 700 bp 的扩增 VHH1 样本在含有 1 × SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上可视化。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

VHH2的生产

在 PCR 管中准备以下 PCR 反应（6 × 50 µL 反应）（表 4）。

表 4. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用19微升

10 µM VHH For2 引物0.5微米2.5微升

10 µM VHH Rev 底漆0.5微米2.5微升

2× Phusion 快速 PCR 预混液1×25微升

5 ng/μL VHH1（步骤 C4f）1纳克10微升

全部的不适用50微升

短暂涡旋并离心反应管。

如下设置热循环仪并执行 PCR（表 5）。

表 5. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性9830秒1

退火9810秒30

扩大5530秒

最终延期7220秒

抓住725分钟1

变性12无限保持-

将所有六个反应合并到一个 2 mL 微量离心管中。使用 Purelink PCR 纯化试剂盒，将 4 倍体积的 B2 缓冲液 (1.2 mL) 添加到扩增的 PCR 产物中，并在两个 Purelink 柱之间进行纯化，每个柱使用 25 µL E1 缓冲液进行洗脱。将两种洗脱液合并到一根 1.5 mL 微量离心管中，测量 A 280，并预计浓度在 200 至 300 ng/μL 之间。

将 6× DNA 凝胶上样缓冲液与 120 ng VHH2（步骤 C5d）混合至 1× 终浓度，并在含有 1× SYBR TM安全DNA的 1% 琼脂糖凝胶上与 1× Hyperladder TM 1 kb DNA 梯子孔一起运行凝胶染色以确定纯度。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 3 所示。

暂停点。

图 3. 约 400 bp 的扩增 VHH2 样本在含有 1× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上可视化。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

pADL23c 的消化

在 PCR 管中准备以下限制性消化反应（10 × 100 µL 反应）（表 6）。

表 6. 限制性酶切反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用83微升

rCutSmart TM缓冲液1×10微升

斯菲尔5 单位2.5微升

400 ng/μL 载体 DNA1.8微克4.5微升

全部的不适用100微升

短暂涡旋并离心反应管。

50°C 孵育 2 小时。

将 20 µL 6× DNA 凝胶上样缓冲液添加到每个反应管中，并在含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的 0.7% 琼脂糖凝胶上与 1× GeneRuler 1 kb DNAladder 的孔一起运行。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 4 所示。

图 4. 在凝胶提取前对 pADL23c 噬菌粒载体进行 SfiI 消化后，制备型 0.7% 琼脂糖凝胶，其中含有 1× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂，对载体骨架（上条带）和填充片段（下条带）进行染色。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

使用 LED 蓝色透照仪可视化消化的、较高分子量、约 3,000 bp 的载体主链，使用手术刀从凝胶中切除，并根据制造商的方案使用 Nucleospin 凝胶和 PCR 清理套件中的 10 个旋转柱进行凝胶提取。使用 50 µL NE 缓冲液洗脱每列，并将所有洗脱液汇集到单个 1.5 mL 微量离心管中。

注意：在从琼脂糖凝胶中切除条带的过程中观察 DNA 时，请使用 Safe Imager TM观察眼镜，并在使用手术刀时要小心。

使用 Purelink PCR 纯化试剂盒，将 4 倍体积的 B3 缓冲液 (2 mL) 添加到凝胶提取的产物中，并使用 Purelink PCR 纯化试剂盒中的一根 Purelink 柱进行纯化，并在 50 µL E1 缓冲液中洗脱。测量 A 280并预计浓度在 50 至 80 ng/μL 之间。

将 6× DNA 凝胶上样缓冲液与 120 ng VHH2 混合（步骤 C5d），消化 pADL23c 主链（步骤 C6f）至终浓度 1×，并在 1 % 琼脂糖上与 1× HyperLadder TM 1 kb DNA 梯子孔一起运行含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色的凝胶以确定纯度。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 5 所示。

暂停点。

图 5. 线性化和纯化的 pADL23c（泳道 1 和 2）和纯化的 VHH2（泳道 3）样品在含有 1× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上可视化。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

文库大小测试

在 PCR 管 (1 × 10 µL) 中准备以下输注反应（表 7）。

表 7. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用5微升

5× CEII 缓冲器1×2微升

100 ng/μL VHH2 插入片段（步骤 C5d）100纳克1微升

20 ng/μL 载体 DNA（步骤 C6f）20纳克1微升

外切酶II1微升

全部的不适用10微升

短暂涡旋并离心反应管。

使用热循环仪在 42°C 孵育 30 分钟。添加 40 μL TE 缓冲液以终止反应。

使用 Purelink PCR 纯化试剂盒，将 4 倍体积的 B3 缓冲液 (200 µL) 添加到融合产品中，并使用一根 Purelink 柱在 20 µL 无核酸酶水中洗脱进行纯化。

注意：在安全柜内工作。

在 1.5 mL 微量离心管中轻轻混合 5 µL 纯化的输注反应与 30 µL 感受态 TG1，并转移到冷冻的 1 mL 电穿孔比色皿中。

在 1.7 kV 下进行电穿孔，并立即将 400 µL 恢复介质添加到比色皿中。将内容物转移至 2 mL 微量离心管中，并在 37°C 下以 600 rpm 搅拌孵育 1 小时。参见一般说明 8。

使用 50 µL 培养物，在 2× YT 中制备 1:10、1:100 和 1:1,000 稀释液。将 100 µL 涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上直至干燥。37°C 孵育过夜。

使用以下公式以每毫升菌落形成单位 (CFU/mL) 估算文库大小：菌落数 × 10（达到 mL）× 0.4（体积）× 稀释度。参见一般注释 9。

根据估计的小规模文库大小，考虑到 5 µL 的融合反应产生 × 大小的文库，设置所需的反应数量。计算制作大小为 1 × 10 6的文库需要多少微升的输注反应。参见一般注释 10。

为了验证小规模文库中全长 VHH 克隆的数量，在步骤 C7g 中从平板中随机选择的 48 个克隆中进行了菌落 PCR 扩增 ~500 bp VHH 基因。在 2 mL 微量离心管中制备以下 PCR 反应主混合物（表 8）。

表 8. PCR 反应组成

试剂最终浓度单次反应体积主混合物体积

无核酸酶水不适用20.75微升1037.5 µL

10 µM Doctor seq Fwd 引物0.2微米0.5微升25微升

10 µM 博士 seq Rev 引物0.2微米0.5微升25微升

10× Taq 缓冲液1×2.5微升125微升

25 mM dNTP0.25毫米0.25微升12.5微升

Taq聚合酶1 单位0.5微升25微升

全部的不适用25微升1250微升

短暂涡旋并离心反应管。

将 25 μL 主混合物移液至 96 孔刚性半裙边 PCR 板的 48 孔中。用 48 × 10 µL 吸头挑取 48 个菌落，并将其放入每个填充的孔中。使用多道移液器取出吸头。用 PCR 箔密封盖住 PCR 板。

如下设置热循环仪并执行 PCR（表 9）。

表 9. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性957分钟1

退火9515秒35

扩大5530秒

最终延期681分40秒

抓住685分钟1

变性12无限保持-

将 20 µL 2× DNA 凝胶上样缓冲液添加到 PCR 板的每个孔中，并在含有 1× SYBR TM 安全 DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上的 1× GeneRuler 1 kb DNAladder 孔旁边，向每个孔中上样10 µL 。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。在图 6 中，进行菌落 PCR 的 48 个克隆中有 46 个拥有与扩增的 VHH 基因相对应的约 500 bp 条带。两个非阳性克隆用星号表示。

暂停点。

图 6. 从小规模文库制备中随机选择的 48 个克隆的菌落 PCR

规模化文库制备

在 PCR 管 (20 × 20 µL) 中准备以下反应（表 10）。

表 10. In-Fusion 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用9微升

5× CEII 缓冲器1×4微升

50 ng/μL VHH2 插入片段（步骤 C5c）100纳克2微升

5 ng/μL 载体 DNA（步骤 C6f）20纳克4微升

外切酶II1微升

全部的不适用20微升

短暂涡旋并离心反应管。

在热循环仪中 42°C 孵育 30 分钟。

将反应合并到单个 2 mL 微量离心管中。使用 Purelink PCR 纯化试剂盒，将 4 倍体积的 B3 缓冲液 (1.6 mL) 添加到融合产品中，并使用一根 Purelink 柱在 50 µL 无核酸酶水中洗脱进行纯化。测量 A 280，预计浓度在 35 至 50 ng/μL 之间。

注意：在安全柜内工作。

TG1 细胞在单独的反应中通过电穿孔进行转化，以创建规模化的文库。在 1.5 mL 微量离心管中轻轻混合 6 µL 纯化的融合反应与 30 µL 的主管 TG1，然后转移到冷冻的 1 mL 电穿孔比色皿中。在 1.7 kV 下电穿孔，立即将 960 µL 恢复介质添加到比色皿中，并转移到 50 mL 锥形离心管中。参见一般说明 8。

使用八种单独的融合 TG1 混合物重复此操作总共八次。

将两个比色杯的电穿孔细胞合并到单个 50 mL 锥形离心管中，并在 37°C 下以 200 rpm 摇动孵育 1 小时。您总共应该有四个锥形离心管。

使用锥形离心管之一中的 50 µL，并在 2× YT 中制备 1:10、1:100 和 1:1,000 稀释液。将 100 µL 每种稀释液涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上，直至干燥。37°C 孵育过夜。使用这些板来估计文库大小 (CFU/mL) = 菌落数 × 10（达到 mL）× 1.92（体积）× 稀释度。参见一般注释 9。

将四个锥形离心管中每一个的整个培养物接种到装有含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2% 琼脂 LB 板的单独生物测定皿上。总共应该有四块板。将整个体积展开直至干燥并在 37°C 下孵育过夜。预计密度类似于图 7 所示，相当于 1 × 10 6 CFU/mL 大小的文库。参见一般说明 11。

图 7. 1 × 10 6 CFU/mL 文库在生物测定板上的预期密度

将每个生物测定板的菌落重悬于 6 mL 2× YT（含终浓度 25% 甘油）中，并转移至单个 50 mL 锥形离心管中。通过血清移液器充分混合，并在螺旋盖微管中制备 1 mL 等分试样，并将其储存在 -80°C。这是 VHH 库库存，用于第一轮淘选。

暂停点。

平移

下面是建议的淘选、通过 ELISA 进行命中鉴定和小规模表达的时间表，以最大限度地延长实验室时间，并在多人使用共享资源对多种蛋白质进行多次淘选活动时留出重叠空间（表 11）。

表11.通过淘选、ELISA和小规模表达鉴定纳米抗体结合剂的实验时间表

周一周二周三周四星期五

第一周扩增 VHH 文库（步骤 D3）恢复文库噬菌体（步骤 D3）

第一次平移（步骤D4）

恢复菌落草坪（步骤 D4）

扩增子文库（步骤D5）

子文库噬菌体的回收（步骤D5）

第二次平移（步骤D6）

将板从培养箱中取出并放入冰箱中。

第 2 周挑选 93 个菌落并过夜生长（步骤 D7）

准备主板（步骤D7）

开始培养抗 M13 ELISA（步骤 D8）

抗-M13 ELISA（步骤D8）PCR、净化、测序（步骤D9）

第三周小规模过夜培养（步骤 E1）小规模培养至 OD 并用 IPTG 诱导（步骤 E1）

周质分离（步骤 E1）

Ni-NTA纯化（步骤E2）

脱盐（步骤E3）

滴定 ELISA（步骤 E4）

解离速率测定（步骤E5）

准备对数期 TG1

注意：在安全柜内工作。

在不含抗生素的 1% 琼脂 LB 板上划线 TG1，并在 37°C 下孵育过夜。

将 20 mL 的 2× YT 与单个 TG1 菌落接种到 100 mL 一次性带挡板锥形烧瓶中，并在 37°C 下以 200 rpm 摇动孵育过夜。

将 20 mL 50% 甘油与过夜培养物混合，并以 1 mL 等分试样储存在 -80°C 下。这是 TG1 库存，我们在需要时用它来制备对数期 TG1 培养物。

向 125 mL 一次性带挡板锥形烧瓶中的 25 mL 2× YT 中添加足够的 TG1 库存（步骤 D1c），以使起始 OD 600约为 0.05。参见一般说明 12。

将 TG1 培养物在 37°C 下以 200 rpm 的转速振荡孵育，直至 OD 600达到 0.4–0.6。这大约需要 1.5-2 小时。这是对数期 TG1，应保存在冰上并在 2 小时内使用。

准备 CM13K 辅助噬菌体

注意：噬菌体可以感染所有细菌。如果在蛋白质表达实验室工作，必须注意不要将噬菌体释放到公共区域。如果表面容易腐蚀，请先用 5% Chemgene 擦拭表面，然后用 70% EtOH 擦拭。鼓励使用过滤吸头以减少气溶胶。所有受污染的消耗品必须用 2% Virkon 消毒并高压灭菌。如果可能，对步骤 D1–D5 中列出的所有培养物使用一次性锥形瓶。

注意：在安全柜内工作。

将 20 mL 的 2× YT 与 200 μL 对数相 TG1（步骤 D1e）接种到 125 mL 一次性挡板锥形烧瓶中。添加 1 µL 先前制备的 1 × 10 13 PFU/mL CM13K 辅助噬菌体甘油库存（步骤 D2h），并在 37°C 下以 250 rpm 摇动孵育 4 小时。

在两个 1 L 一次性带挡板锥形烧瓶中，添加 250 mL 含有 25 µg/mL 卡那霉素的 2× YT 和 10 mL 制备的培养物。在 25°C 下以 250 rpm 摇动孵育过夜。

将细胞在 4,500× g下于 4°C 沉淀 10 分钟，并将约 170 mL 含有上清液的噬菌体转移到三个 250 mL PPCO 离心管中。将约 35 mL 冰冷的 PEG/NaCl 添加到每个管中，翻转并轻轻旋转，将 PEG/NaCl 溶液与噬菌体上清液混合。在冰上孵育 1 小时。

将管在 4°C 下以 12,000× g离心 15 分钟，并将三个沉淀分别重新悬浮在 4 mL 冰冷的无菌 PBS 中。将重新悬浮的颗粒合并到单个 25 mL 高速 PPCO 离心管中，并添加 2.5 mL 冰冷的 PEG/NaCl。轻轻旋转并翻转，将 PEG/NaCl 溶液与噬菌体上清液混合。在冰上孵育 30 分钟。

在 4°C 下以 12,000× g离心10 分钟，并将沉淀重悬于 12 mL 冰冷的无菌 PBS 中。保持在 4°C，直到噬菌体浓度（以每毫升噬菌斑形成单位 (PFU/mL) 表示）通过分光光度法或噬菌斑测定法确定，这两种方法都应产生相似的值。

对于噬菌体浓度的分光光度测定，在 1.5 mL 微量离心管中，添加 998 µL PBS 和 2 µL 噬菌体（步骤 D2e），转移到石英比色皿中，并测量 268 nm 处的吸光度。计算 PFU/mL 时考虑到 1.0 的 A 268相当于 5 × 10 12 PFU/mL [11]。

为了使用噬菌斑测定法测定噬菌体浓度，在对数期 TG1（步骤 D1e）中制备 CM13K 辅助噬菌体（步骤 D2e）的十倍系列稀释液（10 -1至 10 -25 ），并在 RT 下孵育 5 分钟。将 10 -15至 10 -25稀释液的 100 µL 板接种到不含抗生素的 1% 琼脂 LB 板上。每个板添加 3 mL 0.7% 琼脂 LB（55 °C），并在整个板表面上旋转。让顶部琼脂凝固并在 37°C 下孵育过夜。使用以下公式计算 PFU/mL：斑块数（透明区域）× 10（达到 mL）× 稀释度。

使用冰冷的无菌 PBS将 CM13K 辅助噬菌体（步骤 D2e）稀释至 2 × 10 13 PFU/mL，添加等体积的冰冷的 50% 甘油，轻轻混合以达到 1 × 10 13 PFU的最终浓度/毫升。将 100 µL 等份储存在 500 µL 微量离心管中。这是 CM13K 辅助噬菌体原液。每次解冻新的 100 µL 等分试样时，将 12 µL 分装到 9 × PCR 管中，以避免冻融原始 100 µL 等分试样。

扩增和恢复文库

注意：在安全柜内工作。

向 250 mL 一次性带挡板锥形瓶中的 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2× YT 中添加足够的 VHH 文库储备液（步骤 C8j），使起始 OD 600约为 0.05。参见一般说明 13。

在 37°C 下以 200 rpm 的转速振荡孵育培养物，直至 OD 600达到 0.4–0.6。这大约需要 2 小时。参见一般注释 14。

将 10 mL 该培养物转移至 50 mL 锥形离心管中，添加 10 µL CM13K 辅助噬菌体原液（步骤 D2h），并通过轻轻旋转进行混合。37°C 孵育 1 小时，无需搅拌。

将细胞在 18°C 下以 2,800× g沉淀10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 25 µg/mL 卡那霉素的 2× YT 中，并转移至 250 mL 一次性带挡板的锥形烧瓶中。在 25°C 下以 250 rpm 摇动孵育过夜。

将过夜培养物转移至 50 mL 锥形离心管中，并在 4 °C 下以 3,200× g沉淀细胞10 分钟。

将 40 mL 含有上清液的噬菌体倒入新的 50 mL 锥形离心管中，并添加 10 mL 冰冷的 PEG/NaCl。翻转数次并在冰上孵育 1 小时。

在 4°C 下以 3,200× g离心 10 分钟，沉淀沉淀的噬菌体。将噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL 微量离心管中。

4°C 20,000× g离心1 分钟后，将含有噬菌体的上清液转移至新的 2 mL 微量离心管中。添加 250 µL 冰冷的 PEG/NaCl 并翻转管，直至出现均匀的白色悬浮液。在冰上孵育 30 分钟。

在 4°C 下以 20,000× g离心 15 分钟，沉淀沉淀的噬菌体。将沉淀的噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL 微量离心管中。

在 4°C 下以 20,000× g最终离心1 分钟后，将含有噬菌体的上清液转移到新的 2 mL 微量离心管中。这是分离的文库噬菌体；应将其保存在冰上或 4°C 下，并可稳定一个月。

使用对数期 TG1 细胞从 10 -1到 10 -12十倍连续稀释，滴定 15 µL 库噬菌体（步骤 D1e）。在 37 °C 孵育 15 分钟后，将 50 µL 10 -4至 10 -12稀释液涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上，直至干燥，并在 37 °C 下孵育过夜。包括仅 TG1 的控件。参见一般注释 15。

使用这些板来估计可以从文库中产生多少噬菌体。计算公式为：PFU/mL = 菌落数 × 10（达到 mL）× 0.05（体积）× 稀释度。预计为 1 × 10 10 –1 × 10 13 PFU/mL。参见一般注释 16。

第一轮平移

注意：在实验室工作台上工作。

在 2 mL 微量离心管中，添加 500 µL StartingBlock 缓冲液和 500 µL 分离的文库噬菌体（步骤 D3j）。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

添加适当体积的生物素化抗原，以在 1.5 mL 中达到 50 nM 终浓度（通过步骤 D4d 实现）。参见一般说明 1。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 1 小时。

此时，可以开始培养对数期 TG1 细胞（步骤 D1d-e），这将确保噬菌体洗脱后细胞达到所需的 OD 600 （步骤 D4h）。

噬菌体与抗原孵育 30 分钟（步骤 D4b），在新的 2 mL 微量离心管中添加 100 µL 链霉亲和素 Dynabeads TM M-280。用 500 μL 的 PBS 清洗珠子两次，然后添加 500 μL 的 StartingBlock 缓冲液。使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

将 1 mL 带有抗原的封闭噬菌体（步骤 D4b）转移至封闭珠子（步骤 D4d）。总体积为 1.5 mL，最终抗原浓度现在为 50 nM。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 15 分钟。

将微量离心管放在 DynaMag TM -2 磁铁上。一旦珠子被拉到一边，丢弃上清液中未结合的噬菌体。将珠子重新悬浮在 500 μL 的 PBST 中，然后使用磁铁将珠子拉到一边，洗掉松散结合的噬菌体。用 PBST 重复此洗涤过程总共六次，然后用 PBS 重复一次。

将 500 µL 250 µg/mL 胰蛋白酶添加到珠子中。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

使用 DynaMag TM -2 磁铁沉淀珠子后，从第一个平底锅中收集上清液中洗脱的噬菌体。

注意：在安全柜内工作。

在 50 mL 锥形离心管中，将第一个平底锅（步骤 D4h）中的 500 μL 洗脱噬菌体添加到 10 mL 对数期 TG1 细胞（步骤 D4c）中，并在 37°C 下孵育 30 分钟，无需搅拌。

将细胞在 18°C 下以 2,800× g沉淀10 分钟，然后重悬于 1 mL 2× YT 中。将整个体积涂在含有 1% 琼脂 LB 和 100 µg/mL 氨苄青霉素的生物测定皿上直至干燥，并在 37 °C 下孵育过夜。

将菌落重悬于 6 mL 2× YT（含有终浓度 25% 甘油）中，并以 1 mL 等分试样储存在 -80 °C 的冷冻管中。这是 pan 1 子库库存。

扩增和恢复子库

注意：在安全柜内工作。

向 250 mL 一次性带挡板锥形瓶中的 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2× YT 中添加足够的盘 1 子库库存（步骤 D4k），使起始 OD 600约为 0.05。参见一般说明 13。

在 37°C 下以 200 rpm 的转速振荡孵育培养物，直至 OD 600达到 0.4–0.6。这大约需要 2 小时。参见一般注释 14。

将 10 mL 该培养物转移至 50 mL 锥形离心管中，添加 10 µL CM13K 辅助噬菌体原液（步骤 D2h），并通过轻轻旋转进行混合。37°C 孵育 1 小时，无需搅拌。

将细胞在 18°C 下以 2,800× g沉淀10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 25 µg/mL 卡那霉素的 2× YT 中，并转移至 250 mL 一次性带挡板的锥形烧瓶中。在 25°C 下以 250 rpm 摇动孵育过夜。

将过夜培养物转移至 50 mL 锥形离心管中，并在 4 °C 下以 3,200× g沉淀细胞10 分钟。

将 40 mL 含有上清液的噬菌体倒入新的 50 mL 锥形离心管中，并添加 10 mL 冰冷的 PEG/NaCl。翻转数次并在冰上孵育 1 小时。

在 4°C 下以 3,200× g离心 10 分钟，沉淀沉淀的噬菌体。将噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL 微量离心管中。

4°C 20,000× g离心1 分钟后，将含有噬菌体的上清液转移至新的 2 mL 微量离心管中。添加 250 µL 冰冷的 PEG/NaCl，并翻转微量离心管，直至出现均匀的白色悬浮液。在冰上孵育 30 分钟。

在 4°C 下以 20,000× g离心 15 分钟，沉淀沉淀的噬菌体。将沉淀的噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL 微量离心管中。

在 4°C 下以 20,000× g最终离心1 分钟后，将含有噬菌体的上清液转移到新的 2 mL 微量离心管中。这是分离的 pan 1 噬菌体；应将其保存在冰上或 4°C 下，并可稳定一个月。

第二轮平移

注意：在实验室工作台上工作。

在 2 mL 微量离心管中，添加 500 μL 的 StartingBlock 缓冲液和 500 μL 的分离盘 1 噬菌体（步骤 D5j）。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

添加适当体积的生物素化抗原，以在 1.5 mL 中达到 5 nM 终浓度（通过步骤 D6d 实现）。参见一般说明 1。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 1 小时。

此时，可以开始培养对数期 TG1 细胞（步骤 D1d-e），这将确保噬菌体洗脱后细胞达到所需的 OD 600 （步骤 D6h）。

噬菌体与抗原孵育 30 分钟（步骤 D6b），在新的 2 mL 微量离心管中添加 10 µL 链霉亲和素 Dynabeads TM M-280。用 500 μL 的 PBS 清洗珠子两次，然后添加 500 μL 的 StartingBlock 缓冲液。使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

将 1 mL 带有抗原的封闭噬菌体（步骤 D6b）转移至封闭珠子（步骤 D6d）。总体积现在为 1.5 mL，最终抗原浓度现在为 5 nM。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 15 分钟。

将微量离心管放在 DynaMag TM -2 磁铁上。一旦珠子被拉到一边，丢弃上清液中未结合的噬菌体。将珠子重新悬浮在 500 μL 的 PBST 中，然后使用磁铁将珠子拉到一边，洗掉松散结合的噬菌体。用 PBST 重复此洗涤过程总共六次，然后用 PBS 重复一次。

将 500 µL 250 µg/mL 胰蛋白酶添加到珠子中。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

使用 DynaMag TM -2 磁铁沉淀珠子后，从第二个平底锅中收集上清液中洗脱的噬菌体。

注意：在安全柜内工作。

为了获得主板的单个菌落（步骤D7），使用对数期TG1细胞（步骤D6c）使用从10 -1到10 -12的十倍系列稀释液滴定洗脱的第二泛噬菌体（步骤D6h）。在 37 °C 孵育 15 分钟后，将 50 µL 10 -4至 10 -12稀释液涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上，直至干燥，并在 37 °C 下孵育过夜。包括仅 TG1 控件。请参阅一般说明 15 和故障排除 1。

选择具有大约 100-300 个单独菌落的稀释度。

主板的准备

注意：在安全柜内工作。

在 1 mL 深井块中，添加 180 µL/孔含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2× YT。使用 93 × 10 µL 吸头从 TG1 中滴定盘 2 噬菌体的选定板中挑选 93 个单独的克隆（步骤 D6j），并将其放入每个填充的孔中。使用多道移液器取出吸头。让 F12、G12 和 H12 孔没有菌落，作为我们的对照。

用细胞培养粘合密封盖住板，并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。该过夜培养物将用于制备两个储备板：PCR 模板（步骤 D7c）和主板（步骤 D7d）。首先准备 PCR 板，然后准备主板。

将 20 µL/孔的过夜培养物转移至带裙边的 PCR 板。用 PCR 箔密封盖板并储存在-80°C。这是 PCR 模板板。

向剩余的过夜培养物中，添加 150 µL/孔的 50% 甘油，并通过移液混合。用 PCR 箔密封盖板并储存在-80°C。这是主盘。

抗 M13 噬菌体 ELISA

注意：在安全柜内工作。

在已填充 150 µL/孔 2× YT 的 1 mL 深孔板中，添加 10 µL/孔的母板（步骤 D7d）。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育 3 小时。

通过将 2 µL CM13K 辅助噬菌体库存（步骤 D2h）添加到 10 mL 2× YT 中，制备 CM13K 辅助噬菌体混合物。添加 30 µL/孔准备好的 CM13K 辅助噬菌体混合物，并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育 1 小时。

将细胞在 18°C 下以 2,800× g沉淀10 分钟，并将每孔重悬于 400 µL 含有 100 μg/mL 氨苄青霉素和 25 μg/mL 卡那霉素的 2× YT 中。

用细胞培养粘合密封盖住板，并在 25°C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。

4°C 4,000× g离心15 分钟后，将含有上清液的噬菌体转移到新的 0.5 mL 深孔板中，并用粘合膜覆盖。4℃保存；这个稳定了一个月。这是用于抗-M13 ELISA（步骤D81）的培养物。

注意：在实验室工作台上工作。

在 96 孔 ELISA 微孔板中涂上 100 µL/孔的 10 µg/mL neutrAvidin TM（用 PBS 稀释），并在 4 °C 下孵育过夜。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 100 µL/孔稀释于 PBS 中的 50 nM 生物素化靶蛋白，并在微孔板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。参见一般说明 1。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 250 µL/孔的封闭溶液，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 50 µL/孔的封闭缓冲液，然后添加 50 µL/孔的抗 M13 ELISA 培养物（步骤 D8e）。在对照孔 F12、G12 和 H12 中，添加 50 µL/孔的封闭缓冲液和 50 µL/孔的 PBS。在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 100 µL/孔的用 0.1% BSA-PBS 稀释的抗 M13-HRP（最终浓度为 0.25 µg/mL），并在微板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

每孔添加 100 µL ABTS 底物，该底物是通过以 1:1 的比例混合溶液 A 和溶液 B 制备的。避光并测量 405nm 处的吸光度。参见一般说明 2。

吸光度高于 1 的孔被视为命中。请参阅故障排除 2 和 3。

ELISA 命中的 PCR 和测序

在 5 mL 管中制备以下 PCR 反应主混合物，并在 96 孔刚性 PCR 板中设置 96 个 PCR 反应（表 12）。参见一般注释 17。用 PCR 箔密封盖住板。

表 12. PCR 反应组成

试剂最终浓度单次反应体积主混合物体积

无核酸酶水不适用18.25微升1,825 µL

10 µM Doctor seq Fwd 引物0.2微米0.5微升50微升

10 µM 博士 seq Rev 引物0.2微米0.5微升50微升

10× Taq 缓冲液1×2.5微升250微升

25 mM dNTP0.25毫米0.25微升50微升

Taq聚合酶1 单位0.5微升50微升

PCR 模板（步骤 D7c）2.5微升-

全部的不适用25微升2275微升

如下设置热循环仪并执行 PCR（表 13）。

表 13. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性957分钟1

退火9515秒35

扩大5530秒

最终延期681分40秒

抓住685分钟1

变性12无限保持-

添加 45 µL Highprep PCR 磁珠/孔，并用移液器混合。置于 DynaMag TM 96 侧磁铁上 1 分钟，或直至溶液澄清且珠子已被拉到 PCR 管壁上，并吸出上清液。

添加 100 µL 70% EtOH，并用移液器混合。置于 DynaMag TM 96 侧磁铁上 1 分钟，或直至溶液澄清且珠子已被拉到 PCR 管壁上，并吸出上清液。重复此洗涤步骤总共三次。

将珠子在 RT 下干燥 10 分钟，然后将 25 µL EB 缓冲液（来自 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒）添加到珠子中，并用移液器混合。置于 DynaMag TM 96 侧磁铁上 1 分钟，或直至溶液澄清且珠子已被拉到 PCR 管壁上，然后将 20 µL 含有上清液的纯化 PCR 产物转移至新的 96 孔裙边 PCR 板。

如果有可以一次测量多个样品的纳米光度计（例如 Implen TM NanoPhotometer ® N120），请测量每个孔的 A 280。如果有单个样品纳米光度计，请测量随机选择的克隆的A 280 。预计约为 15–25 ng/µL。或者，可以将随机选择的克隆的 5 µL 纯化 PCR 产物与 5 µL 2× DNA 凝胶上样缓冲液混合，并在含有 1× SYBR 的 1% 琼脂糖凝胶上沿着 1× GeneRuler 1 kb DNA 梯度泳道运行TM Safe DNA 凝胶染色剂。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。对凝胶进行成像并确认是否存在扩增的 ~500 bp VHH 基因。

用 PCR 箔密封盖住板，并与 Doctor seq Fwd 引物一起送去测序。参见一般注释 18。

小规模表达和纯化

通过进行小规模表达来鉴定表达和纯化良好的纳米抗体克隆。纯化后添加脱盐步骤可以使用滴定 ELISA 或生物层干涉测量法 (BLI) 确认纳米抗体与抗原的结合。可以使用 BLI 确定纳米抗体的解离速率 (k dis ) 以及初步表位分级。这些因素有助于选择哪些纳米抗体将用于大规模表达。

小规模表达

注意：在安全柜内工作。

在每孔已装有 180 µL 2× YT（每孔含有 100 µg/mL 氨苄青霉素）的 1 mL 深孔板中，根据主板的测序结果添加 10 µL 选定的克隆（步骤 D7d）。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。

将每个克隆的过夜培养物的 10 µL 添加到已装满 4 mL/孔含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、0.1% 葡萄糖和 2 mM MgCl 2的极好的肉汤的 24 孔板中。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下孵育 4 小时，以 600 rpm 摇动。

向每个孔中添加 4 µL 1 M IPTG（1 mM 最终浓度），用细胞培养粘合密封盖住，并在 25 °C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。

注意：在实验室工作台上工作。

将细胞在 4,000× g、4°C 下沉淀 15 分钟，然后将沉淀轻轻重悬于 300 µL 1 mg/mL 硫酸多粘菌素 B 中。用粘合膜盖住板，并使用微孔板摇床在室温下搅拌 1 小时。

将细胞在 4°C 下以 4,000× g沉淀10 分钟，并将含有上清液的周质转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。

将 10 µL 分离的周质与 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95 °C 下孵育 5 分钟，并在 1× MES 缓冲液中的 NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM 未染色标准品一起运行在 200 V 下持续 40 分钟。

使用 InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂染色。预计显着条带约为 14 kDa。请参阅 Expasy Protparam（数据分析，步骤 1d）的结果，了解每个克隆的确切大小。

亲和纯化

注意：在实验室工作台上工作。

根据制造商的说明，使用 Ni-NTA 旋转柱纯化组氨酸标记的纳米抗体。简而言之，将 600 µL 平衡缓冲液添加到 Ni-NTA 旋转柱中，并在 4°C 下以 2,900 rpm (800× g ) 离心 2 分钟。

将周质样品添加到 Ni-NTA 旋转柱中，并在 4°C 下以 1,600 rpm（200× g）离心 5 分钟。

通过添加 600 μL 平衡缓冲液并在 4°C 下以 2,900 rpm (800× g ) 离心 2 分钟，清洗 Ni-NTA 旋转柱 3 次。

将 Ni-NTA 旋转柱转移到新的 2 mL 微量离心管中，并添加 100 μL 洗脱缓冲液。在室温下孵育 2 分钟，然后在 4 °C 下以 2,900 rpm (800× g ) 离心 2 分钟。流出物含有纯化的纳米抗体。

将 5 µL 纯化的纳米抗体与 5 µL 2× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后在 1× MES 缓冲液中的 NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM 未染色标准品一起运行在 200 V 下持续 40 分钟。

使用 InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂染色。预期条带约为 14 kDa。请参阅 Expasy Protparam（数据分析，步骤 1d）的结果，了解每个克隆的确切大小。

脱盐

注意：在实验室工作台上工作。

根据制造商的说明，使用 Zeba TM旋转脱盐柱对 Ni-NTA 纯化的纳米抗体进行脱盐。简而言之，折断脱盐柱的底盖，松开顶盖，并将旋转柱放入新的 2 mL 微量离心管中。在 4 °C 下以 1,500× g离心1 分钟。

在脱盐柱树脂向上倾斜的一侧做一个标记。确保该标记在所有离心步骤中均朝外。

将 300 µL PBS（或选择的缓冲液）轻轻添加到树脂床上，然后在 4°C 下以 1,500× g离心 1 分钟，清洗树脂 3 次。

将脱盐柱转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并轻轻地将 100 μL 纯化的纳米抗体（步骤 E2d）添加到树脂床的中心。样品完全吸收后，轻轻地将 15 µL PBS（或选择的缓冲液）添加到树脂床的中心。在 4°C 下以 1,500× g离心2 分钟，并收集流出液中脱盐的纳米体。

测量脱盐纳米抗体的A 280并使用从 Expasy 获得的 kDa 和消光系数 (ϵ) 确定摩尔浓度 (μM = A 280 / ϵ × 10 6 ) 以及浓度 (μg/mL = µM × kDa)单个纳米抗体的 Protparam（数据分析，步骤 1d）。

滴定ELISA

如果没有 Octet R8（或类似仪器），滴定 ELISA 将足以确认纯化的纳米抗体与靶蛋白的结合。

注意：在实验室工作台上工作。

在 96 孔 ELISA 微孔板的适当数量的孔中涂上 100 µL/孔的 10 µg/mL neutrAvidin TM（用 PBS 稀释），并在 4 °C 下孵育过夜。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 100 µL/孔稀释于 PBS 中的 50 nM 生物素化靶蛋白，并在微孔板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。参见一般说明 1。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 250 µL/孔的封闭溶液，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

将在封闭溶液中稀释的 200 μL 25 μg/mL 脱盐纳米体（步骤 E3d）添加到第一个孔中。在板中准备连续稀释液，即向第二个孔中添加 100 µL 封闭溶液，并添加第一个孔中的 100 µL 溶液。总共制备七种稀释液 (25–0.39 µg/mL)，最后一个孔仅含有封闭液。在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

添加 100 µL/孔在 0.1% BSA-PBS 中稀释 1:5,000 的抗骆驼 VHH-HRP，并在微板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。

使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

每孔添加 100 µL ABTS 底物，该底物是通过以 1:1 的比例混合溶液 A 和溶液 B 制备的。避光并测量 405 nm 处的吸光度。参见一般说明 2。

使用生物层干涉法 (BLI) 测定解离速率 (k dis )

注意：在实验室工作台上工作。

在开始实验前，将 Octet R8 在 25 °C 下预热过夜或至少 3 小时。

抗原和纳米抗体的典型起始浓度分别为 50 nM 和 100 nM，在八位组稀释缓冲液中制备。参见总注 19。

在 96 孔黑色聚丙烯板中准备所有稀释液。参见一般注释 20。

在此阶段，每个纳米抗体一次重复就足够了。包括无纳米抗体对照，以排除与负载抗原的任何非特异性相互作用并作为背景。

使用SA生物传感器的实验运行条件如下：

所有孵育步骤均以 1,000 rpm 的速度振荡。

板定义：用于所有基线步骤/孔的八位组稀释缓冲液。

测定定义：基线 600 秒进入八位组稀释缓冲液。

：将 300 秒加载到用八位组稀释缓冲液稀释的抗原中。

：八位组稀释缓冲液中的基线 30 秒。

：八位组稀释缓冲液中的基线 60 秒。

：在八位组稀释缓冲液中稀释的脱盐纳米体中关联 300 秒（观察此步骤，时间可能需要延长，因为我们希望曲线达到稳定水平）。

：解离 300 秒进入测量基线 60 秒的列（此步骤应与关联步骤的持续时间相同）。

将纳米抗体亚克隆到细菌和哺乳动物载体中

我们开发了两种载体套件，用于细菌和哺乳动物表达系统中纳米抗体的功能化。它们的设计方式是，从按照 C 节详细说明构建的文库中鉴定出的任何纳米抗体都可以使用通用正向引物和标签特异性反向引物以及使用相同的限制性克隆到其中站点（图 8）。细菌和哺乳动物工具箱中每个载体的特征、功能化标签和引物详述于表 14。

图 8.细菌和哺乳动物工具箱中每个载体中存在的引物、限制性酶和标签的详细信息。使用的缩写：VHH，纳米抗体；BAP，生物素受体肽/Avi-Tag TM；wt，野生型；huIg1Fc，人类 Ig1 Fc。

表 14.大肠杆菌和哺乳动物工具箱中载体的特征。引物内与载体互补的 bp 以斜体表示。

表达系统向量标签应用限制性内切酶正向引物 (5′–3′)反向引物（5′–3′，反向互补）

大肠杆菌pOPINVHH_his他的晶体学NcoI 和 Bsu36IGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGGTGATGGTGGCCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_flag_his他和FLAG表位检测

pOPINVHH_myc_his他和 myc表位检测

pOPINVHH_BAP_hisAvi-tag TM及其生物素化ATCATTCAAGCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_cys_his半胱氨酸和他的化学共轭ATGGTGACAGCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_sort_his分选酶酶标记CGGCAGGCCGCC TGAGGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_snap_hisSNAP-标签®酶标记GTCCTTGTCGCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

哺乳动物POINTTGneo-huIg1FchuIg1Fc 和 HisFc融合KpnI 和 PmelGCGTAGCTGAAACCGGC CAGGTGCAGCTGGTGGAGCAGAACTTCCAGTTT AGGGGAGACGGTGACCTGGGTC

POPINTGneo

huIg1FCA

(Y407T)

huIg1Fc 和 His双特异性纳米抗体生成

POINTTGneo huIg1FcB

(T334Y)

huIg1Fc 和 His双特异性纳米抗体生成

pOPINE-eGFPGFP和他的荧光融合NcoI 和 PmelAGGAGATATAACCATG CAGGTGCAGCTGGTGGAG

POPINE-eYFPYFP 和他的荧光融合

波品-mCherry米切尔和他的荧光融合

根据所需的应用，将选定的纳米抗体亚克隆到合适的表达载体中。下面我们以将命中的纳米抗体亚克隆到 pOPINVHH_His 载体为例进行详细说明。按照相同的过程将相同的纳米抗体亚克隆到哺乳动物载体中用于哺乳动物细胞表达。

pOPINVHH_His 载体的限制性消化

注意：在实验室工作台上工作。

在 PCR 管 (1 × 100 µL) 中制备以下消化混合物（表 15）。

表 15. 限制性酶切反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用80.5 µL

10× rCutSmart TM缓冲器1×10微升

镍钴2.5 单位2.5微升

Bsu36I2.5 单位2.5微升

400 ng/μL 载体 DNA18微克4.5微升

全部的不适用100微升

短暂涡旋并离心反应管。

37°C 孵育 1 小时，然后 80°C 孵育 20 分钟。

添加 4× 体积的 B3 缓冲液 (400 µL)，并根据制造商的说明使用 Purelink PCR 纯化套件中的 1× Purelink 柱进行纯化。使用 50 µL E1 缓冲液进行洗脱。测量 A 280并预期浓度在 60 至 100 ng/μL 之间。

纳米抗体插入物的制备

注意：在安全柜内工作。

从主板（步骤 D7d）中，将 10 µL 选定的纳米抗体克隆添加到已填充 4 mL/孔的含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2× YT 的 24 孔板中，用细胞培养粘合密封盖住，并孵育37°C 过夜，600 rpm 摇动。

注意：在实验室工作台上工作。

根据制造商的方案，使用 QIAprep 旋转小量制备试剂盒，使用 2 mL 过夜培养物分离质粒。在最终体积为 50 µL 的 EB 中洗脱。测量 A 280并预期浓度在 100 至 500 ng/μL 之间。

发送一份等份样品与 Doctor seq Fwd 引物一起进行测序。如果它与通过PCR获得的序列匹配（步骤D9g），则继续下一步。参见一般注释 18。

在 PCR 管 (1 × 25 µL) 中准备以下反应（表 16）。

表 16. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用9微升

10 µM 通用正向引物0.5微米1.25微升

10 µM His FLAG Rev 引物0.5微米1.25微升

2× Phusion 快速 PCR 预混液1×12.5微升

10 ng/μL 载体模板（步骤 F2b）10纳克1微升

全部的不适用25微升

短暂涡旋并离心反应管。

如下设置热循环仪并执行 PCR（表 17）。

表 17. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性9810秒1

退火981秒30

扩大601秒

最终延期725秒

抓住721分钟1

变性12无限保持-

将 5 µL 6× DNA 凝胶上样缓冲液添加到反应管中，并在含有 1× SYBR TM安全DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上与 1× GeneRuler 1 kb DNA 梯子的孔一起运行。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。

使用 LED 蓝色透照仪可视化约 500 bp 扩增的纳米抗体带，使用手术刀从凝胶中切除，并根据制造商的方案使用 Nucleospin 凝胶和 PCR 清理套件中的一根旋转柱进行凝胶提取。使用 50 µL NE 进行洗脱，测量 A 280，预计浓度在 30 至 100 ng/µL 之间。

注意：在从琼脂糖凝胶中切除条带的过程中观察 DNA 时，请使用 Safe Imager TM观察眼镜，并在使用手术刀时要小心。

连接和转化

注意：在实验室工作台上工作。

在 PCR 管 (1 × 10 µL) 中准备以下反应（表 18）。

表 18. In-Fusion 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用5微升

5× CEII 缓冲器1×2微升

4 ng/µL 内插管（步骤 F2h）4纳克1微升

19.83 ng/μL 载体 DNA（步骤 F1d）19.83纳克1微升

外切酶II1微升

全部的不适用10微升

短暂涡旋并离心反应管。

使用热循环仪在 42°C 孵育 30 分钟。添加 40 μL TE 缓冲液以终止反应。

注意：在安全柜内工作。

将 5 µL 输注反应液与 25 µL Stellar TM感受态细胞在无菌 2 mL 微量离心管中轻轻混合。在冰上孵育 10 分钟。

42°C 热激 45 秒，冰上孵育 2 分钟。添加 200 μL LB 培养基，并在 37°C 下以 600 rpm 搅拌孵育 1 小时。

将 50 µL 培养物铺在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、2 mM IPTG 和 40 µg/mL X-gal 的 1% 琼脂 LB 板上直至干燥。37°C 孵育过夜。预计会有很多白色菌落和很少甚至没有蓝色菌落。

将两个白色菌落从转化板转移到 24 孔板的两个孔中，该板已装有 4 mL/孔的含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2× YT。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下孵育过夜，以 600 rpm 摇动。

注意：在实验室工作台上工作。

根据制造商的方案，使用 QIAprep 旋转小量制备试剂盒，使用 2 mL 过夜培养物分离质粒。在最终体积为 50 µL 的 EB 中洗脱。测量 A 280并预期浓度在 100 至 500 ng/μL 之间。

发送一份等份样品与 Doctor seq Fwd 引物一起进行测序。如果它与通过PCR获得的序列匹配（步骤D9g），则继续下一步。参见一般注释 18。

使用 WK6大肠杆菌或 Expi293 TM进行大规模表达，如 Le Bas 等人所述。[12] 或用于使用其他哺乳动物细胞系的成像实验（参见 G 部分），具体取决于所选的表达载体。

纳米抗体功能化及应用

通过使用大肠杆菌和哺乳动物工具箱中的精选载体，我们演示了如何将纳米抗体用作使用链霉亲和素和 pOPINVHH_BAP 载体进行下拉的试剂，如何使用 pOPINVHH_Cys 载体通过化学缀合以及用 pOPINE 转染进行成像-GFP 和 pOPINE-YFP 用于体内和活细胞成像。

抗 GFP 纳米抗体生物素化的确认

将抗 GFP 纳米抗体克隆到 pOPINVHH_BAP 载体中，在 BL21(DE3)-R3-pRARE2-BirA 中大规模表达，以允许体内生物素化，并使用 Ni-NTA 和尺寸排阻色谱法进行纯化，如 F 节和在勒巴斯等人。[12] 进行了一些修改。简而言之，LB 琼脂平板含有 34 µg/mL 氯霉素、50 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素，terrific 肉汤培养物补充有 50 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素，终浓度为 0.2 mM 生物素与 0.1 mM IPTG 一起添加。下面，我们详细介绍如何确认抗 GFP 纳米抗体已被生物素化。

注意：在实验室工作台上工作。

将 2 µg 在 pOPINVHH_BAP 或 pOPINVHH_His 中表达的抗 GFP 和 1.5 µL 50 µg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 缀合物添加到 1.5 mL 微量离心管中，并用 PBS 将体积补至 10 µL。37°C 孵育 30 分钟。

添加 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后在 1× MES 缓冲液中的 NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM未染色标准品和 BenchMark TM荧光蛋白标准品一起在200 V 40 分钟

使用 ChemiDoc TM成像系统（蓝色 Epi 激发、532/28 发射滤光片）上预设的 ProQ emerald 488 图像采集对凝胶内荧光进行成像。使用 InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂染色（图 9）。

图 9. 通过 SDS-PAGE 分析确认在 pOPINVHH_BAP 中表达以及与 BirA 共表达后纳米抗体生物素化。样品通过凝胶内荧光可视化并用InstantBlue ® (Coomassie)染色。并行运行以 kDa 为单位的蛋白质分子量标记。

生物素介导的下拉

下面，我们详细介绍了纯化的生物素化抗 GFP 纳米抗体在从加标大肠杆菌裂解物中纯化 GFP 中的应用。

注意：在实验室工作台上工作。

用 1 mL PBS清洗 100 µL 链霉亲和素 Dynabeads TM M-280 两次。

将 100 µL 在 PBS 中稀释的 10 µg 生物素化抗 GFP 纳米抗体添加到准备好的珠子中，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

收集未结合的样品并用 1 mL 的 PBS 清洗珠子 3 次。

将 10 µg 纯 GFP 添加到大肠杆菌裂解液中，并使用 PBS 将最终体积补充为 100 µL。将其添加到洗过的珠子中，并使用样品混合器在室温下孵育 30 分钟。

收集未结合的样品并用 1 mL 的 PBS 清洗珠子 3 次。

将 20 µL 2× Laemmli 样品缓冲液添加到珠子中。

向每个上样和未结合样品的 10 µL 中添加 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液。

将所有经 Laemmli 处理的样品在 95 °C 下孵育 5 分钟，并在 1× MES 缓冲液中的 NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM未染色标准品一起在 200 V 下运行 40 分钟。

使用 InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂染色（图 12A）。

荧光团结合

将抗波形蛋白 (VB3) 纳米抗体克隆到 pOPINVHH_Cys 载体中，在 WK 6大肠杆菌中大规模表达，并使用 Ni-NTA 和尺寸排阻色谱进行纯化，如 F 节中详述。下面，我们详细介绍如何制备荧光抗体标记的VB3纳米抗体（VB3-AF647）及其在体内成像中的应用。

注意：在实验室工作台上工作。

向 300 µg 纯化的 VB3 纳米抗体中添加 1 mM TCEP pH 8.0，使最终体积达到 100 µL，并使用样品混合器在 4°C 下孵育 20 分钟。

将 1 µL Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺添加到 VB3 纳米抗体溶液中，并使用样品混合器在 4°C 下孵育 1 小时。

根据制造商的方案，使用 Zeba TM染料和生物素去除旋转柱从荧光标记的 VB3 纳米抗体中去除任何未结合的 Alexa Fluor TM 647。该样品可在 4 °C 避光条件下保存两周，但可以快速冷冻并在 -80 °C 条件下长期保存。

将 10 µL VB3-AF647 与 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后在 1× MES 缓冲液中的 NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 PageRuler TM 预染色一起运行蛋白质梯在 200 V 下 40 分钟。

使用 ChemiDoc TM成像系统（UV 激发、590/110 发射滤光片）上预设的 Oriele 图像采集对凝胶内荧光进行成像。使用 InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂染色（图 10）。

使用 Nanodrop 在 750 nm 处进行基线校正，测量 VB3-AF647 从 200 至 800 nm 的吸光度。预计峰值位于 280 和 651 nm，分别对应于 VB3 纳米抗体和 Alexa Fluor TM 647（图 10）。

图 10. Alexa Fluor TM 647 与 pOPINVHH_Cys 中表达的 VB3 纳米抗体 (VB3-AF647) 的缀合，通过凝胶内荧光（左）、InstantBlue ®染色（中）和吸光度曲线（右）确定

体内可视化

注意：在安全柜内工作。

将单个盖玻片放入 6 孔培养板的孔中。每孔接种 1 mL 10,000 个 HeLa 细胞，并在补充有 10% FBS、1× GlutaMAX TM和 1× 青霉素-链霉素的无酚红 DMEM 培养基中于 37 °C 和 5% CO 2的 CO 2培养箱中培养。

注意：在实验室工作台上工作。

24 小时后，用 2 mL 的 PBS 洗涤细胞 3 次，并用 2 mL 的 4% 多聚甲醛在 RT 下固定 20 分钟。

用 2 mL 的 PBS 清洗细胞 3 次，并用 2 mL 的共聚焦封闭缓冲液在 RT 下封闭细胞 1 小时。

在封闭步骤中，准备荧光标记的 VB3 纳米抗体溶液，用于标记 HeLa 细胞中的波形蛋白。在 1.5 mL 微量离心管中，将 5 µL VB3-AF647（步骤 G3c）添加到 1 mL 共聚焦稀释缓冲液 PBS 中，并通过倒置轻轻混合。

从细胞中除去封闭缓冲液，添加准备好的VB3-AF647（步骤G4d），并使用旋转摇杆在4℃下孵育2小时。

除去 VB3-AF647 溶液，并用 2 mL PBS 清洗细胞 3 次。

对于每个盖玻片，在显微镜载玻片上添加一小滴带有 DAPI 的 Fluoroshield 封固剂。使用杜蒙镊子，轻轻地从孔中取出盖玻片，并将细胞侧朝下放在封固剂上。通过轻轻地将盖玻片幻灯片向下压向显微镜幻灯片来去除多余的液体，并通过在盖玻片周边添加指甲油来固定盖玻片。

使用 Leica SP8 共焦显微镜在 63 倍物镜下使用 F 型浸没液对制备的载玻片上的染色细胞进行成像。使用 Ex405 和 Em430–550nm 进行 DAPI 检测，使用 Ex633 和 Em650 进行 Alexa Fluor TM 647 检测。

活细胞成像

VB3 纳米抗体被克隆到 pOPINE-eGFP 和 -eYFP 载体中，如 F 部分详述。产生的载体被称为 pOPINE-VB3-eGFP 和 pOPINE-VB3-eYFP。下面，我们详细介绍了如何使用 pOPINE-VB3-eGFP 和 pOPINE-VB3-eYFP 载体瞬时转染 HeLa 细胞，以进行波形蛋白丝的活细胞成像。

注意：在安全柜内工作。

在 8 孔盖玻片中，接种 200 µL，每孔含有 25,000 个 HeLa 细胞，并在补充有 10% FBS、1× GlutaMAX TM和 1× 青霉素-链霉素的无酚红 DMEM 培养基中培养，温度为 37 °C ，浓度为 5% CO 2培养箱中的CO 2。

24 小时后，按如下方式制备转染混合物。在 500 μL 微量离心管中，添加 10 μL 无血清 DMEM 培养基，并轻轻混合 2 μL 100 ng/μL pOPINE-VB3-eGFP 和 pOPINE-VB3-eYFP 载体。添加 0.5 µL Fugene 转染试剂，并在 RT 下孵育 10 分钟。

从 8 孔显微镜室盖玻片中的每个孔中取出旧介质，并添加 270 μL/孔的 DMEM 介质，辅以 10% FBS。通过轻轻按下移液器的柱塞，将每个 DNA-Fugene 复合物逐滴添加到每个孔中，并在CO 2培养箱中在 37°C 和 5% CO 2下孵育室盖玻片 48 小时。

使用 Leica SP8 共焦显微镜在 63 倍物镜下使用浸没液体捕获活细胞成像。使用 Ex405 和 Em430–550nm 进行 DAPI 检测，使用 Ex488 和 Em518-558 进行 GFP 和 YFP 检测。

数据分析

测序数据分析（D9 节）

将 .seq 文件拖放到IMGT/V-QUEST中。在网站上进行以下选择：物种：Vicugna Pacos（羊驼）；受体类型或位点：Ig；选择以 Excel 格式获取结果。提交。参见一般注释 21。

生成的 Excel 文件中有多个选项卡。第五个选项卡（AA 序列）是我们将要处理的选项卡。按有效、无效和无结果对序列进行排序。

然后，对生产序列的 CDR3-IMGT 进行排序，以可视化 CDR3 簇。用不同颜色突出显示不同的 CDR3 簇有助于选择代表性克隆，这些克隆将用于小规模表达。

在 SnapGene 中打开所选克隆的 .seq 文件以获得氨基酸序列。复制单字母氨基酸序列并粘贴到Expasy-ProtParam 工具中。删除 pelB 序列 (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)，提交，并记下预期的 kDa、pI 和消光系数 (ϵ)，假设所有 Cys 残基都减少。

分析 BLI 数据以确定解离率（E5 部分）

在“预处理数据”选项卡中：将无纳米抗体孔的背景减去所有其他测试的纳米抗体孔。将 Y 轴校正为基线步骤，将步骤间校正为解离步骤。应用 Savitzky-Golay 过滤。

在动力学分析选项卡中：分析关联和解离步骤。使用 1:1 绑定模型。使用局部（单独）配件。拟合完整的关联和解离步骤并记下计算的解离率 (k dis )。

协议验证

尼帕病毒G蛋白纳米抗体的鉴定

尼帕病毒 (NivG) 受体结合 G 蛋白的纳米抗体的鉴定证明了纳米抗体生成工作流程的改进。带有 N 末端六组氨酸标签的 NivG 蛋白的胞外区域（残基 183-602）在 Expi293 TM细胞中表达，并通过固定化金属亲和层析 (IMAC) 和尺寸排阻相结合进行纯化（图 11A）。在生物素标记的 NivG 的血清转化 ELISA 中比较免疫前和免疫后血清，证实已对抗原产生了免疫应答（图 11B）。在对 VHH 文库 13 进行两轮淘选后，挑选出 93 个噬菌体克隆并在噬菌体 ELISA 中进行测试。通过 PCR 扩增噬菌体结合物的序列并进行测序，并根据 CDR3 序列同一性对翻译的 VHH 进行聚类。从三个主要簇中的每一个中选择一个代表性克隆，以小规模（4 mL 培养物）表达，并通过 IMAC 纯化（图 C）。通过滴定 ELISA 确认与 NivG 的结合（图 D）。通过 BLI 对结合解离率的分析证实，三个克隆（A8、B7 和 D5）与 NivG 结合（图 E），并优先用于大规模表达。

图 11. 从免疫的美洲驼中生成 NivG 结合纳米抗体。(A) 来自纯化 NivG 凝胶过滤的级分的 SDS-PAGE，(B) 用 NivG 免疫后免疫前和免疫后血清的血清转化 ELISA，(C) 来自小规模表达的纯化抗 NiVG 纳米抗体的 SDS-PAGE (D) 通过滴定 ELISA 纯化的纳米抗体与 NivG 183-602 的结合，(E) 纳米抗体与 NivG 183-602 结合和解离的 BLI 迹线；显示了三种纳米抗体的解离速率。

用于纯化和成像的纳米抗体的功能化

使用表 1 中所示的三种载体对纳米抗体进行功能化，并使用抗 GFP [9] 和抗波形蛋白 (VB3) [10] 纳米抗体来举例说明它们的应用。抗 GFP 纳米抗体在 pOPINVHH_BAP 载体中表达，在体内生物素化，并用于使用磁耦合链霉亲和素珠从加标的大肠杆菌裂解物中下拉 GFP （图 12A）。使用 pOPINVHH-cys 载体在大肠杆菌中表达抗 VB3 纳米抗体，进行纯化，并通过马来酰亚胺接头与 AlexaFluor TM 647 偶联。HeLa 细胞被固定并透化，波形蛋白丝用抗 VB3 纳米抗体缀合物染色（图 12B）。通过分别克隆到 pOPINE-YFP 和 pOPINE-GFP 载体中，将相同的纳米抗体与 YFP 或 GFP 进行基因融合。用这些载体转染活 HeLa 细胞，并通过共聚焦显微镜成像以可视化波形蛋白丝（图 12C）。

图 12. 纳米抗体的功能化。(A) 通过与链霉亲和素磁珠偶联的生物素化抗 GFP 纳米抗体对掺入大肠杆菌裂解液中的 GFP 进行下拉。使用 (B) 荧光标记的抗波形蛋白纳米抗体 (VB3-AF647) 和 (C) 瞬时转染 VB3-eGFP 和 VB3-eYFP 检测 HeLa 细胞中的波形蛋白。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

生物素化蛋白质的制备可以通过两种方式实现：化学缀合或通过 Avi-tag® 序列对蛋白质进行体外生物素化并与 BirA 共表达。

预计添加底物后 5-15 分钟内显色。如果信号较低，吸光度测量前的最长孵育时间为 1 小时。

如果我们在 17 × 10 mL 血管中接收 170 mL 美洲驼血液，不含抗凝剂，则添加等体积的 PBS 将得到总共 340 mL 的稀释血液。每支 50 mL 管需要 15 mL 稀释血液，并已添加 15 mL Histopaque ® -1007；因此，总共需要 22.6 个管子。因此，第 23 管的稀释血液将少于 15 mL。

以 45° 角握住 50 mL 锥形离心管，可以将稀释的血液轻轻添加到 Histopaque ® -1007 上，以防止 Histopaque ® -1007 层受到干扰。在将血液轻轻地铺在许多 50 mL 锥形离心管上的 Histopaque ® -1007 顶部的过程中，当较重的红细胞落到管底部时，下层会变成红色。这是可以预料的。

将台盼蓝与 PMNC 过度混合可能会损坏 PMNC，导致活力值较低，可能无法真实代表实际活力。

如果没有 PCR 工作站或专用 RNase 自由空间，如果定期更换手套并使用RNaseZap TM，则保留仅用于 RNA 工作的吸头盒和微量离心管袋就足够了。

RNA 应储存在 -20 °C 的乙醇中，这样可以长时间保持稳定。一旦重悬于水中，稳定性就会降低，因此，为了获得最佳结果，我们建议在 RNA 重悬于水中后立即进行 cDNA 合成（步骤 C3i）。

对于电穿孔，预计 ms 值大于 4.5。

请注意，小型库的估计库大小与大规模库的估计库大小略有不同。

有关如何计算制作大小为 1 × 10 6的文库需要多少微升的融合反应的示例：我们使用 Purelink 柱纯化 10 µL 融合反应，在 20 µL 核酸酶中洗脱 -免费水。我们使用 5 µL 进行电穿孔，这意味着将 2.5 µL 原始融合反应添加到 30 µL 感受态 TG1 中。因此，如果 2.5 µL 融合文库在 1:100 稀释度下产生 373 CFU，则小规模文库大小将为 1.492 × 10 5 CFU/mL。要创建 1 × 10 6 CFU/mL 文库，需要 6.7 × 2.5 µL 的融合反应，即略多于 1 × 10 µL 的融合反应。如果已准备好足够的 VHH2 和消化的 pADL23c 主链，我们通常会使用比所需更多的输注反应，即 10 × 10 µL，以确保我们有最佳机会生成 1 × 10 6 CFU /mL 文库。

如果按滴定度计算的文库大小与按板密度计算的文库大小之间存在较大差异，如果文库足够大，请使用板密度来指导您的决策。参见图 7。

准备起始培养物时，首先使用 200 µL TG1 库存。

在准备起始培养物时，首先使用 20 µL 分离的文库噬菌体和平底锅 1 子文库库存。

在某些情况下，培养物可能需要 2 小时以上才能达到 OD 600 0.5。继续培养直至达到所需的 OD 600 。只要步骤 D3k 或 D6i 中的 TG1 对照板为阴性，您就可以确信这可能只是文库和/或子文库中的差异。

仅限 TG1 的对照可显示所使用的 TG1 在该滴定步骤之前尚未被噬菌体感染。请参阅故障排除 1 和 2。

步骤 C8h–i 显示了库的多样性。扩增和恢复的文库的滴定（步骤D3l）表明我们可以使用我们的多样化文库制造多少噬菌体颗粒。

根据实际 ELISA 阳性克隆的数量调整制备的 PCR 主混合物的体积。

DNA 和引物的体积和浓度可能是供应商特定的。检查当地测序公司的要求。

使用足够的抗原加载生物传感器，导致 1 nm 信号增加。

必须使用聚丙烯板，因为它们不结合蛋白质。

IMGT 站点一次只能处理 48 个序列。如果已对超过 48 个克隆进行测序，请将两个生成的 IMGT Excel 文件合并在一起，然后按 V-DOMAIN 功能和 CDR3-IMGT 进行排序。

故障排除

问题 1：TG1 对照板上的生长。

可能的原因：在添加我们分离/洗脱的噬菌体之前，表明大肠杆菌受到噬菌体污染。

解决方案：在 -80 °C 下从新鲜的 TG1 等分试样中制备新鲜的对数期 TG1。重复有问题的噬菌体的滴定。

问题 2：TG1 对照板上的生长。

可能原因：氨苄西林库存已过期。

解决方案：使用新的氨苄青霉素等分试样，制备含有氨苄青霉素的新鲜 1% 琼脂 LB 平板。从“受污染”的 TG1 对照平板以及用于生长对数期 TG1 的甘油原液中取出一个菌落，并将其在新平板上划线。如果没有观察到生长，则表明氨苄青霉素原液是旧的，并且 TG1 在此之前没有被噬菌体感染。

问题 3：抗 M13 ELISA 板上仅发现单个命中。

可能的原因：几轮淘选后仅存在少量粘合剂。

解决方案：可以挑选另外 93 个菌落来制备第二个主板，以在抗 M13 ELISA 中进行测试。

问题 4：使用 5 nM 目标蛋白进行第二轮淘选后，不存在或很少出现抗 M13 ELISA 命中。

可能的原因：可能没有浓缩。

解决方案：返回 50 nM 噬菌体并使用 10 nM 抗原进行平移。如果仍然没有命中，请尝试故障排除 3。如果仍然没有命中，请考虑查看另一个库。使用血清转化 ELISA 数据来指导这一决定。

致谢

这项工作得到了罗莎琳德·富兰克林研究所的支持，资金交付合作伙伴英国工程和物理科学研究委员会 (EPSRC) 以及英国生物技术和生物科学研究委员会 (BBSRC) 为纳米抗体发现提供的赠款（参考号 BB/V018523/1））和威康技术开发信托基金（参考号223733/Z/21/Z）。使用BioRender创建的图形概述。

利益争夺

作者声明他们对所描述的工作没有竞争利益。

道德考虑

美洲驼的免疫接种和处理是在英国内政部项目许可证 PA1FB163A 的授权下进行的。

参考

Hamers-Casterman, C.、Atarhouch, T.、Muyldermans, S.、Robinson, G.、Hammers, C.、Songa, EB、Bendahman, N. 和 Hammers, R. (1993)。天然存在的抗体不含轻链。自然363（6428）：446–448。

鲍国光、唐明、赵建和朱新 (2021)。纳米抗体：一个有前途的分子成像和疾病治疗工具包。 EJNMMI 研究中心。11（1）：6。

穆德曼斯，S.（2020）。指南：纳米抗体的生成和设计。 FEBS J. 288(7): 2084–2102。

Parker, JL、Deme, JC、Wu, Z.、Kuteyi, G.、Huo, J.、Owens, RJ、Biggin, PC、Lea, SM 和 Newstead, S. (2021)。PepT2 的冷冻电镜结构揭示了哺乳动物中质子偶联肽和前药转运的结构基础。科学。副词。7(35)：eabh3355。

Girt, GC、Lakshminarayanan, A.、Huo, J.、Dormon, J.、Norman, C.、Afrough, B.、Harding, A.、James, W.、Owens, RJ、Naismith, JH 等人。（2021）。使用纳米抗体对 SARS-CoV-2 Spike 1 蛋白进行灵敏 ELISA 测试。 R.苏克。打开科学。8（9）：e211016。

Huo, J.、Mikolajek, H.、Le Bas, A.、Clark, JJ、Sharma, P.、Kipar, A.、Dormon, J.、Norman, C.、Weckener, M.、Clare, DK 等等人。（2021）。一种有效的 SARS-CoV-2 中和纳米抗体在 COVID-19 叙利亚金仓鼠模型中显示出治疗效果。纳特。交流。12（1）：5469。

Akkermans, O.、Delloye-Bourgeois, C.、Peregrina, C.、Carrasquero-Ordaz, M.、Kokolaki, M.、Berbeira-Santana, M.、Chavent, M.、Reynaud, F.、Raj, R. ，阿吉尔，J.，等人。（2022）。GPC3-Unc5 受体复合物结构及其在细胞迁移中的作用。单元格185(21)：3931–3949.e26。

Pardon, E.、Laeremans, T.、Triest, S.、Rasmussen, SGF、Wohlkönig, A.、Ruf, A.、Muyldermans, S.、Hol, WGJ、Kobilka, BK、Steyaert, J. 等。（2014）。结构生物学纳米抗体生成的通用方案。纳特。协议。9（3）：674-693。

Kirchhofer, A.、Helma, J.、Schmidthals, K.、Frauer, C.、Cui, S.、Karcher, A.、Pellis, M.、Muyldermans, S.、Casas-Delucchi, CS、Cardoso, MC,等人。（2010）。使用纳米抗体调节活细胞中的蛋白质特性。纳特。结构。摩尔。生物。17（1）：133-138。

Maier, J.、Traenkle, B. 和 Rothbauer, U. (2015)。使用荧光单域抗体实时分析上皮间质转化。科学。报告5(1)：13402。

Tonikian, R.、Zhang, Y.、Boone, C. 和 Sidhu, SS (2007)。从噬菌体展示的肽库中识别肽识别模块的特异性特征。纳特。协议。2（6）：1368-1386。

Le Bas, A.、Mikolajek, H.、Huo, J.、Norman, C.、Dormon, J.、Naismith, J. 和 Owens, R. (2022)。与 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域复合的纳米抗体的生产和结晶。生物协议。12(9)：e4406。

材料与试剂

生物材料

1.免疫后肝素化的美洲驼血液

2.免疫前和免疫后美洲驼血清

3.电感受态 TG1（安捷伦，目录号：200123）

4.CM13K 胰蛋白酶敏感辅助噬菌体（Antibody Design Laboratories，目录号：PH050L）

5.Stellar TM感受态细胞（Takara Bio，目录号：636766）

6.大肠杆菌（ Migula ）Castellani 和 Chalmers，菌株 WK6（ ATCC，目录号：47078）

7.BL21(DE3)-R3-pRARE2-BirA体内大肠杆菌细胞生物素化，SGC（结构基因组学联盟）

8.HeLa 细胞（ATCC，目录号：CCL-2）

试剂

1.Gerbu佐剂F（ Biotechnik GmbH ，目录号：3030）。储存于 4°C

2.NeutrAvidin TM生物素结合蛋白（Invitrogen，目录号：A2666）。储存于-20°C

3.10 × PBS（Fisher BioReagents ，目录号：BP399-20），一般用途。室温保存 (RT)

4.脱脂奶粉（Oxoid，目录号：LP0031）。储存于 RT

5.Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）。储存于 RT

6.BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）。储存于 4°C

7.山羊抗美洲驼 IgG (H+L) HRP（Invitrogen，目录号：A16060）。以 5 µL 等份储存于 -20 °C

8.KPL ABTS 过氧化物酶溶液 A（ SeraCare ，目录号：5120-0034）。储存于 4°C

9.KPL过氧化物酶底物溶液B（ SeraCare ，目录号：5120-0037）。储存于 4°C

10.Chemgene TM （ Chemgene&Trade ，目录号：XTM308）。储存于 RT

注意：该化学品具有腐蚀性。

11.乙醇（EtOH）（ Fisher BioReagents ，目录号：E/0650DF/17）。储存在 RT 的易燃液体储存柜中

注意：该化学品易燃。

12.Virkon ® （ Rely+on TM ，目录号：12358667）。储存于 RT

注意：该化学品具有腐蚀性。

13.PBS，pH 7.4，用于多形核细胞（PMNC）分离（Gibco，目录号：10010015）。储存于 4°C

14.Histopaque ® -1077（Sigma-Aldrich，目录号：10771）。储存于 4°C

15.RNase Zap TM RNase 去污溶液（Invitrogen，目录号：AM9782）。储存于 RT

16.台盼蓝溶液，0.4%（Sigma-Aldrich，目录号：T8154-20ML）。储存于 RT

注意：该化学物质具有潜在的致癌性。

17.TRIzol TM试剂（Invitrogen，目录号：15596026）。储存于 4°C

注意：该化学品具有腐蚀性和毒性。

18.氯仿（ Fluorchem ，目录号：D007F）。储存在 RT 的易燃液体储存柜中

注意：该化学品易燃。

19.2-丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）。储存在 RT 的易燃液体储存柜中

注意：该化学品易燃。

20.无核酸酶水（未经 DEPC 处理）（Invitrogen，目录号：AM9932）。储存于 RT

21.SuperScript TM IV 一步式 RT-PCR 系统（Invitrogen，目录号：12594025）。储存于-20°C

22.CALL_001 引物 5 ' GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

23.CALL_002 引物 5 ' GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

24.6 × DNA凝胶上样缓冲液（New England Biolabs，目录号：B7024S）。储存于 4°C

25.10 × TBE 缓冲液（ Thermo Scientific，目录号：B52）。储存于 RT

26.琼脂糖（ Fisher BioReagents ，目录号：BP1356-500）。储存于 RT

27.1,000 × SYBR TM安全DNA凝胶染色剂（Invitrogen，目录号：S33102）。储存于 RT

28.GeneRuler 1 kb DNA 梯子（ Thermo Scientific，目录号：SM0311）。储存于 4°C

29.Nucleospin凝胶和 PCR 清理试剂盒（ Macherey -Nagel，目录号：740609.50）。储存于 RT

30.Purelink PCR 纯化试剂盒（Invitrogen，目录号：K310002）。储存于 RT

31.HyperLadder TM 1 kb DNA梯子（Meridian Bioscience® ， Bioline ，目录号：BIO-33053）。储存于 4°C

32.Phusion flash 高保真 PCR 主混合物（Invitrogen，目录号：F548L）。储存于-20°C

33.VHHFor2 引物 5 ' TACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT GGRGGA 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

34.VHHRev引物 5 ' GTGATGGTGTTGGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCTGG 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

35.pADL23c载体（Antibody Design Laboratories，目录号：PD0111）。储存于-20°C

36.SfiI （New England Biolabs，目录号：R0123S）。储存于-20°C

37.10× rCutSmart TM缓冲液（New England Biolabs，目录号：B6004S）。储存于 4 °C

38.ClonExpress II一步克隆试剂盒，包含5×CEII缓冲液和Exnase II（ Vazymbiotech ，目录号：C112-02）。储存于-20°C

39.恢复介质（Sigma-Aldrich，目录号：S1797）。储存于 4°C

40.LB培养基混合物（ Formedium ，目录号：LBL0103）。储存于 RT

41.Bacto胰蛋白胨（Melford，目录号：T60065-2000.0）。储存于 RT

42.酵母提取物（Melford，目录号：Y20020-1000.0）。储存于 RT

43.Bacto琼脂（ Formedium ，目录号：AGR10）。储存于 RT

44.氨比西林（ Formedium ，目录号：AMP100）。储存于4°C

注意：氨苄青霉素是一种致敏剂。

45.25 mM dNTP（ Thermo Scientific，目录号：R1122）。以 30 µL 等分试样储存于 -20 °C

46.Taq聚合酶和标准Taq反应缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：M0273X）。储存于-20°C

47.Doctor_seq_Fwd引物 5 ' GCTTCCGGCTCGTATGTTG 3 ' 。储存于-20°C

48.Doctor_seq_Rev引物 5 ' GTCGTCTTTCCAGACGTTAG 3 ' 。储存于-20°C

49.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-1L）。储存于 RT

50.PEG 6000（Sigma-Aldrich，目录号：81260）。储存于 RT

51.氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）。储存于 RT

52.卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）。储存于4°C

注意：卡那霉素是一种致敏剂，可能会损害生育能力。

53.StartingBlock TM (PBS) 封闭缓冲液（Invitrogen，目录号：37538）。储存于 4°C

54.Dynabeads TM M-280 链霉亲和素（Invitrogen，目录号：11205D）。储存于 4°C

55.Tris碱（梅尔福德，目录号： T60040-100.0）。储存于 RT

56.CaCl 2 · 2H 2 O （Sigma-Aldrich，目录号：C3306）。储存于 RT

57.胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1426）。储存于-20°C

58.抗M13 HRP（Sino Biological，目录号：11973-MM05T-H）。以 5 µL 等份储存于 -20 °C

59.Highprep PCR 磁珠（ Magbio ，目录号：AC60050）。储存于 4°C

60.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）。储存于 RT

61.MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）。储存于 RT

62.IPTG（ NeoBiotech ，目录号：NB-45-00030）。储存于-20°C

63.粘菌素B （Gibco，目录号：21850029）。储存于 RT

注意：硫酸多粘菌素B有毒。

64.2 × Laemmli缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）。储存于 4°C

65.20 × NuPAGE TM MES SDS 运行缓冲液（Invitrogen，目录号：NP000202）。储存于 RT

66.Mark12 TM未染色标准品（Invitrogen，目录号：LC5677）。储存于 4°C

67.InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂（Abcam，目录号：ab119211）。储存于 4°C

68.Ni-NTA 旋转柱（QIAGEN，目录号：31014）。储存于 4°C

69.咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I202-500g）。储存于 RT

注意：咪唑有毒、有腐蚀性、有刺激性，可能会损害生育能力。

70.Zeba TM旋转脱盐柱，7K MWCO，0.5 mL（ Thermo Scientific，目录号：89882）。储存于 4°C

71.兔抗骆驼VHH HRP（金斯瑞，目录号：A01861-200）。以 5 µL 等份储存于 -20 °C

72.pOPINVHH_his载体（ Addgene ，目录号：210405）。储存于-20°C

73.pOPINVHH_cys_his向量（ Addgene ，目录号：210403）。储存于-20°C

74.pOPINVHH_BAP_his向量（ Addgene ，目录号：210402）。储存于-20°C

75.pOPINVHH_sort_his向量（ Addgene ，目录号： 210406）。储存于-20°C

76.pOPINVHH_flag_his载体（ Addgene ，目录号：210404）。储存于-20°C

77.pOPINVHH_myc_his向量（ Addgene ，目录号：210526）。储存于-20°C

78.pOPINVHH_snap_his向量（ Addgene ，目录号：210407）。储存于-20°C

79.pOPINE-3C-eGFP 载体（ Addgene ，目录号：41125）。储存于-20°C

80.pOPINE-3C-eYFP 载体（ Addgene ，目录号： 214028）。储存于-20°C

81.pOPINE-3C-mCherry 载体（ Addgene ，目录号： 214060）。储存于-20°C

82.通用正向引物 5 ' GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAG 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

83.他的 FLAG Rev 引物 5 ' GTGATGGTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

84.Cys Rev 引物 5 ' ATGGTGACAGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

85.BAP Rev 引物 5 ' ATCATTCAAGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C 下。

86.排序 Rev 引物 5 ' CGGCAGGCCGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

87.Myc Rev 引物 5 ' GTGATGGTGGTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

88.SNAP Rev 引物 5 ' GTCCTTGTCGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

89.pOPINE通用正向引物 5 ' AGGAGATATACCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAG 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

90.pOPINE通用 Rev 引物 5 ' CAGAACTTCCAGTTTTAGGGGAGACGGTGACCTGGGTC 3 ' 。从 IDT 订购底漆。在水中重构之前储存在室温下，然后储存在-20°C

91.Bsu36I（New England Biolabs，目录号：R0524S）。储存于-20°C

92.NcoI （New England Biolabs，目录号：R01093S）。储存于-20°C

93.X-gal 即用型（ Thermo Scientific，目录号：R0941）。储存于 4°C

94.QIAprep旋转小量制备试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）。储存于 RT

95.抗GFP纳米抗体DNA序列[9] 在大肠杆菌中表达的密码子优化后。 CAG GTC CAA TTA GTG GAG TCC GGT GGG GCA CTT GTC CAG CCT GGA GGT TCA CTT CGC TTG TCT TGC GCA GCG TCT GGA TTC CCG GTG AAC CGC TAT AGT ATG CGT TGG TAC CGT CAA GCT CCG GGG AAA GAA CGT GAA TGG GTA GCA GGG ATG TCT TCC GCC GGT GAC CGC TCT TCA TAC GAG GAC TCG GTC AAG GGG CGC TTC ACA ATC TCT CGT GAT GAT GCC CGT AAC ACC GTT TAC TTG CAA ATG AAC AGC CTG AAA CCG GAA GAC ACT GCG GTG TAT TAC TGC AAT GTT AAT GTA GGG TTT GAA TAC TGG GGT CAA GGT ACA CAA GTT ACA GTT TCG TCA。从 IDT订购了gBlock 。在 TE 缓冲液中重构之前储存在 RT 下，在 50 °C下孵育 20 分钟，然后储存在 -20 °C下

96.氯霉素（ Sigma-Aldrich，目录号：C1919）。储存于 4°C

注意：氯霉素有毒，可导致眼睛损伤，并且是一种致癌物质。

97.大观霉素二盐酸盐五水合物（ Sigma-Aldrich，目录号：S4014）。储存于 4°C

注意：大观霉素有刺激性。

98.羧卞西林二钠盐（ Sigma-Aldrich，目录号：C3416）。储存于 4°C

注意：羧苄青霉素是一种致敏剂。

99.生物素（ Sigma-Aldrich，目录号：B4639）。储存于 4°C

100.链霉亲和素，Alexa Fluor TM 488 缀合物（Invitrogen，目录号：S11223）。储存于-20 °C

101.BenchMark TM荧光蛋白标准品（Invitrogen，目录号：LC5928）。储存于-20 °C

102.密码子优化后在大肠杆菌中表达的抗波形蛋白 (VB3) 纳米抗体 [10] 的 DNA 序列： CAG GTC CAA CTT GTA GAG TCA GGA GGT GGA AGC GTG CAA GCT GGG GAC TCT CTG CGC CTG TCT TGT GCT TCG AGC GGA AAT ACC TTC TCG ATC AAA GTC ATG GGA TGG TAC CGC CAG GCA CCT GGA AAG CAA CGT GAA TTA GTC GCG GTT TCA ACC AAT AGC GGG GCC TCT GTT AAT TAT GCC AAC TCT GTG AAG GGA CGC TTT ACC ATT TCT ATT GAT TCA GTA AAA AAA ACA ACC TAC TTA CAG ATG AAT TCC TTG AAG CCA GAA GAT ACA GCC GTC TAC TTT TGC AAT GCA TAT GAT GGG CGT TAT GAG GAC TAT TAC GGT CAG GGG ACC CAA GTG ACA GTA TCA TCA .从 IDT订购了gBlock 。在 TE 缓冲液中重构之前储存在 RT 下，在 50° 下孵育 20 分钟，然后储存在 -20 °C下

103.TCEP，盐酸盐（Merck，Millipore ® ，目录号：580567-5GM）。储存于 RT

104.Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺（Invitrogen，目录号：A20347）。储存于-20 °C

105.Zeba TM染料和生物素去除柱（ Thermo Scientific，目录号：A44296）。储存于 4 °C

106.页面标尺预染色的蛋白质梯（ Thermo Scientific，目录号：26616）。储存于 4 °C

107.DMEM，高葡萄糖，HEPES，无酚红（Gibco，目录号：21063-029）。储存于 4 °C

108.胎牛血清（FBS）（ Biowest ，目录号：S00NB1001Y）。储存于-20 °C

109.100 × GlutaMAX TM （Gibco，目录号：35050-038）。储存于-20 °C

110.100 ×青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15140-122）。储存于-20 °C

111.PBS 中的 4% 多聚甲醛（ Thermo Scientific 化学品，目录号：J61899.AK）。储存于 4°C

注意：多聚甲醛是一种眼睛刺激物、皮肤致敏物和致癌物。

112.Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-250mL）。储存于 RT

113.Fluoroshield （Abcam，目录号：ab104139）。储存于 RT

114.指甲油。储存于 RT

115.F 型浸没液体（Leica，目录号：11513859）。储存于 RT

116.Fugene转染试剂（Promega，目录号：E2311）。储存于 4 °C

解决方案

1.0.5 mg/mL neutrAvidin生物素结合蛋白（参见配方）

2.10 µg /mL neutrAvidin用于包被 ELISA 板（参见配方）

3.1 × PBS （参见食谱）

4.封闭液（参见配方）

5.洗涤缓冲液 (PBST)（参见配方）

6.0.1% (w/v) BSA-PBS（参见配方）

7.2% (v/v)凯凯（参见食谱）

8.70% (v/v) 乙醇 (EtOH) （参见配方）

9.2% (w/v) Virkon（参见配方）

10.75% (v/v) EtOH （参见配方）

11.1 × TBE 缓冲液（参见配方）

12.含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的0.7% (w/v) 琼脂糖凝胶（参见配方）

13.含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的1% (w/v) 琼脂糖凝胶（参见配方）

14.2 × YT 培养基（参见食谱）

15.LB 培养基（参见食谱）

16.100 mg/mL 氨苄西林（参见配方）

17.含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% (w/v) 琼脂 LB 平板（参见配方）

18.100 µg/mL 氨苄青霉素的 2% (w/v) 琼脂 LB 平板（参见配方）

19.50% 甘油（参见食谱）

20.2 ×含有 25% 甘油的 YT 培养基（参见配方）

21.不含抗生素的 1% (w/v) 琼脂 LB 平板（参见配方）

22.2 ×含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 YT （参见配方）

23.50 mg/mL 卡那霉素（参见配方）

24.2 × YT 含有 25 µg/mL 卡那霉素（参见配方）

25.PEG/NaCl 沉淀溶液（参见配方）

26.2 × YT，含有 100 µg/mL 氨苄西林和 25 µg/mL 卡那霉素（参见配方）

27.TBSC （参见食谱）

28.1 mg/mL 胰蛋白酶（参见食谱）

29.250 µg/mL 胰蛋白酶（参见食谱）

30.很棒的肉汤（见食谱）

31.20% (w/v) 葡萄糖（参见食谱）

32.1 M MgCl 2 ·6H 2 O（参见配方）

33.极好的肉汤，含有100 µg/mL 氨苄青霉素、0.1% 葡萄糖、2 mM MgCl 2 ·6H 2 O（参见配方）

34.1 M IPTG（参见配方）

35.1 mg/mL 硫酸多粘菌素 B 的PBS溶液（参见配方）

36.1 × NuPAGE TM MES SDS 电泳缓冲液（参见配方）

37.平衡缓冲液（参见配方）

38.洗脱缓冲液（参见配方）

39.八位组稀释缓冲液（参见配方）

40.含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、2 mM IPTG、40 µg/mL X-gal 的 1% (w/v) 琼脂 LB 板（参见配方）

41.34 µg mL 氯霉素（参见配方）

42.50 µg/mL 大观霉素（参见配方）

43.50 µg/mL 羧苄西林（参见配方）

44.1% (w/v) 琼脂 LB 板，含有 34 µg/mL 氯霉素、50 µg/mL 大观霉素、50 µg/mL 羧苄青霉素（参见配方）

45.0.2 M 生物素（参见食谱）

46.含有 5 0 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素的极好的肉汤（参见食谱）

47.1 mg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物（参见配方）

48.50 µg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物（参见配方）

49.500 mM TCEP，pH 8.0 （参见配方）

50.1 mM TCEP，pH 8.0 （参见配方）

51.10 mg/mL Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺（参见配方）

52.不含酚红的 DMEM 培养基，10% (v/v) FBS，1 × GlutaMAX TM , 1 ×青霉素-链霉素（参见食谱）

53.共焦封闭缓冲液（参见配方）

54.共聚焦稀释缓冲液（参见配方）

食谱

1.0.5 mg/mL neutrAvidin生物素结合蛋白

准备 200 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

中性亲和素TM 0.5毫克5毫克

水蒸气_ _不适用10毫升

全部的不适用10毫升

2.10 µg/mL neutrAvidin用于包被 ELISA 板

使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

neutrAvidin TM （配方1）10微克/毫升200微升

PBS（1 × ）1 ×9.8毫升

全部的不适用10毫升

3.1 × PBS

准备无菌（通过高压灭菌）和非无菌 PBS。储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（10 × ）1 ×100毫升

水蒸气_ _不适用900毫升

全部的不适用1,000 毫升

4.封闭液

使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

牛奶2%（重量/体积）2克

PBS（配方 3）（或与蛋白质兼容的缓冲液）不适用100毫升

全部的不适用100毫升

5.洗涤缓冲液（PBST）

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（配方 3）1 ×1000毫升

吐温-200.05%（体积比）500微升

全部的不适用100毫升

6.0.1% (w/v) BSA-PBS

使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

牛血清白蛋白0.1%（重量/体积）50毫克

PBS（配方 3）1 ×50毫升

全部的不适用50毫升

7.2% (v/v)凯凯

储存于室温。

试剂最终浓度数量或体积

凯凯(100%)2%（体积比）20毫升

水分子_不适用980毫升

全部的不适用1,000 毫升

8.70% (v/v) 乙醇

储存于室温。

试剂最终浓度数量或体积

乙醇（绝对）70%（体积/体积）70毫升

水分子_不适用30毫升

全部的不适用100毫升

9.2% (w/v) 卫康

每周准备并储存在室温下。

试剂最终浓度数量或体积

维康粉2%（重量/体积）100克

水分子_不适用5,000 毫升

全部的不适用5,000 毫升

10.75% (v/v) 乙醇

储存于室温。

试剂最终浓度数量或体积

乙醇（绝对）75%（体积/体积）75毫升

水分子_不适用25毫升

全部的不适用100毫升

11.1 × TBE 缓冲器

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

待定 (10 × )1 ×100毫升

水分子_不适用900毫升

全部的不适用1,000 毫升

12.含有 1 × SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的0.7% (w/v) 琼脂糖凝胶

在微波炉中加热直至所有琼脂糖溶解，并在添加凝胶染色剂之前冷却至 55°C。倒入 DNA 铸造装置中并使其凝固。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

琼脂糖0.7%（重量/体积）0.7克

待定（配方 11）1 ×100毫升

全部的不适用100毫升

SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂(1,000 × )1 ×10微升

13.含有 1 × SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的1% (w/v) 琼脂糖凝胶

在微波炉中加热直至所有琼脂糖溶解，并在添加凝胶染色剂之前冷却至 55°C。倒入 DNA 铸造装置中并使其凝固。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

琼脂糖1%（重量/体积）1克

待定（配方 11）1 ×100毫升

全部的不适用100毫升

SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂(1,000 × )1 ×10微升

14.2 × YT 介质

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

细菌胰蛋白胨16克/升4克

氯化钠5克/升1.25克

酵母抽提物10克/升2.5克

水蒸气_ _不适用250毫升

全部的不适用250毫升

15.LB培养基

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

水蒸气_ _不适用250毫升

全部的不适用250毫升

16.100 mg/mL 氨苄青霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

注意：氨苄青霉素是一种致敏剂。

试剂最终浓度数量或体积

氨苄西林100毫克/毫升2克

水蒸气_ _不适用20毫升

全部的不适用20毫升

17.含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% (w/v) 琼脂 LB 板

高压灭菌 LB 培养基和细菌琼脂混合并冷却至 55°C，然后添加抗生素。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其在室温下冷却。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂1%（重量/体积）2.5克

水蒸气_ _不适用250毫升

全部的不适用250毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升250微升

18.含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2% (w/v) 琼脂 LB 板

高压灭菌 LB 培养基和细菌琼脂混合并冷却至 55°C，然后添加抗生素。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其在室温下冷却。使用当天准备。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂2%（重量/体积）5克

水蒸气_ _不适用250毫升

全部的不适用250毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升250微升

19.50% (v/v) 甘油

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

甘油50%（体积/体积）100毫升

水蒸气_ _不适用100毫升

全部的不适用200毫升

20.2 ×含有 25% (v/v) 甘油的 YT 培养基

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2 × YT 介质不适用20毫升

甘油（配方 19）25%（重量/体积）20毫升

全部的不适用40毫升

21.1% (w/v) 不含抗生素的琼脂 LB 平板

高压灭菌并冷却至 55 °C。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其冷却并在室温下凝固。 4°C 保存两周。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂1%（重量/体积）2.5克

水蒸气_ _不适用250毫升

全部的不适用250毫升

22.2 × 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 YT

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2 × YT不适用100毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升100微升

全部的不适用100毫升

23.50 mg/mL 卡那霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

卡那霉素50毫克/毫升0.5克

水蒸气_ _不适用10毫升

全部的不适用10毫升

24.2 ×含有 25 µg/mL 卡那霉素的 YT

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2 × YT不适用100毫升

卡那霉素（配方 23）25微克/毫升50微升

水蒸气_ _不适用100毫升

全部的不适用100毫升

25.PEG/NaCl沉淀溶液

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

聚乙二醇600020%（重量/体积）200克

氯化钠2.5M146.1克

水蒸气_ _不适用补足至 1,000 mL

全部的不适用1,000 毫升

26.2 × YT，含有 100 µg/mL 氨苄西林和 25 µg/mL 卡那霉素

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

2 × YT不适用100毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升100微升

卡那霉素（配方 23）25微克/毫升50微升

水蒸气_ _不适用100毫升

全部的不适用100毫升

27.TBSC

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

Tris碱基10毫米0.788克

氯化钠137毫米4克

CaCl 2 ·2H 2 O1毫米73.5毫克

水蒸气_ _不适用500毫升

全部的不适用500毫升

28.1 毫克/毫升胰蛋白酶

准备 130 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

胰蛋白酶1毫克/毫升50毫克

水蒸气_ _不适用50毫升

全部的不适用50毫升

29.250 µg/mL 胰蛋白酶

使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

胰蛋白酶（配方 28）250微克/毫升125微升

TBSC（食谱 27）不适用375微升

全部的不适用500微升

30.很棒的肉汤

高压灭菌并储存在室温下。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

细菌胰蛋白胨12克/升3克

酵母抽提物24克/升6克

甘油0.4%（体积比）1毫升

KH 2 PO 40.17米0.5775克

K 2 HPO 40.72M3.135克

水蒸气_ _不适用250毫升

全部的不适用250毫升

31.20% (w/v) 葡萄糖

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

葡萄糖20%（重量/体积）20克

水蒸气_ _不适用补足至 100 mL

全部的不适用100毫升

32.1M MgCl 2 ·6H 2 O

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

MgCl 2 ·6H 2 O1M4.066克

水蒸气_ _不适用20毫升

全部的不适用20毫升

33.含有100 µg/mL 氨苄青霉素、0.1% 葡萄糖、2 mM MgCl 2 ·6H 2 O的极好的肉汤

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

很棒的肉汤（食谱30）不适用99.2毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升100微升

葡萄糖（食谱 31）0.1%（体积比）500微升

MgCl 2 ·6H 2 O（配方32）2毫米200微升

全部的不适用100毫升

34.1M IPTG

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 500 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

IPTG1M4.766克

水蒸气_ _不适用20毫升

全部的不适用20毫升

35.1 mg/mL 硫酸多粘菌素 B 的PBS溶液

准备 1 mL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

粘菌素B1毫克/毫升2毫克

PBS（配方 3）1 ×2毫升

全部的不适用2毫升

36.1 × NuPAGE TM MES SDS 电泳缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

制造执行系统 (20 × )1 ×100毫升

水分子_不适用1,900 毫升

全部的不适用2,000 毫升

37.平衡缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

咪唑30毫米0.51克

PBS（配方 3）1 ×250毫升

调节pH值至7.4

全部的不适用250毫升

38.洗脱缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

咪唑300毫米2.04克

PBS（配方 3）1 ×100毫升

调节pH值至7.4

全部的不适用100毫升

39.八位组稀释缓冲液

储存于室温。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

牛血清白蛋白0.1%（重量/体积）50毫克

PBS（配方 3）（或与蛋白质兼容的缓冲液）1 ×50毫升

全部的不适用50毫升

40.1% (w/v) 琼脂 LB 板，含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、2 mM IPTG、40 µg/mL X-gal

在添加添加剂之前，进行高压灭菌并冷却至 55 °C。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其冷却并在室温下凝固。 4°C 保存两周。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升6.25克

细菌琼脂1%（重量/体积）2.5克

水蒸气_ _不适用补足至 250 mL

全部的不适用250毫升

氨苄青霉素（配方 16）100微克/毫升250微升

IPTG（配方 34）2毫米500微升

X-半乳糖 (20 毫克/毫升)40微克/毫升500微升

41.34 毫克/毫升氯霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

氯霉素34毫克/毫升34毫克

乙醇100%1毫升

全部的不适用1毫升

42.50 mg/mL 壮观霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

二盐酸盐大观霉素五水合物50毫克/毫升50毫克

水蒸气_ _不适用1毫升

全部的不适用1毫升

43.50 mg/mL 羧苄青霉素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

羧苄西林二钠盐50毫克/毫升50毫克

水蒸气_ _不适用1毫升

全部的不适用1毫升

44.1% (w/v) 琼脂 LB 板，含有 34 µg/mL 氯霉素、50 µg/mL 大观霉素、50 µg/mL 羧苄青霉素

高压灭菌器 LB 培养基和细菌琼脂混合并冷却至 55 °C，然后添加添加剂。翻转混合并倒入安全柜中的 8.5 厘米培养皿中。使其冷却并在室温下凝固。 4°C 保存两周。

试剂最终浓度数量或体积

LB培养基混合25克/升2.5克

细菌琼脂1%（重量/体积）1克

水蒸气_ _不适用补足至 100 mL

全部的不适用100毫升

氯霉素（配方 41）34微克/毫升100微升

大观霉素（配方 42）50微克/毫升100微升

羧苄青霉素（配方 43）50微克/毫升100微升

45.0.2 M 生物素

使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌。准备 100 µL 等分试样并储存在 -20°C 下。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

生物素0.2M0.488克

氢氧化钠 (1 M)不适用添加以溶解生物素

水蒸气_ _不适用补足至 10 mL

全部的不适用10毫升

46.含有 5 0 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素的极好的肉汤

在安全柜中使用前准备好。

试剂最终浓度数量或体积

很棒的肉汤（食谱30）不适用998 毫升

大观霉素（配方 42）50微克/毫升1毫升

羧苄青霉素（配方 43）50微克/毫升1毫升

全部的不适用1000毫升

47.1 mg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物

避光，制备 10 µL 等分试样，并保存在 -20°C 下。稳定六个月。

试剂最终浓度数量或体积

链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物 1毫克/毫升1毫克

PBS（配方 3）1 ×1毫升

全部的不适用1毫升

48.50 µg/mL 链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 结合物

避光并在使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 缀合物 (1 mg/mL)50微克/毫升1微升

PBS（配方 3）1 ×20微升

全部的不适用20微升

49.500 mM TCEP，pH 8.0

储存于 4°C。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

TCEP500毫米1.433克

水蒸气_ _不适用10毫升

调节pH值至8.0

全部的不适用10毫升

50.1 mM TCEP，pH 8.0

使用前准备。

试剂最终浓度数量或体积

TCEP（配方 49）1毫米2微升

水蒸气_ _不适用998微升

全部的不适用1毫升

51.10 mg/mL Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺

避光并储存于-20°C。稳定至少一年。

试剂最终浓度数量或体积

Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺10毫克/毫升1毫克

二甲基亚砜1 ×500微升_

全部的不适用500微升

52.不含酚红的 DMEM 培养基，10% (v/v) FBS，1 × GlutaMAX TM , 1 ×青霉素-链霉素

储存于 4°C。稳定至少1个月。

试剂最终浓度数量或体积

DMEM培养基不适用88毫升

胎牛血清10%（体积/体积）10毫升

GlutaMAX ™ (100 × )1 ×1毫升

青霉素-链霉素 (100 × )1 ×1毫升

全部的不适用100毫升

53.共焦封闭缓冲液

储存于 4°C。 1个月内使用。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（配方 3）1 ×10毫升

牛血清白蛋白5%（重量/体积）0.5克

海卫一 X-1000.25%（体积比）25微升

全部的不适用10毫升

54.共焦稀释缓冲液

储存于 4°C。 1个月内使用。

试剂最终浓度数量或体积

PBS（配方 3）1 ×10毫升

牛血清白蛋白1%（重量/体积）0.1克

海卫一 X-1000.25%（体积比）25微升

全部的不适用10毫升

实验室用品

1.Vacuette ®管 4 mL CAT 血清凝块激活剂采血管（Greiner，Bio-one，目录号： 454204）

2.Vacuette®管9 mL NH肝素钠采血管（Greiner，Bio-one，目录号： 455051）

3.微量离心管，0.5 mL、1.5 mL、2 mL（Greiner，Bio-one，目录号：667201、616201、623201）

4.1.5 mL 微量离心管，不含 RNase（SARSTEDT，目录号：72.706.700）

5.PCR 管和盖子（VWR，目录号：20170-010）

6.50 mL锥形离心管（Greiner Bio-One，目录号：227261）

7.血清移液器，2 mL、5 mL、10 mL、50 mL（Greiner Bio-One，目录号：710180、606180、607180、760180、768160）

8.螺旋盖微管（SARSTEDT，目录号：72.694.305）

9.Microlance TM 3 针，21G（BD，目录号：304432）

10.2.5 mL注射器（Greiner Bio-One，目录号：SYR2）

11.8.5 厘米培养皿（Greiner，Bio-one，目录号：633181）

12.移液器吸头，过滤，20 µL、200 µL、1,000 µL（Mettler Toledo，Ranin，目录号：17005861、17005863、30389211）

13.Gene Pulser 电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙（Bio-Rad，目录号：1652083）

14.聚苯乙烯半微量比色皿（ Fisherbrand ，目录号：FB55147）

15.125 mL 带挡板烧瓶（VWR，目录号：214-0458）

16.250 mL 带挡板烧瓶（VWR，目录号：214-0460）

17.1 L 带挡板烧瓶（VWR，目录号：214-0464）

18.色皿（Merck， Hellma® ，目录号：Z600210）

19.方形生物测定皿（Nunc，目录号：240845）

20.试剂槽，非无菌（VWR，目录号：613-1176）

21.无菌试剂槽（ Axygen ，目录号：RES-V-25-S）

22.深孔 96 孔 2 mL 板（ Fisherbrand ，目录号：11391555）

23.深孔 96 孔 1 mL 板（Greiner，Bio-one，目录号：780215）

24.深孔 96 孔 0.5 mL 板（Greiner，Bio-one，目录号：786261）

25.细胞培养粘合密封（ Azenta Life Sciences，目录号：4ti-0517）

26.用于 ELISA 和一般孵化的粘合膜（VWR，目录号：60941-062）

27.PCR 箔密封（ Azenta Life Sciences，目录号：4ti-0550）

28.刚性半裙边96孔PCR板（ Thermo Scientific，目录号：AB-0990）

29.Framestar ® 96孔裙边PCR板（ Azenta Life Sciences，目录号：4ti-0960）

30.96孔ELISA微孔板（Greiner Bio-One，目录号：655061）

31.Octet SA 生物传感器（Sartorius，目录号：18-5019）

32.96孔黑色板，聚丙烯（Greiner Bio-One，目录号：655209）

33.96孔微量滴定板（Greiner Bio-One，目录号：65101）

34.250 mL PPCO 离心管（Nalgene，目录号：3141-0250）

35.25 mL高速 PPCO 离心管（Nalgene，目录号：3119-0010）

36.NuPage 4 %– 12% bis tris 预制凝胶（Invitrogen，目录号：NP0323BOX）。合适的替代品是自制 12% 电泳和 4% 堆积 SDS-PAGE 凝胶

37.0.22 μm注射器过滤器（Agilent，目录号：5190-5116）

38.µ-Slide 8 孔高分子底室盖玻片（同上，目录号：80807）

39.带有磨边的显微镜载玻片（ Fisherbrand ，目录号：11572203）

40.显微镜盖玻片，直径 12 mm，编号1.5（科学实验室用品，目录号：MIC3334）

41.6孔细胞培养皿（Greiner Bio-One，目录号：657160）

42.杜蒙镊子样式 5（电子显微镜科学，目录号：0203-5-PS）

设备

1.移液器男孩 acu 2 移液器控制器（ Ingetra ，目录号：I155017）

2.单通道移液器入门套件（Mettler Toledo，Ranin，目录号：30386738）

3.多道移液器 1 – 10 µL、20 – 200 µL、100 – 1,200 µL（Mettler Toledo、Ranin，目录号：17013802、17013805、17014496）

4.微孔板清洗机（ Thermo Fisher， Wellwash TM ，目录号： 5165000）。如果没有可用的洗井器，可以使用多通道移液器或使用装有 PBST 的洗瓶手动清洗孔

5.CLARIOstar plus 读板器（BMG Labtech，目录号：430-501S-FL）

6.2 级微生物安全柜（简称安全柜并称为层流）（Contained Air 解决方案，目录号： BioMAT 2）。如果没有可用的安全柜，则使用本生灯工作是一个合适的替代方案。使用易燃乙醇进行明火作业时应小心谨慎

7.PCR工作站柜（ Bigneat ，目录号：MW520-20）

8.NanoDrop TM One/ One C微量紫外-可见分光光度计（ Thermo Scientific，目录号：ND-ONE-W）

9.DynaMag TM 96 面磁铁（Invitrogen，目录号：12331D）

10.PCR热循环仪（Applied Biosystems， Veriti TM ，目录号：4375305）

11.Eporator （Eppendorf，目录号：4309000027）

12.ChemiDoc TM成像系统（Bio-Rad，目录号：12003154）

13.细胞密度计（ Fisherbrand ，目录号：A0）

14.多子电泳系统（ Flowgen ，目录号：FMMS10）

15.SDS-PAGE 设备，迷你凝胶槽（ Invitogen ，目录号：A25977）

16.PowerPac基本电源（Bio-Rad，目录号：1645050EDU）

17.JB Nova 水浴（Grant，目录号：JBN5）

18.干加热块（Grant，目录号：QBD2）

19.双 LED 蓝/白光透射仪（ Thermo Fisher，目录号：LB0100）

20.Safe Imager TM观察眼镜（ Thermo Fisher，目录号：S37103）

21.HulaMixer TM样品混合器（Invitrogen，目录号：15920D）。使用此样品混合器的搅拌使用以下设置进行：轨道 = 5，rpm = 1

22.DynaMag TM -2 磁铁（Invitrogen，目录号：12321D）

23.LSE TM数字微孔板摇床（Corning，目录号：4782-4）。使用微孔板摇床以 500 rpm 的转速进行搅拌

24.Multifuge X4 Pro-MD（ Thermo Scientific，目录号：75009500）。在所有离心步骤中，除非另有说明，否则均使用最大加速度和减速度

25.Fresco TM 21 微量离心机（ Thermo Scientific，目录号：75002555）

26.轨道振荡培养箱（Shel Lab，目录号：SI6/SI6R）（用于 600 rpm 搅拌步骤）

27.44R 培养摇床（New Brunswick，Innova ® ，目录号：M1282-0006）（用于 200 和 250 rpm 搅拌步骤）

28.Octet ® R8（Sartorius，目录号：30-0518）

29.SP8 Lightning 共焦显微镜（徕卡显微系统有限公司）

30.Heracell TM VIOS 160i CO 2培养箱（ Thermo Scientific，目录号：51033559）

31.Stuart TM SSM3 回转摇杆（Cole-Parmer，目录号：51900-26）

软件和数据集

1.SnapGene （7.1.0 版，2023 年，2023 年 11 月 28 日发布）；需要许可证

2.Octet® Analysis Studio 软件（版本12.2.2.26）；需要许可证

3.LasX软件（版本 5.2.1）；需要许可证

程序

A.美洲驼免疫

通过使用多达八种不同的蛋白质并行进行肌内免疫，可以在美洲驼中产生抗体。蛋白质的特性取决于预期的应用。我们已经将纳米抗体转化为整合膜蛋白（例如 PEPT2 [4]）、细胞表面糖蛋白（例如 GPC3 [7]）和病毒抗原（例如 SARS-CoV-2 刺突蛋白 [6]）。

1.将蛋白质抗原以 3 × 200 µg 等分试样储存在 -80 °C下，优选每等分试样 200 µL 1 mg/mL，储存在 PBS或最适合该蛋白质的缓冲液中（例如，如果在去污剂溶解的膜蛋白中，则缓冲液中应包含所需量的适当去污剂）。

2.抗凝剂的血管中采集5 mL血液，制备免疫前血清样本。免疫前血清样品的制备详见步骤 C2。

3.解冻免疫接种中要包含的每种蛋白质的等分试样。将每种蛋白质与等体积的Gerbu佐剂轻轻混合，并在骆驼的颈底/肩部皮下注射（每个部位最多 2 mL）。

4.驼在第 0 天进行免疫，然后在第 28 天和第 56 天进行两次抗原加强。最后一次加强后十天，将来自颈静脉的 170 mL 血液收集到肝素化管中（以防止凝血），用于分离多形核细胞（ PMNC）。另外，在不含抗凝剂的血管中采集5 mL血液，制备免疫后血清样本。步骤 C2 中描述了如何制备免疫后血清样品的详细信息。

B.血清转化酶联免疫吸附试验

进行血清转化 ELISA 来确认美洲驼的免疫是否成功地产生了对注射抗原的反应。强烈的 ELISA 信号强烈表明可以通过噬菌体展示从创建的文库中分离结合纳米抗体。

1.96 孔 ELISA微孔板中涂上100 µL/孔的 10 µg/mL neutrAvidin TM （用 PBS 稀释），并在 4 °C 下孵育过夜。

2.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

3.添加 100 µL/孔稀释于 PBS 中的50 nM生物素化靶蛋白，并在微孔板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。参见一般说明 1 。

4.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

5.添加 250 µL封闭液，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

6.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

7.将 110 µL在封闭溶液中按 1:10 稀释的免疫前或免疫后血清添加到 96 孔板的第一个孔中。通过向第二个孔中添加 100 µL封闭溶液并添加第一个孔中的 10 µL溶液来制备板中血清的系列稀释液。对第三个孔重复上述操作，使血清稀释至十分之一、百分之一和百分之一,000；包括无血清对照。在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

8.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

9.添加 100 µL/孔的抗美洲驼-HRP（在 0.1% BSA-PBS 中按 1:2,500 稀释），并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

10.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

11.添加 100 µL ABTS 底物，该底物是通过以 1:1 的比例混合溶液 A 和溶液 B 制备的。避光并在 15 分钟后测量 405 nm 处的吸光度。参见一般说明 2 。

C.VHH文库制备

下面（表 1）是准备 VHH 文库所需的建议实验时间表。协议可以被中断/保持的实例由“暂停点”指示。

表格1 。 VHH文库制备实验时间表

任务1任务2任务3

第一天PMNC 的分离

(步骤C1)免疫血清的分离

(步骤C2)RNA 提取（步骤 C3a – g）暂停点

第二天RNA提取

（步骤C3h- i ）VHH1 的反转录和 PCR 扩增（步骤 C4）VHH2 的产生（步骤 C5）暂停点

第三天pADL23c 的消化（步骤 C6）

暂停点

第 4 天文库大小测试

（步骤 C7a – g）

第五天文库大小测试

（步骤 C7h – n）

暂停点

第六天规模化文库制备（步骤 C8a – i ）

第 7 天规模化文库制备（步骤 C8j）

暂停点

1.PMNC 的分离

以下说明基于在 17 × 10 mL血管中接收 170 mL 美洲驼血液（不含抗凝剂）。 PMNC 的分离应在抽血当天进行。所有工作均在喷洒 5% Chemgene和 70% EtOH后在安全柜中进行。

注意：用 2% Virkon 净化所有血液污染的消耗品和液体，然后进行高压灭菌。

a.使用 10 mL 血清移液器将血液从 2 × 10 mL 血管转移到 1 × 50 mL 锥形离心管中。

b.将 10 mL PBS 添加到每个空血液瓶中，然后将 20 mL 血液转移到锥形离心管中（步骤 C1a），使每 50 mL 锥形离心管的总体积为 40 mL 稀释血液，或总体积340毫升稀释血液。轻轻翻转试管以确保混合物均匀。

c.在新鲜的 23 × 50 mL 锥形离心管中，添加 15 mL Histopaque ® -1077 ，然后轻轻地将 15 mL 稀释血液涂在顶部。参见一般说明 3 。添加血液时，将管子与水平面成 45° 角。参见一般说明 4 。

关键：此时避免搅动管子以维持正在形成的密度梯度。

d.使用加速度 = 1 和减速度 = 0将锥形离心管在 18°C 下以 800× g离心 20 分钟。

关键：加速度和减速度非常重要，因为它们将创建并保持所需的梯度。 PMNC层的密度梯度和定位结果如图1所示。

图 1. 使用密度梯度从美洲驼血液中分离多形核细胞 (PMNC)。将稀释的美洲驼血液覆盖在Histopaque ® -1007 上，并在离心后形成 PMNC 和红细胞 (RBC) 层。

e.从 23 个准备好的血液 – Histopaque ® -1077管中，收集血浆 – Histopaque ® -1077界面处的 PMNC 层（图 1 中的红色方块）。这是通过使用 25 mL 血清移液器并将其放置在界面上方，在移动穿过表面界面的同时向上吸取液体来实现的。任何用 PMNC 吸取的Histopaque ® -1077或血清都将在下一步中被洗掉。

f.将 2× 锥形离心管中分离的 PMNC 转移到单个 50 mL 锥形离心管中。通常，从每个锥形离心管中回收 15–20 mL 的 PMNC。如果收集更多，请确保将 20 mL 分离的 PMNC 添加到新鲜的 50 mL 锥形离心管中。此时应有 23 至 25 × 50 mL 锥形离心管。

g.向每个含有分离 PMNC 的锥形离心管中添加 PBS 至总体积 40 mL。只要不接触锥形离心管，就可以从 PBS 瓶中倒出。轻轻翻转锥形离心管数次，并在 18°C 下以 250× g离心10 分钟。

h.倒出上清液，并使用每个颗粒的新 5 mL 血清移液器轻轻地将每个锥形离心管中的颗粒重新悬浮在 5 mL PBS 中。将细胞在 18°C 下以 100× g离心 5 分钟。

注意：此时，开始使用RNaseZap TM擦拭工作台面、手套以及任何带入安全柜的物品。

i.使用 5 mL 血清移液器从每个 50 mL 锥形离心管中取出上清液。使用 2 mL 血清移液器轻轻地将总共 1 mL PBS 中的三个锥形离心管中的颗粒重新悬浮到单个 50 mL 锥形离心管中。使用该血清移液管中的最终液体量并将其分配到 1.5 mL 微量离心管中。此时应该有六个 50 mL 锥形离心管和六个 1.5 mL 微量离心管。

j.从安全柜中取出六个 1.5 mL 微量离心管。在每个 1.5 mL 微量离心管的盖子中，添加 20 μL细胞和 20 μL台盼蓝并轻轻混合。使用自动细胞计数器确定细胞数量和活力。从每个锥形离心管中取出的每个样品预计有大约 1×10 7 个细胞，其活力为 98%–100%。因此，预计总产量为 6×10 7个细胞。参见一般说明 5 。

RNaseZap TM并使用无 RNase 吸头和 1.5 mL 微量离心管后，可以在实验室工作台或 PCR 柜中执行以下步骤。

k.将细胞悬浮液从每个 50 mL 锥形离心管（步骤 C1i）转移到各自的 1.5 mL 微量离心管中。总共应该有六个 1.5 mL 微量离心管。将细胞在 4°C 下以 100× g沉淀5 分钟。丢弃上清液。现在可以从沉淀中分离 RNA（步骤 C3a）。

关键：立即执行 RNA 提取（步骤 C3）。

2.免疫前和免疫后血清的分离

血清分离必须在抽血当天进行。这些步骤可以在实验室工作台上分离 PMNC 期间完成。

a.将凝固的血液在 RT 下孵育 30 分钟。

b.将血清和血凝块转移至 50 mL 锥形离心管中。这是通过使用 2 mL 血清移液管在血凝块上刺孔并使用条带将凝块和血清引导至 50 mL 锥形离心管中来实现的。将锥形离心管在 4°C 下以 1,000× g离心 10 分钟。

c.将血清转移至 15 mL 锥形离心管中。可能需要在 4 °C 下以 1,000× g离心10 分钟以获得澄清血清。在螺旋盖微管中制备 500 μL等份血清，然后储存在 -20°C 下。

3.RNA提取

RNaseZap TM后在实验室工作台或 PCR 柜中完成。使用不含 RNase 的耗材和带有RNaseZap TM 的喷雾手套。参见一般说明 6 。

a.向六个 1.5 mL 微量离心管中的每个细胞沉淀（步骤 C1k）中添加 1 mL 冷TRIzol TM试剂。使用 21 G 针头和 2.5 mL 注射器，通过针头抽吸和分配十次，均化每个 1.5 mL 微量离心管的内容物。

注意：使用针时要小心。

b.孵育5 分钟，以允许核蛋白复合物完全解离，然后向每个 1.5 mL 微量离心管中添加 0.2 mL 氯仿。

c.剧烈涡旋每个微量离心管约 10 秒。应出现均匀的粉红色乳状溶液。在冰上孵育 3 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000× g离心15 分钟。混合物分成下层红色苯酚-氯仿层、中间层和无色上层水相。如果上层仍然混浊或未正确形成，请再次涡旋并离心。

d.μL移液器将约 500 μL含有 RNA 的上水相转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。可以留下一些上层水层以确保不包含来自界面的沉淀物。加入 0.5 mL 异丙醇，轻轻翻转每个管数次，并在冰上孵育 10 分钟。

e.以 12,000× g离心 10 分钟以沉淀 RNA。将 1.5 mL 微量离心管的盖子在转子中朝外，以帮助离心后白色凝胶状颗粒的可视化。使用 200 μL移液器去除约 900 μL含有异丙醇的上清液，以确保颗粒不会受到废物的干扰或意外吸入。

f.将 1 mL 75% 乙醇添加到 1.5 mL 微量离心管中，短暂涡旋，然后在 4 °C 下以 7,500× g离心5 分钟。 RNA 沉淀会比上一步结束时看起来更白、更大。使用 200 μL移液器去除约 900 μL上清液，以确保沉淀不会受到干扰或意外吸入。

g.添加 1 mL 75% EtOH，并将纯化的 RNA 储存于-20°C。参见一般注释 7 。

暂停点。

h.从 -20 °C 中取出一支 RNA 微量离心管，并在 4 °C 下以 7,500× g离心5 分钟。使用 200 µL ，然后使用 10 µL移液器丢弃 EtOH，以去除所有 EtOH，而不会意外吸入颗粒。在室温下干燥 10 分钟。

i.将 RNA 沉淀溶解在 30 µL无核酸酶水中，并使用 Nanodrop测量 A 260 。每 1.5 mL 管的预期浓度为 500 至 800 ng/ µL ，A 260/280和 A 260/230的值约为 2.0 。

关键：使用 PCR 柜中的无 RNase 吸头和移液器来测量 RNA 浓度，以避免 Nanodrop 使用的公用吸头和移液器引入 RNase。分离出 RNA 后，尽快进行步骤 C4 以产生比 RNA 更稳定的 cDNA。

4.VHH1的反转录和PCR扩增

RNaseZap TM后，在实验室工作台或 PCR 柜中工作。使用不含 RNase 的耗材和带有RNaseZap TM 的喷雾手套。参见一般说明 6 。

a.在 PCR 管 (1 × 50 µL) 中准备以下反应（表 2）。

表2. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用9.5微升

10 µM CALL 001 引物0.5微米2.5微升

10 µM CALL 002 引物0.5微米2.5微升

2 × 白金TM SuperFi TM RT-PCR 预混液1 ×25微升

1 µ g 模板 RNA（步骤 C3i）200纳克10微升

SuperScript TM IV RT 混合液0.5微升

全部的不适用50微升

b.短暂涡旋并离心反应管并置于冰上。

c.如下设置热循环仪并执行 PCR（表 3）。

表3. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

逆转录5510分钟1

逆转录失活/初始变性982分钟

变性9810秒30

退火6610秒

扩大7230秒

最终延期725分钟1

抓住12无限保持-

从此时起无需维持无 RNase 条件。在实验室工作台上工作。

d.将 10 µL 6× DNA 凝胶上样缓冲液添加到反应管中，并在含有 1× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的 0.7% 琼脂糖凝胶上沿着 1× GeneRuler 1 kb DNA 梯子的泳道运行。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。

e.使用 LED 蓝色透照仪可视化扩增的 700 bp 片段 (VHH-CH2)，使用手术刀从凝胶中切除，并根据制造商的方案使用Nucleospin凝胶和 PCR 清理套件进行凝胶提取。在最终体积为 50 μL 的 NE 缓冲液中洗脱。

注意：在从琼脂糖凝胶中切除条带的过程中观察 DNA 时，请使用Safe Imager TM观察眼镜，并在使用手术刀时要小心。

f.使用Purelink PCR 纯化试剂盒，向凝胶提取的产物中添加4 倍体积的 B2 缓冲液 (200 µL) ，并使用Purelink PCR 纯化试剂盒中的一根Purelink柱进行纯化，在 25 µL E1 中洗脱。测量 A 280 ，预计浓度约为 40–50 ng/ µL。

g.将 6× DNA 凝胶上样缓冲液与 120 ng VHH1（步骤 C4f）混合至 1× 终浓度，并在含有 1 × SYBR TM安全 DNA的 1% 琼脂糖凝胶上与 1 × HyperLadder TM 1 kb DNA 梯子孔一起运行凝胶染色以确定纯度。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 2 所示。

图 2.约 700 bp 的扩增 VHH1 样本在含有 1 × SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的1% 琼脂糖凝胶上可视化。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

5.VHH2的生产

a.准备以下 PCR 反应（6 × 50 µL 反应）（表 4）。

表4. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用19微升

10 µM VHH For2 引物0.5微米2.5微升

10 µM VHH Rev 底漆0.5微米2.5微升

2 × Phusion 快速 PCR 预混液1 ×25微升

5 ng/μL VHH1（步骤 C4f）1纳克10微升

全部的不适用50微升

b.短暂涡旋并离心反应管。

c.如下设置热循环仪并执行 PCR（表 5）。

表5. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性9830秒1

退火9810秒30

扩大5530秒

最终延期7220秒

抓住725分钟1

变性12无限保持-

d.将所有六个反应合并到一个 2 mL 微量离心管中。使用Purelink PCR 纯化试剂盒，将 4 ×体积的 B2 缓冲液 (1.2 mL) 添加到扩增的 PCR 产物中，并在两个Purelink柱之间进行纯化，每个柱使用 25 µL E1 缓冲液进行洗脱。将两种洗脱液合并到一个 1.5 mL 微量离心管中，测量 A 280 ，并预计浓度在 200 和 300 纳克/微升。

e.将 6 × DNA 凝胶上样缓冲液与 120 ng VHH2（步骤 C5d）混合至 1 ×终浓度，并在含有 1 × SYBR TM安全 DNA的 1% 琼脂糖凝胶上与 1 × Hyperladder TM 1 kb DNAladder 的孔一起运行凝胶染色以确定纯度。在 1 × TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 3 所示。

暂停点。

TM安全 DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上可视化。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

6.pADL23c 的消化

a.在 PCR 管中准备以下限制性消化反应（10 × 100 µL 反应）（表 6）。

表6. 限制性酶切反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用83微升

rCutSmart TM缓冲液1 ×10微升

斯菲尔5 单位2.5微升

400 ng/μL 载体 DNA1.8微克4.5微升

全部的不适用100微升

b.短暂涡旋并离心反应管。

c.50°C 孵育 2 小时。

d.将 20 µL 6× DNA 凝胶上样缓冲液添加到每个反应管中，并在含有 1× SYBR TM Safe DNA 凝胶染色剂的 0.7% 琼脂糖凝胶上与 1× GeneRuler 1 kb DNAladder 的孔一起运行。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 4 所示。

图 4.凝胶提取前对 pADL23c 噬菌粒载体进行SfiI消化后，制备型 0.8% 琼脂糖凝胶，其中含有 1 × SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂，对载体骨架（上条带）和填充片段（下条带）进行染色。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

e.使用 LED 蓝色透照仪可视化消化的、较高分子量、大约 3,000 bp 的载体主链，使用手术刀从凝胶中切除，并根据制造商的方案使用Nucleospin凝胶和 PCR 清理套件中的 10 个旋转柱进行凝胶提取。使用 50 µL NE 缓冲液洗脱每列，并将所有洗脱液汇集到单个 1.5 mL 微量离心管中。

注意：在从琼脂糖凝胶中切除条带的过程中观察 DNA 时，请使用Safe Imager TM观察眼镜，并在使用手术刀时要小心。

f.使用Purelink PCR 纯化试剂盒，向凝胶提取的产物中添加 4 倍体积的 B3 缓冲液 (2 mL)，并使用Purelink PCR 纯化试剂盒中的一根Purelink柱进行纯化，并在 50 µL EB 中洗脱。测量 A 280并预计浓度在 50 至 80 ng/ µL 之间。

g.将 6 × DNA 凝胶上样缓冲液与 120 ng VHH2 混合（步骤 C5d），将 pADL23c 主链（步骤 C6f）消化至最终浓度 1 × ，并沿着 1 ×孔运行 HyperLadder TM 1 kb DNA 梯度在含有 1 × SYBR TM Safe DNA 凝胶染色的 1% 琼脂糖凝胶上测定纯度。在 1 × TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。预期结果如图 5 所示。

暂停点。

× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的 1% 琼脂糖凝胶上可视化。显示了并行运行的 DNA 梯子的碱基对大小。

7.文库大小测试

a.× 10 µL) 中准备以下输注反应（表 7）。

表7. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用5微升

5 × CEII缓冲器1 ×2微升

100 ng/ µL VHH2 插入片段（步骤 C5d）100纳克1微升

20 ng/μL 载体 DNA（步骤 C6f）20纳克1微升

外切酶II1微升

全部的不适用10微升

b.短暂涡旋并离心反应管。

c.使用热循环仪在 42°C 孵育 30 分钟。添加 40 μL TE 缓冲液以终止反应。

d.使用Purelink PCR 纯化试剂盒，将4 倍体积的 B3 缓冲液 (200 µL) 添加到融合产品中，并使用一根Purelink柱在 20 µL 无核酸酶水中洗脱进行纯化。

注意：在安全柜中工作。

e.微量离心管中轻轻混合 5 µL 纯化的输注反应与 30 µL 感受态 TG1 ，并转移到冷冻的 1 mL 电穿孔比色皿中。

f.在 1.7 kV 下进行电穿孔，并立即将 400 µL 恢复介质添加到比色皿中。将内容物转移至 2 mL微量离心管中，并在 37°C 下以 600 rpm 搅拌孵育 1 小时。参见一般说明 8 。

g.× YT中制备 1:10、1:100 和 1:1,000 稀释液。将 100 µL 涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上直至干燥。 37°C孵育过夜。

h.使用以下公式以每毫升菌落形成单位 (CFU/mL) 估算文库大小：菌落数× 10（达到 mL） × 0.4（体积） ×稀释度。参见一般说明 9 。

i.根据估计的小规模文库大小，考虑到 5 µL 的融合反应产生 × 大小的文库，设置所需的反应数量。计算制作大小为 1 × 10 6的文库需要多少微升的输注反应。参见一般注释 10 。

j.为了验证小规模文库中全长 VHH 克隆的数量，在步骤 C7g 中从平板中随机选择的 48 个克隆中进行了菌落 PCR 扩增 ~500 bp VHH 基因。在 2 mL 微量离心管中制备以下 PCR 反应主混合物（表 8）。

表8. PCR 反应组成

试剂最终浓度单次反应体积主混合物体积

无核酸酶水不适用20.75微升1037.5 µL

10 µM 博士序列正向底漆0.2微米0.5微升25微升

10 µM 博士seq Rev 引物0.2微米0.5微升25微升

10 × Taq 缓冲液1 ×2.5微升125微升

25 mM dNTP0.25毫米0.25微升12.5微升

Taq聚合酶1 单位0.5微升25微升

全部的不适用25微升1250微升

k.短暂涡旋并离心反应管。

l.将 25 μL 主混合物移液至 96 孔刚性半裙边 PCR 板的 48 孔中。用 48 × 10 µL 吸头挑取 48 个菌落，并将其放入每个填充的孔中。使用多通道移液器取出吸头。用 PCR 箔密封盖住 PCR 板。

m.如下设置热循环仪并执行 PCR（表 9）。

表9. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性957分钟1

退火9515秒35

扩大5530秒

最终延期681分40秒

抓住685分钟1

变性12无限保持-

n.将 20 µL 2 × DNA 凝胶上样缓冲液添加到 PCR 板的每个孔中，并在 1 × DNA 凝胶孔旁边的每个孔中上样 10 µL GeneRuler 1 kb DNA 梯子在含有 1× SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂的1%琼脂糖凝胶上。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。在图 6 中，进行菌落 PCR 的 48 个克隆中有 46 个拥有与扩增的 VHH 基因相对应的约 500 bp 条带。两个非阳性克隆用星号表示。

暂停点。

图 6.从小规模文库制备中随机选择的 48 个克隆的菌落 PCR

8.规模化文库制备

a.在 PCR 管 (20 × 20 µL) 中准备以下反应（表 10）。

表10. In-Fusion 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用9微升

5 × CEII缓冲器1 ×4微升

50 ng/ µL VHH2 插入片段（步骤 C5c）100纳克2微升

5 ng/μL 载体 DNA（步骤 C6f）20纳克4微升

外切酶II1微升

全部的不适用20微升

b.短暂涡旋并离心反应管。

c.在热循环仪中 42°C 孵育 30 分钟。

d.将反应合并到单个 2 mL微量离心管中。使用Purelink PCR 纯化试剂盒，将4 倍体积的 B3 缓冲液 (1.6 mL) 添加到融合产品中，并使用一根Purelink柱在 50 µL 无核酸酶水中洗脱进行纯化。测量 A 280 ，预计浓度在 35 至 50 ng/ µL 之间。

注意：在安全柜内工作。

e.TG1 细胞在单独的反应中通过电穿孔进行转化，以创建规模化的文库。在 1.5 mL微量离心管中轻轻混合 6 µL 纯化的融合反应与 30 µL 的主管 TG1 ，然后转移到冷冻的 1 mL 电穿孔比色皿中。在 1.7 kV 下电穿孔，立即将 960 µL 恢复介质添加到比色皿中，并转移到 50 mL 锥形离心管中。参见一般说明 8 。

f.使用八种单独的融合 TG1 混合物重复此操作总共八次。

g.将两个比色杯的电穿孔细胞合并到单个 50 mL 锥形离心管中，并在 37°C 下以 200 rpm 摇动孵育 1 小时。您总共应该有四个锥形离心管。

h.使用锥形离心管之一中的5 0 µL ，并在 2 × 溶液中制备 1:10、1:100 和 1:1,000 稀释液 YT。将 100 µL 每种稀释液涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上，直至干燥。 37°C孵育过夜。使用这些板来估计文库大小 (CFU/mL) = 菌落数× 10（达到 mL） × 1.92（体积） ×稀释度。参见一般说明 9 。

i.四个锥形离心管中每一个的整个培养物接种到装有含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2% 琼脂 LB 板的单独生物测定皿上。总共应该有四块板。将整个体积展开直至干燥并在37°C 下孵育过夜。预计密度类似于图 7 所示，相当于 1 × 10 6 CFU/mL 大小的文库。参见一般说明 11 。

图 7. 1 × 10 6 CFU/mL 文库生物测定板上的预期密度

j.将每个生物测定板的菌落重悬于 6 mL 2× YT（含终浓度 25% 甘油）中，并转移至单个 50 mL 锥形离心管中。通过血清移液器充分混合，并在螺旋盖微管中制备 1 mL 等分试样，并将其储存在 -80°C。这是 VHH 库库存，用于第一轮淘选。

暂停点。

D.平移

下面是建议的淘选、通过 ELISA 进行命中鉴定和小规模表达的时间表，以最大限度地延长实验室时间，并在多人使用共享资源对多种蛋白质进行多次淘选活动时留出重叠空间（表 11）。

表11. 通过淘选、ELISA 和小规模表达鉴定纳米抗体结合物的实验时间表

周一周二周三周四星期五

第一周扩增 VHH 文库（步骤 D3）恢复文库噬菌体（步骤 D3）

第一次平移（步骤D4）恢复菌落草坪（步骤 D4）

扩增子文库（步骤D5）子文库噬菌体的回收（步骤D5）

第二次平移（步骤D6）将板从培养箱中取出并放入冰箱中。

第 2 周挑选 93 个菌落并过夜生长（步骤 D7）准备主板（步骤D7）

开始培养抗 M13 ELISA（步骤 D8）抗-M13 ELISA（步骤D8）PCR、净化、测序（步骤D9）

第三周小规模过夜培养（步骤 E1）小规模培养至 OD 并用 IPTG 诱导（步骤 E1）周质分离（步骤 E1）

Ni-NTA纯化（步骤E2）

脱盐（步骤E3）

滴定 ELISA（步骤 E4）

解离速率测定（步骤E5）

1.准备对数阶段TG1

注意：在安全柜内工作。

a.在不含抗生素的 1% 琼脂 LB 板上划线 TG1，并在 37°C 下孵育过夜。

b.将 20 mL 的 2 × YT 与单个 TG1 菌落接种到 100 mL 一次性带挡板锥形烧瓶中，并在 37°C 下以 200 rpm 摇动孵育过夜。

c.将 20 mL 50% 甘油与过夜培养物混合，并以 1 mL 等分试样储存在 -80°C 下。这是 TG1 库存，我们在需要时用它来制备对数期 TG1 培养物。

d.向 125 mL 一次性带挡板锥形烧瓶中的 25 mL 2 × YT 中添加足够的 TG1 库存（步骤 D1c），以使起始 OD 600约为 0.05。参见一般说明 12 。

e.将 TG1 培养物在 37°C 下以 200 rpm 的转速振荡孵育，直至 OD 600达到 0.4–0.6。这大约需要 1.5-2 小时。这是对数期 TG1，应保存在冰上并在 2 小时内使用。

2.准备CM13K辅助噬菌体

注意：噬菌体可以感染所有细菌。如果在蛋白质表达实验室工作，必须注意不要将噬菌体释放到公共区域。如果表面容易腐蚀，请先用 5% Chemgene擦拭表面，然后用 70% EtOH 擦拭。鼓励使用过滤吸头以减少气溶胶。所有受污染的消耗品必须用 2% Virkon 消毒并高压灭菌。如果可能，请对步骤 D1 –D 5中列出的所有培养物使用一次性锥形瓶。

注意：在安全柜内工作。

a.将20 mL 的 2 × YT 与 200 µL 对数相 TG1（步骤 D1e）接种到 125 mL 一次性挡板锥形烧瓶中。添加 1 µL 先前制备的 1 × 10 13 PFU/mL CM13K辅助噬菌体甘油库存（步骤 D2h），并在 37°C 下以 250 rpm 摇动孵育 4 小时。

b.在两个 1 L 一次性带挡板锥形烧瓶中，添加 250 mL 含有 25 µg/mL 卡那霉素的 2 × YT 和 10 mL 制备的培养物。在 25°C 下以 250 rpm 摇动孵育过夜。

c.×下沉淀细胞 g ，4°C 10 分钟，将约 170 mL 含有上清液的噬菌体转移至三个 250 mL PPCO 离心管中。将约 35 mL 冰冷的 PEG/NaCl 添加到每个管中，翻转并轻轻旋转，将 PEG/NaCl 溶液与噬菌体上清液混合。在冰上孵育 1 小时。

d.将管子以 12,000 ×离心 g在 4°C 下保持 15 分钟，并将三个沉淀分别重新悬浮在 4 mL 冰冷的无菌 PBS 中。将重新悬浮的颗粒合并到单个 25 mL 高速 PPCO 离心管中，并添加 2.5 mL 冰冷的 PEG/NaCl。轻轻旋转并翻转，将 PEG/NaCl 溶液与噬菌体上清液混合。在冰上孵育 30 分钟。

e.12,000 ×离心 g在 4°C 下保持 10 分钟，并将沉淀重新悬浮在 12 mL 冰冷的无菌 PBS 中。保持在 4°C，直到噬菌体浓度（以每毫升噬菌斑形成单位 (PFU/mL) 表示）通过分光光度法或噬菌斑测定法确定，这两种方法都应产生相似的值。

f.对于噬菌体浓度的分光光度测定，在 1.5 mL 微量离心管中，添加 998 µL PBS 和 2 µL 噬菌体（步骤 D2e），转移到石英比色皿中，并测量 268 nm 处的吸光度。计算 PFU/mL 时考虑到1.0 的A 268相当于 5 × 10 12 PFU/mL [11]。

g.为了使用噬菌斑测定法测定噬菌体浓度，在对数期 TG1（步骤 D1e）中制备CM13K辅助噬菌体（步骤 D2e）的十倍系列稀释液（10 -1至 10 -25 ），并在 RT 下孵育 5 分钟。将 10 -15至 10 -25稀释液的 100 µL 板接种到不含抗生素的 1% 琼脂 LB 板上。每个板添加 3 mL 0.7% 琼脂 LB（55 °C），并在整个板表面上旋转。让顶部琼脂凝固并在 37°C 下孵育过夜。使用以下公式计算 PFU/mL：斑块数（透明区域） × 10（达到 mL） ×稀释度。

h.CM13K辅助噬菌体（步骤 D2e）稀释至 2 × 10 13 PFU/mL，添加等体积的冰冷的 50% 甘油，轻轻混合以达到 1 × 10 13 PFU的最终浓度/毫升。将 100 µL 等份储存在 500 µL 微量离心管中。这是CM13K辅助噬菌体原液。每次解冻新的 100 µL 等分试样时，将 12 µL 分装到 9 × PCR 管中，以避免冻融原始 100 µL 等分试样。

3.扩增和恢复文库

注意：在安全柜内工作。

a.向 250 mL 一次性带挡板锥形瓶中的 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2 × YT 中添加足够的 VHH 文库库存（步骤 C8j），使起始 OD 600约为 0.05。参见一般说明 13 。

b.在 37°C 下以 200 rpm 的转速振荡孵育培养物，直至 OD 600达到 0.4–0.6。这大约需要 2 小时。参见一般说明 14 。

c.将 10 mL 该培养物转移至 50 mL 锥形离心管中，添加 10 µL CM13K辅助噬菌体原液（步骤 D2h），并通过轻轻旋转进行混合。 37°C 孵育 1 小时，无需搅拌。

d.×下沉淀细胞 g ，18°C 10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 25 µg/mL 卡那霉素的 2 × YT 中，并转移至 250 mL 一次性带挡板的锥形烧瓶中。在 25°C 下以 250 rpm 摇动孵育过夜。

e.×沉淀细胞 g在 4°C 下保持 10 分钟。

f.将 40 mL 含有上清液的噬菌体倒入新的 50 mL 锥形离心管中，并添加 10 mL 冰冷的 PEG/NaCl。翻转数次并在冰上孵育 1 小时。

g.×离心沉淀沉淀的噬菌体 g在 4°C 下保持 10 分钟。将噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL微量离心管中。

h.×离心后 g 4℃ 1 分钟，将含有噬菌体的上清液转移至新的 2 mL微量离心管中。添加 250 µL 冰冷的 PEG/NaCl 并翻转管，直至出现均匀的白色悬浮液。在冰上孵育 30 分钟。

i.将沉淀的噬菌体以 20,000 ×离心沉淀 g在 4°C 下保持 15 分钟。将沉淀的噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL微量离心管中。

j.×离心后 g 4℃ 1 分钟，将含有噬菌体的上清液转移至新的 2 mL微量离心管中。这是分离的文库噬菌体；应将其保存在冰上或 4°C 下，并可稳定一个月。

k.使用对数期 TG1 细胞从 10 -1到 10 -12十倍连续稀释，滴定 15 µL 库噬菌体（步骤 D1e）。在 37 °C 孵育 15 分钟后，将 50 µL 10 -4至 10 -12稀释液涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上，直至干燥，并在 37 °C 下孵育过夜。包括仅 TG1 的控件。参见一般注释 15 。

l.可以从文库中产生多少噬菌体。计算公式为：PFU/mL = 菌落数× 10（达到 mL） × 0.05（体积） ×稀释度。预计为 1 × 10 10 –1 × 10 13 PFU/ mL。参见一般注释 16 。

4.第一轮平移

注意：在实验室工作台上工作。

a.在 2 mL 微量离心管中，添加 500 µL StartingBlock缓冲液和 500 µL 分离的文库噬菌体（步骤 D3j）。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

b.添加适当体积的生物素化抗原，以在 1.5 mL 中达到 50 nM终浓度（通过步骤 C4d 实现）。参见一般说明 1 。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 1 小时。

c.此时，可以开始培养对数期 TG1 细胞（步骤 D1d-e），这将确保噬菌体洗脱后细胞达到所需的 OD 600 （步骤 D4h）。

d.噬菌体与抗原孵育 30 分钟（步骤 D4b），在新的 2 mL 微量离心管中添加 100 µL 链霉亲和素Dynabeads TM M-280 。用 500 μL 的 PBS 清洗珠子两次，然后添加 500 μL 的StartingBlock缓冲液。使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

e.将 1 mL 带有抗原的封闭噬菌体（步骤 D4b）转移至封闭珠子（步骤 D4d）。总体积为 1.5 mL，最终抗原浓度现在为 50 nM。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 15 分钟。

f.将微量离心管放在DynaMag TM -2 磁铁上。一旦珠子被拉到一边，丢弃上清液中未结合的噬菌体。将珠子重新悬浮在 500 μL 的 PBST 中，然后使用磁铁将珠子拉到一边，洗掉松散结合的噬菌体。用 PBST 重复此洗涤过程总共六次，然后用 PBS 重复一次。

g.将 500 µL 250 µg/mL 胰蛋白酶添加到珠子中。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

h.DynaMag TM -2 磁铁沉淀珠子后，从第一个平底锅中收集上清液中洗脱的噬菌体。

注意：在安全柜内工作。

i.在 50 mL 锥形离心管中，将第一个平底锅（步骤 D4h）中的 500 μL 洗脱噬菌体添加到 10 mL 对数期 TG1 细胞（步骤 D4c）中，并在 37°C 下孵育 30 分钟，无需搅拌。

j.将细胞在 18°C 下以 2,800× g沉淀10 分钟，然后重悬于 1 mL 2× YT 中。将整个体积涂在含有1% 琼脂 LB 和 100 µg/mL 氨苄青霉素的生物测定皿上直至干燥，并在 37 °C 下孵育过夜。

k.将菌落重悬于 6 mL 2× YT（含有终浓度 25% 甘油）中，并以 1 mL 等分试样储存在 -80 °C 的冷冻管中。这是 pan 1 子库库存。

5.扩增和恢复子库

注意：在安全柜内工作。

a.向 250 mL 一次性带挡板锥形瓶中的 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄西林的 2 × YT 中添加足够的盘 1 子文库库存（步骤 D4k），使起始 OD 600约为 0.05。参见一般说明 13 。

b.在 37°C 下以 200 rpm 的转速振荡孵育培养物，直至 OD 600达到 0.4–0.6。这大约需要 2 小时。参见一般说明 14 。

c.将 10 mL 该培养物转移至 50 mL 锥形离心管中，添加 10 µL CM13K辅助噬菌体原液（步骤 D2h），并通过轻轻旋转进行混合。 37°C 孵育 1 小时，无需搅拌。

d.×下沉淀细胞 g ，18°C 10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 25 µg/mL 卡那霉素的 2 × YT 中，并转移至 250 mL 一次性带挡板的锥形烧瓶中。在 25°C 下以 250 rpm 摇动孵育过夜。

e.×沉淀细胞 g在 4°C 下保持 10 分钟。

f.将 40 mL 含有上清液的噬菌体倒入新的 50 mL 锥形离心管中，并添加 10 mL 冰冷的 PEG/NaCl。翻转数次并在冰上孵育 1 小时。

g.×离心沉淀沉淀的噬菌体 g在 4°C 下保持 10 分钟。将噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL微量离心管中。

h.×离心后 g 4℃ 1 分钟，将含有噬菌体的上清液转移至新的 2 mL微量离心管中。添加 250 μL 冰冷的 PEG/NaCl，并翻转微量离心管，直至出现均匀的白色悬浮液。在冰上孵育 30 分钟。

i.×离心沉淀沉淀的噬菌体 g在 4°C 下保持 15 分钟。将沉淀的噬菌体重悬于 1 mL 冰冷的无菌 PBS 中，并转移至 2 mL微量离心管中。

j.×离心后 g 4℃ 1 分钟，将含有噬菌体的上清液转移至新的 2 mL微量离心管中。这是分离的 pan 1 噬菌体；应将其保存在冰上或 4°C 下，并可稳定一个月。

6.第二轮平移

注意：在实验室工作台上工作。

a.在 2 mL 微量离心管中，添加 500 μL 的StartingBlock缓冲液和 500 μL 的分离盘 1 噬菌体（步骤 D5j）。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

b.添加适当体积的生物素化抗原，以在 1.5 mL 中达到 5 nM终浓度（通过步骤 C6d 实现）。参见一般说明 1 。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 1 小时。

c.此时，可以开始培养对数期 TG1 细胞（步骤 D1d-e），这将确保噬菌体洗脱后细胞达到所需的 OD 600 （步骤 D6h）。

d.噬菌体与抗原孵育 30 分钟（步骤 D6b），在新的 2 mL 微量离心管中添加 10 µL 链霉亲和素Dynabeads TM M-280 。用 500 μL 的 PBS 清洗珠子两次，然后添加 500 μL 的StartingBlock缓冲液。使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

e.将 1 mL 封闭的噬菌体转移到封闭的珠子上。总体积现在为 1.5 mL ，最终抗原浓度现在为 5 nM。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 15 分钟。

f.将微量离心管放在DynaMag TM -2 磁铁上。一旦珠子被拉到一边，丢弃上清液中未结合的噬菌体。将珠子重新悬浮在 500 μL 的 PBST 中，然后使用磁铁将珠子拉到一边，洗掉松散结合的噬菌体。用 PBST 重复此洗涤过程总共六次，然后用 PBS 重复一次。

g.将 500 µL 250 µg/mL 胰蛋白酶添加到珠子中。将封口膜包裹在微量离心管盖上，以避免任何意外溢出，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

h.DynaMag TM -2 磁铁沉淀珠子后，从第二个平底锅中收集上清液中洗脱的噬菌体。

注意：在安全柜内工作。

i.为了获得主板的单个菌落（步骤D7），使用对数期TG1细胞（步骤D6c）使用从10 -1到10 -12的十倍系列稀释液滴定洗脱的第二泛噬菌体（步骤D6h）。在 37 °C 孵育 15 分钟后，将 50 µL 10 -4至 10 -12稀释液涂在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1% 琼脂 LB 板上，直至干燥，并在 37 °C 下孵育过夜。包括仅 TG1 控件。参见一般注释 15 和故障排除 1 ．

j.选择具有大约 100-300 个单独菌落的稀释度。

7.主板的准备

注意：在安全柜内工作。

a.在 1 mL 深井块中，添加 180 µL/孔含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2× YT。使用93 × 10 µL吸头从 TG1 中滴定盘 2 噬菌体的选定板中挑选 93 个单独的克隆（步骤 D6j），并将其放入每个填充的孔中。使用多道移液器取出吸头。保留没有菌落的 F12、G12 和 H12 孔，作为我们的对照。

b.细胞培养粘合密封盖住板，并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。该过夜培养物将用于制备两个储备板：PCR 模板（步骤 D7c）和主板（步骤 D7d）。首先准备 PCR 板，然后准备主板。

c.将 20 µL/孔的过夜培养物转移至带裙边的 PCR 板。用 PCR 箔密封盖板并储存在-80°C。这是 PCR 模板板。

d.向剩余的过夜培养物中，添加 150 µL/孔的 50% 甘油，并通过移液混合。用 PCR 箔密封盖板并储存在-80°C。这是主盘。

8.抗 M13 噬菌体 ELISA

注意：在安全柜内工作。

a.在已填充 150 µL/孔 2× YT 的 1 mL 深孔板中，添加 10 µL/孔的母板（步骤 D7d）。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育 3 小时。

b.通过将 2 µL CM13K辅助噬菌体库存（步骤 D2h）添加到 10 mL 的 2× YT 中，制备CM13K辅助噬菌体混合物。添加 30 µL/孔准备好的CM13K辅助噬菌体混合物，并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育 1 小时。

c.将细胞在 18°C 下以 2,800× g沉淀10 分钟，并将每孔重新悬浮在含有 100 μg /mL 氨苄青霉素和 25 μg /mL 卡那霉素的 400 μL 2× YT 中。

d.细胞培养粘合密封盖住板，并在 25°C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。

e.g离心15 分钟后，将含有上清液的噬菌体转移到新的 0.5 mL 深孔板中，并用粘合膜覆盖。 4℃保存；这样就稳定了一个月了。这是用于抗-M13 ELISA（步骤D81）的培养物。

注意：在实验室工作台上工作。

f.96 孔 ELISA 微孔板中涂上100 µL/孔的 10 µg/mL neutrAvidin TM （用 PBS 稀释），并在 4 °C 下孵育过夜。

g.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

h.添加 100 µL/孔稀释于 PBS 中的50 nM生物素化靶蛋白，并在微孔板摇床上在 RT 下孵育 1 小时。参见一般说明 1 。

i.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

j.添加 250 µL/孔的封闭溶液，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

k.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

l.添加 50 µL/孔的封闭缓冲液，然后添加 50 µL/孔的抗 M13 ELISA 培养物（步骤 D8e）。在对照孔 F12、G12 和 H12 中，添加 50 µL/孔的封闭缓冲液和 50 µL/孔的 PBS。在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

m.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

n.添加 100 µL/孔的用 0.1% BSA-PBS 稀释的抗 M13-HRP （终浓度为 0.25 µg/mL），并在微板摇床上室温孵育 1 小时。

o.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

p.添加 100 µL ABTS 底物，该底物是通过按 1:1 比例混合溶液 A 和溶液 B 制备的。避光并测量 405nm 处的吸光度。参见一般说明 2 。

q.吸光度高于 1 的孔被视为命中。请参阅故障排除 2 和 3 。

9.ELISA 命中的 PCR 和测序

a.在 5 mL 管中制备以下 PCR 反应主混合物，并在 96 孔刚性 PCR 板中设置 96 个 PCR 反应（表 12）。参见一般注释 17 。用 PCR 箔密封盖住板。

表12. PCR 反应组成

试剂最终浓度单次反应体积主混合物体积

无核酸酶水不适用18.25微升1,825 µL

10 µM 博士序列正向底漆0.2微米0.5微升50微升

10 µM 博士seq Rev 引物0.2微米0.5微升50微升

10 × Taq 缓冲液1 ×2.5微升250微升

25 mM dNTP0.25毫米0.25微升50微升

Taq聚合酶1 单位0.5微升50微升

PCR 模板（步骤 D7c）2.5微升-

全部的不适用25微升2275微升

b.如下设置热循环仪并执行 PCR（表 13）。

表13. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性957分钟1

退火9515秒35

扩大5530秒

最终延期681分40秒

抓住685分钟1

变性12无限保持-

c.添加 45 µL Highprep PCR 磁珠/孔，并用移液器混合。置于DynaMag TM 96 侧磁铁上 1 分钟，或直至溶液澄清且珠子已被拉到 PCR 管壁上，并吸出上清液。

d.添加 100 µL 70% EtOH，并用移液器混合。置于DynaMag TM 96 侧磁铁上 1 分钟，或直至溶液澄清且珠子已被拉到 PCR 管壁上，并吸出上清液。重复此洗涤步骤总共三次。

e.将珠子在 RT 下干燥 10 分钟，然后将25 µL EB 缓冲液（来自QIAprep Spin Miniprep 试剂盒）添加到珠子中，并用移液器混合。置于DynaMag TM 96 侧磁铁上 1 分钟，或直至溶液澄清且珠子已被拉到 PCR 管壁上，然后将 20 µL 含有上清液的纯化 PCR 产物转移至新的 96 孔裙边 PCR 板。

f.如果纳米光度计可以一次测量多个样品（例如Implen TM NanoPhotometer ® N120）可用，测量每个孔的A 280 。如果有单个样品纳米光度计，请测量随机选择的克隆的A 280 。预计约为 15–25 ng/µL。或者，可以将随机选择的克隆的 5 µL 纯化 PCR 产物与 5 µL 2× DNA 凝胶上样缓冲液混合，并在含有 1× SYBR 的 1% 琼脂糖凝胶上沿着 1× GeneRuler 1 kb DNA 梯度泳道运行TM Safe DNA 凝胶染色剂。在 1× TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。对凝胶进行成像并确认是否存在扩增的 ~500 bp VHH 基因。

g.用 PCR 箔密封盖住板，并与博士序列一起发送进行测序前进底漆。参见一般注释 18 。

E.小规模表达和纯化

通过进行小规模表达来鉴定表达和纯化良好的纳米抗体克隆。纯化后添加脱盐步骤可以使用滴定 ELISA 或生物层干涉测量法 (BLI) 确认纳米抗体与抗原的结合。可以使用 BLI 确定纳米抗体的解离速率 ( k dis ) 以及初步表位分级。这些因素有助于选择哪些纳米抗体将用于大规模表达。

1.小规模表达

注意：在安全柜内工作。

a.在每孔已装有 180 µL 2× YT（每孔含有 100 µg/mL 氨苄青霉素）的 1 mL 深孔板中，根据主板的测序结果添加 10 µL 选定的克隆（步骤 D7d）。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。

b.2的极好的肉汤的 24 孔板中。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下孵育 4 小时，以 600 rpm 摇动。

c.细胞培养粘合密封盖住，并在 25 °C 下以 600 rpm 摇动孵育过夜。

注意：在实验室工作台上工作。

d.将细胞在 4,000× g 、4°C 下沉淀 15 分钟，然后将沉淀轻轻重悬于 300 µL 1 mg/mL 硫酸多粘菌素B 中。用粘合膜盖住板，并使用微孔板摇床在室温下搅拌 1 小时。

e.将细胞在 4°C 下以 4,000× g沉淀10 分钟，并将含有上清液的周质转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。

f.将 10 µL 分离的周质与 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95 °C 下孵育 5 分钟，并在1× MES 缓冲液中的NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM未染色标准品一起运行在 200 V 下持续 40 分钟。

g.使用InstantBlue®考马斯蛋白染色剂进行染色。预计显着条带约为 14 kDa 。参考Expasy的结果 Protparam （数据分析，步骤 1d）用于每个克隆的确切大小。

2.亲和纯化

注意：在实验室工作台上工作。

a.根据制造商的说明使用 Ni-NTA 旋转柱纯化组氨酸标记的纳米抗体。简而言之，将 600 μL 平衡缓冲液添加到 Ni-NTA 旋转柱中，并在 4°C 下以 800× g离心2 分钟。

b.将周质样品添加到 Ni-NTA 旋转柱中，并在 4°C 下以 200× g离心5 分钟。

c.添加 600 μL 平衡缓冲液并在 4°C 下以 2,900 rpm (800× g ) 离心 2 分钟，清洗 Ni-NTA 旋转柱 3 次。

d.将 Ni-NTA 旋转柱转移到新的 2 mL 微量离心管中，并添加 100 μL 洗脱缓冲液。在室温下孵育 2 分钟，然后在 4 °C 下以800× g离心2 分钟。流出物含有纯化的纳米抗体。

e.将 5 µL 纯化的纳米抗体与 5 µL 2× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后在1× MES 缓冲液中的NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM未染色标准品一起运行在 200 V 下持续 40 分钟。

f.使用InstantBlue®考马斯蛋白染色剂进行染色。预期条带约为 14 kDa 。参考Expasy的结果 Protparam （数据分析，步骤 1d）用于每个克隆的确切大小。

3.脱盐

注意：在实验室工作台上工作。

a.根据制造商的说明，使用Zeba TM旋转脱盐柱对 Ni-NTA 纯化的纳米抗体进行脱盐。简而言之，折断脱盐柱的底盖，松开顶盖，并将旋转柱放入新的 2 mL 微量离心管中。在 4 °C 下以 1,500× g离心1 分钟。

b.在脱盐柱树脂向上倾斜的一侧做一个标记。确保该标记在所有离心步骤中均朝外。

c.将 300 µL PBS（或选择的缓冲液）轻轻添加到树脂床上，然后在 4°C 下以 1,500× g离心 1 分钟，清洗树脂 3 次。

d.将脱盐柱转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并轻轻地将 100 μL 纯化的纳米抗体（步骤 E2d）添加到树脂床的中心。样品完全吸收后，轻轻地将 15 µL PBS（或选择的缓冲液）添加到树脂床的中心。在 4°C 下以 1,500× g离心2 分钟，并收集流出液中脱盐的纳米抗体。

e.脱盐纳米抗体的A 280并使用从Expasy获得的kDa和消光系数 (ε)确定摩尔浓度 (μM = A 280 / ε × 10 6 ) 以及浓度 (μg/mL = µM × kDa ) 单个纳米抗体的Protparam （数据分析，步骤 1d）。

4.滴定ELISA

如果没有 Octet R8（或类似仪器），滴定 ELISA 将足以确认纯化的纳米抗体与靶蛋白的结合。

注意：在实验室工作台上工作。

a.涂上适当数量的孔 96 孔 ELISA 微孔板，10 µL/孔，浓度为10 µg/mL neutrAvidin TM在 PBS 中稀释并在 4 °C 下孵育过夜。

b.使用洗板机，用 300 μL/孔的 PBST 清洗板五次。

c.添加 100 µL/孔用 PBS 稀释的 50 nM生物素化靶蛋白，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。参见一般说明 1 。

d.使用洗板机，用 300 μL/孔的 PBST 清洗板五次。

e.每孔添加 250 µL 封闭液，并在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

f.使用洗板机，用 300 µL/孔的 PBST 清洗板五次。

g.将在封闭溶液中稀释的 200 μL 25 μg/mL 脱盐纳米体（步骤 E3d）添加到第一个孔中。在板中准备连续稀释液，即向第二个孔中添加 100 µL 封闭溶液，并添加第一个孔中的 100 µL 溶液。总共制备七种稀释液 (25–0.39 µg/mL)，最后一个孔仅含有封闭液。在微孔板摇床上室温孵育 1 小时。

h.使用洗板机，用 300 μL/孔的 PBST 清洗板五次。

i.添加 100 µL/孔在 0.1% BSA-PBS 中稀释 1:5,000 的抗骆驼 VHH-HRP，并在微孔板摇床上在 RT 下孵育1小时。

j.使用洗板机，用 300 μL/孔的 PBST 清洗板五次。

k.每孔添加 100 µL ABTS 底物，该底物是通过以 1:1 的比例混合溶液 A 和溶液 B 制备的。避光并测量 405 nm 处的吸光度。参见一般说明 2 。

5.解离速率 ( k dis )

注意：在实验室工作台上工作。

a.在开始实验前，将 Octet R8 在 25 °C 下预热过夜或至少 3 小时。

b.抗原和纳米抗体的典型起始浓度分别为 50 nM和 100 nM ，在八位组稀释缓冲液中制备。参见总注 19 。

c.96 孔黑色聚丙烯板中准备所有稀释液。参见一般注释 20 。

d.在此阶段，每个纳米抗体一次重复就足够了。包括无纳米抗体对照，以排除与负载抗原的任何非特异性相互作用并作为背景。

e.使用SA生物传感器的实验运行条件如下：

所有孵育步骤均以 1,000 rpm 的速度振荡。

板定义：用于所有基线步骤/孔的八位组稀释缓冲液。

测定定义：基线 600 s 八位组稀释缓冲液。

：将 300 秒加载到用八位组稀释缓冲液稀释的抗原中。

：八位组稀释缓冲液中的基线 30 秒。

：八位组稀释缓冲液中的基线 60 秒。

：在八位组稀释缓冲液中稀释的脱盐纳米体中关联 300 秒（观察此步骤，时间可能需要延长，因为我们希望曲线达到稳定水平）。

：解离 300 秒进入测量基线 60 秒的列（此步骤应与关联步骤的持续时间相同）。

F.将纳米抗体亚克隆到细菌和哺乳动物载体中

我们开发了两种载体套件，用于细菌和哺乳动物表达系统中纳米抗体的功能化。它们的设计方式是，从按照 C 节详细说明构建的文库中鉴定出的任何纳米抗体都可以使用通用正向引物和标签特异性反向引物以及使用相同的限制性克隆到其中站点（图 8）。细菌和哺乳动物工具箱中每个载体的特征、功能化标签和引物详述于表 14。

图 8.细菌和哺乳动物工具箱中每个载体中存在的引物、限制性酶和标签的详细信息。使用的缩写：VHH，纳米抗体； BAP，生物素受体肽/Avi- Tag TM ； wt ，野生型； huIg1Fc，人类 Ig1 Fc。

表14.大肠杆菌和哺乳动物工具箱中载体的特征。引物内与载体互补的 bp 以斜体表示。

表达系统向量标签应用限制性内切酶正向引物 (5 ′ –3 ′ )反向引物（5 ′ –3 ′ ，反向互补）

大肠杆菌pOPINVHH_his他的晶体学NcoI和 Bsu36IGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGGTGATGGTGGCCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_flag_his他和FLAG表位检测

pOPINVHH_myc_his他和myc表位检测

pOPINVHH_BAP_hisAvi- tag TM和 His生物素化ATCATTCAAGCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_cys_his半胱氨酸和他的化学共轭ATGGTGACAGCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_sort_his分选酶酶标记CGGCAGGCCGCC TGAGGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINVHH_snap_hisSNAP-标签®酶标记GTCCTTGTCGCCTGA GGAGACGGTGACCTGGGTC

哺乳动物POINTTGneo-huIg1FchuIg1Fc 和 HisFc融合KpnI和 PmelGCGTAGCTGAAACCGGC CAGGTGCAGCTGGTGGAGCAGAACTTCCAGTTT AGGGGAGACGGTGACCTGGGTC

pOPINTTGneo

huIg1FcA

(Y407T)huIg1Fc 和 His双特异性纳米抗体生成

POINTTGneo huIg1FcB

(T334Y)huIg1Fc 和 His双特异性纳米抗体生成

pOPINE-eGFPGFP和他的荧光融合NcoI和 PmelAGGAGATATAACCATG CAGGTGCAGCTGGTGGAG

POPINE-eYFPYFP 和他的荧光融合

波品-mCherry米切尔和他的荧光融合

根据所需的应用，将选定的纳米抗体亚克隆到合适的表达载体中。下面我们以将命中的纳米抗体亚克隆到pOPINVHH_His载体为例进行详细说明。按照相同的过程将相同的纳米抗体亚克隆到哺乳动物载体中用于哺乳动物细胞表达。

1.pOPINVHH_His载体的限制性消化

注意：在实验室工作台上工作。

a.× 100 µL)中制备以下消化混合物（表 15）。

表 15. 限制性酶切反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用80.5 µL

10 × rCutSmart TM缓冲液1 ×10微升

镍钴2.5 单位2.5微升

Bsu36I2.5 单位2.5微升

400 ng/μL 载体 DNA18微克4.5微升

全部的不适用100微升

b.短暂涡旋并离心反应管。

c.37°C 孵育 1 小时，然后 80°C 孵育 20 分钟。

d.添加 4 ×体积的 B3 缓冲液 (400 µL) 并使用 1 × 根据制造商的说明使用Purelink PCR 纯化试剂盒中的Purelink柱。使用 50 µL E1 缓冲液进行洗脱。测量 A 280并预期浓度在 60 至 100 ng/μL 之间。

2.纳米抗体插入物的制备

注意：在安全柜内工作。

a.从主板（步骤 D7d）中，将 10 µL 选定的纳米抗体克隆添加到已装有 4 mL/孔含有100 µg/mL 氨苄青霉素的 2 × YT 的 24 孔板中，用细胞培养粘合密封盖住，并孵育37°C 过夜，600 rpm 摇动。

注意：在实验室工作台上工作。

b.根据制造商的方案，使用QIAprep旋转小量制备试剂盒，使用 2 mL 过夜培养物分离质粒。在最终体积为 50 µL 的 EB 中洗脱。测量 A 280并预期浓度在 100 至 500 ng/ µL 之间。

c.发送等份样品与博士序列一起进行测序前进底漆。如果它与通过PCR获得的序列匹配（步骤D9g），则继续下一步。参见一般注释 18 。

d.在 PCR 管 (1 × 25 µL) 中准备以下反应（表 16）。

表16. PCR 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用9微升

10 µM通用正向引物0.5微米1.25微升

10 µM His FLAG Rev 引物0.5微米1.25微升

2 × Phusion 快速 PCR 预混液1 ×12.5微升

10 ng/μL 载体模板（步骤 F2b）10纳克1微升

全部的不适用25微升

e.短暂涡旋并离心反应管。

f.如下设置热循环仪并执行 PCR（表 17）。

表17. PCR 循环条件

步温度（°C）期间循环次数

变性9810秒1

退火981秒30

扩大601秒

最终延期725秒

抓住721分钟1

变性12无限保持-

g.将 5 µL 6 × DNA 凝胶上样缓冲液添加到反应管中，并沿着 1 × GeneRuler 1 kb DNA 分子量标准在 1% 琼脂糖凝胶上，含有 1 × SYBR TM安全 DNA 凝胶染色剂。在 1 × TBE 缓冲液中，80 V 电泳 40 分钟。

h.使用 LED 蓝色透照仪可视化约 500 bp 扩增的纳米抗体带，使用手术刀从凝胶中切除，并根据制造商的方案使用Nucleospin凝胶和 PCR 清理套件中的一根旋转柱进行凝胶提取。使用 50 µL NE 进行洗脱，测量 A 280 ，预计浓度在 30至100 ng/µL 之间。

注意：在从琼脂糖凝胶中切除条带的过程中观察 DNA 时，请使用 Safe Imager TM观察眼镜，并在使用手术刀时要小心。

3.连接和转化

注意：在实验室工作台上工作。

a.在 PCR 管 (1 × 10 µL) 中准备以下反应（表 18）。

表18. In-Fusion 反应组成

试剂最终浓度体积

无核酸酶水不适用5微升

5 × CEII缓冲器1 ×2微升

4 ng/ µL 内插管（步骤 F2h）4纳克1微升

19.83 ng/μL 载体 DNA（步骤 F1d）19.83纳克1微升

外切酶II1微升

全部的不适用10微升

b.短暂涡旋并离心反应管。

c.使用热循环仪在 42°C 孵育 30 分钟。添加 40 μL TE 缓冲液以终止反应。

注意：在安全柜内工作。

d.将 5 µL 输注反应液与 25 µL Stellar TM感受态细胞在无菌 2 mL 微量离心管中轻轻混合。在冰上孵育 10 分钟。

e.42°C 热激 45 秒，冰上孵育 2 分钟。添加 200 μL LB 培养基，并在 37°C 下以 600 rpm 搅拌孵育 1 小时。

f.将 50 µL 培养物铺在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、2 mM IPTG 和 40 µg/mL X-gal 的 1% 琼脂 LB 板上直至干燥。 37°C 孵育过夜。预计会有很多白色菌落和很少甚至没有蓝色菌落。

g.将两个白色菌落从转化板转移到 24 孔板的两个孔中，该板已装有 4 mL/孔的含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 2 × YT。用细胞培养粘合密封盖住并在 37°C 下孵育过夜，以 600 rpm 摇动。

注意：在实验室工作台上工作。

h.根据制造商的方案，使用QIAprep旋转小量制备试剂盒，使用 2 mL 过夜培养物分离质粒。在最终体积为 50 µL 的 EB 中洗脱。测量 A 280并预计浓度在 100 和 500 纳克/微升。

i.发送等份样品与博士序列一起进行测序前进底漆。如果它与通过PCR获得的序列匹配（步骤D9g），则继续下一步。参见一般注释 18 。

j.大肠杆菌或 Expi293 TM进行大规模表达，如Le Bas 等人所述。 [12]或用于使用其他哺乳动物细胞系的成像实验（参见 G 部分），具体取决于所选的表达载体。

G.纳米抗体功能化及应用

大肠杆菌和哺乳动物工具箱中的精选载体，我们演示了如何将纳米抗体用作使用链霉亲和素和pOPINVHH_BAP载体进行下拉的试剂，如何使用pOPINVHH_Cys载体通过化学缀合以及用pOPINE转染进行成像-GFP 和pOPINE -YFP 用于体内和活细胞成像。

1.抗 GFP 纳米抗体生物素化的确认

将抗 GFP 纳米抗体克隆到pOPINVHH_BAP载体中，在 BL21(DE3)-R3-pRARE2-BirA 中大规模表达，以允许体内生物素化，并使用 Ni-NTA 和尺寸排阻色谱进行纯化，如第 F 节和第 F 节中详述。在勒巴斯等人。 [12]进行了一些修改。简而言之，LB 琼脂平板含有 34 µg/mL 氯霉素、50 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素，terrific 肉汤培养物补充有 50 µg/mL 壮观霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素，终浓度为 0.2 mM 生物素与 0.1 mM IPTG 一起添加。下面，我们详细介绍如何确认抗 GFP 纳米抗体已被生物素化。

注意：在实验室工作台上工作。

a.pOPINVHH_BAP或pOPINVHH_His中表达的抗 GFP和 1.5 µL 50 µg/mL链霉亲和素 Alexa Fluor TM 488 缀合物添加到 1.5 mL 微量离心管中，并用 PBS 将体积补至 10 µL。 37°C孵育30 分钟。

b.添加 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后在1× MES 缓冲液中的NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM未染色标准品和BenchMark TM荧光蛋白标准品一起在200 V 40 分钟

c.ChemiDoc TM成像系统（蓝色 Epi 激发，532/28 发射滤光片）上预设的ProQ emerald 488 图像采集对凝胶内荧光进行成像。使用InstantBlue®考马斯蛋白染色剂进行染色（图9）。

图 9.通过 SDS-PAGE 分析确认在pOPINVHH_BAP中表达以及与BirA共表达后纳米抗体生物素化。样品通过凝胶内荧光可视化并用InstantBlue ® (Coomassie)染色。并行运行以kDa为单位的蛋白质分子量标记。

2.生物素介导的下拉

从加标大肠杆菌裂解物中纯化 GFP 中的应用。

注意：在实验室工作台上工作。

a.用 1 mL PBS清洗 100 µL 链霉亲和素Dynabeads TM M-280 两次。

b.将 100 µL 在 PBS 中稀释的 10 µg 生物素化抗 GFP 纳米抗体添加到准备好的珠子中，并使用样品混合器在 RT 下孵育 30 分钟。

c.收集未结合的样品并用 1 mL 的 PBS 清洗珠子 3 次。

d.10 µg 纯 GFP添加到大肠杆菌裂解液中，并使用 PBS 将最终体积补充为 100 µL。将其添加到洗过的珠子中，并使用样品混合器在室温下孵育 30 分钟。

e.收集未结合的样品并用 1 mL 的 PBS 清洗珠子 3 次。

f.将 20 µL 2× Laemmli 样品缓冲液添加到珠子中。

g.向每个上样和未结合样品的 10 µL 中添加 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液。

h.将所有经 Laemmli 处理的样品在 95 °C 下孵育 5 分钟，并在1× MES 缓冲液中的NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与 Mark12 TM未染色标准品一起在 200 V 下运行 40 分钟。

i.用InstantBlue®考马斯蛋白染色剂染色（图 12A）。

3.荧光团结合

将抗波形蛋白 (VB3) 纳米抗体克隆到pOPINVHH_Cys载体中，在 WK 6大肠杆菌中大规模表达，并使用 Ni-NTA 和尺寸排阻色谱进行纯化，如 F 节中详述。下面，我们详细介绍如何制备荧光抗体标记VB3纳米抗体(VB3-AF647)及其体内应用成像。

注意：在实验室工作台上工作。

a.向 300 µg 纯化的 VB3 纳米抗体中添加 1 mM TCEP pH 8.0，使最终体积达到 100 µL，并使用样品混合器在 4°C 下孵育 20 分钟。

b.将 1 µL Alexa Fluor TM 647 C 2 -马来酰亚胺添加到 VB3 纳米抗体溶液中，并使用样品混合器在 4°C 下孵育 1 小时。

c.根据制造商的方案，使用Zeba TM染料和生物素去除旋转柱从荧光标记的 VB3 纳米抗体中去除任何未结合的 Alexa Fluor TM 647。该样品可在 4 °C 避光条件下保存两周，但可以快速冷冻并在 -80 °C 条件下长期保存。

d.将 10 µL VB3-AF647 与 10 µL 2× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后在1× MES 缓冲液中的NuPage 4%–12% bis tris 预制凝胶上与PageRuler TM一起运行 200 V预染色蛋白梯 40 分钟。

e.ChemiDoc TM成像系统（UV 激发、590/110 发射滤光片）上预设的Oriele图像采集对凝胶内荧光进行成像。使用InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂染色（图 10）。

f.使用 Nanodrop 在 750 nm 处进行基线校正，测量 VB3-AF647 从 200 至 800 nm 的吸光度。预计峰值位于 280 和 651 nm，分别对应于 VB3 纳米抗体和 Alexa Fluor TM 647（图 10）。

图 10. Alexa Fluor TM 647 与pOPINVHH_Cys中表达的VB3 纳米抗体 ( VB3-AF647)的缀合，通过凝胶内荧光（左）、 InstantBlue ®染色（中）和吸光度曲线（右）确定

4.体内可视化

注意：在安全柜内工作。

a.将单个盖玻片放入 6 孔培养板的孔中。每孔接种 1 mL 10,000 个 HeLa 细胞，并在补充有 10% FBS、1× GlutaMAX TM和 1× 青霉素-链霉素的无酚红 DMEM 培养基中于 37 °C 和 5% CO 2的 CO 2培养箱中培养。

注意：在实验室工作台上工作。

b.24 小时后，用 2 mL 的 PBS 洗涤细胞 3 次，并用 2 mL 的 4% 多聚甲醛在 RT 下固定 20 分钟。

c.用 2 mL 的 PBS 清洗细胞 3 次，并用 2 mL 的共聚焦封闭缓冲液在 RT 下封闭细胞 1 小时。

d.在封闭步骤中，准备荧光标记的 VB3 纳米抗体溶液，用于标记 HeLa 细胞中的波形蛋白。在 1.5 mL 微量离心管中，将 5 µL VB3-AF647（步骤 G3c）添加到 1 mL 共聚焦稀释缓冲液 PBS 中，并通过倒置轻轻混合。

e.摇杆在4℃下孵育2小时。

f.除去 VB3-AF647 溶液，并用 2 mL PBS 清洗细胞 3 次。

g.对于每个盖玻片，添加一小滴Fluoroshield 将带有 DAPI 的安装介质固定到显微镜载玻片上。使用杜蒙镊子，轻轻地从孔中取出盖玻片，并将细胞侧朝下放在封固剂上。通过轻轻地将盖玻片幻灯片向下压向显微镜幻灯片来去除多余的液体，并通过在盖玻片周边添加指甲油来固定盖玻片。

h.使用 Leica SP8 共焦显微镜在 63 倍物镜下使用 F 型浸没液对制备的载玻片上的染色细胞进行成像。使用 Ex405 和 Em430–550nm 进行 DAPI 检测，使用 Ex633 和 Em650 进行 Alexa Fluor TM 647 检测。

5.活细胞成像

VB3 纳米抗体被克隆到pOPINE-eGFP和-eYFP载体中，如 F 部分详述。产生的载体被称为 pOPINE-VB3-eGFP 和 pOPINE-VB3-eYFP。下面，我们详细介绍了如何使用 pOPINE-VB3-eGFP 和 pOPINE-VB3-eYFP 载体瞬时转染 HeLa 细胞，以进行波形蛋白丝的活细胞成像。

注意：在安全柜内工作。

a.GlutaMAX TM和 1× 青霉素-链霉素的无酚红 DMEM 培养基中培养，温度为 37 °C ，浓度为 5% CO 2培养箱中的CO 2 。

b.24 小时后，按如下方式制备转染混合物。在 500 μL 微量离心管中，添加 10 μL 无血清 DMEM 培养基，并轻轻混合 2 μL 100 ng/μL pOPINE-VB3-eGFP 和 pOPINE-VB3-eYFP 载体。添加 0.5 µL Fugene转染试剂，并在 RT 下孵育 10 分钟。

c.从 8 孔显微镜室盖玻片中的每个孔中取出旧介质，并添加 270 μL/孔的 DMEM 介质，辅以 10% FBS。通过轻轻按下移液器的柱塞，将每个 DNA -Fugene复合物逐滴添加到每个孔中，并在 CO 2培养箱中于 37°C 和 5% CO 2下孵育室盖玻片 48 小时。

d.使用 Leica SP8 共焦显微镜在 63 倍物镜和浸没液体下捕获活细胞成像。使用 Ex405 和 Em430–550nm 进行 DAPI 检测，使用 Ex488 和 Em518-558 进行 GFP 和 YFP 检测。

数据分析

1.测序数据分析（D9 节）

a.拖放 . seq文件导入IMGT/V-QUEST 。在网站上进行以下选择：物种：Vicugna Pacos（羊驼）；受体类型或位点：Ig；选择以 Excel 格式获取结果。提交。参见总注 21 。

b.生成的 Excel 文件中有多个选项卡。第五个选项卡（AA 序列）是我们将要处理的选项卡。按有效、无效和无结果对序列进行排序。

c.然后，对生产序列的 CDR3-IMGT 进行排序，以可视化 CDR3 簇。用不同颜色突出显示不同的 CDR3 簇有助于选择代表性克隆，这些克隆将用于小规模表达。

d.打开。在SnapGene中读取所选克隆的seq文件以获得氨基酸序列。复制单字母氨基酸序列并粘贴到Expasy-ProtParam 工具中。删除pelB序列 (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)，提交，并记下预期的kDa 、 pI和消光系数 (ε)，假设所有Cys残基都减少。

2.分析 BLI 数据以确定解离率（E5 部分）

a.在“预处理数据”选项卡中：将无抗体孔的背景减去所有其他测试的纳米抗体孔。将 Y 轴校正为基线步骤，将步骤间校正为解离步骤。应用Savitzky -Golay 过滤。

b.在动力学分析选项卡中：分析关联和解离步骤。使用 1:1 绑定模型。使用局部（单独）配件。拟合完整的关联和解离步骤并记下计算的解离率 ( k dis )。

协议验证

尼帕病毒G蛋白纳米抗体的鉴定

NivG )受体结合 G 蛋白的纳米抗体的鉴定证明了纳米抗体生成工作流程的改进。带有 N 末端六组氨酸标签的NivG蛋白的胞外区域（残基 183 – 602）在Expi293 TM细胞中表达，并通过固定化金属亲和层析 (IMAC) 和尺寸排阻相结合进行纯化（图 11A）。在生物素标记的NivG的血清转化 ELISA 中比较免疫前和免疫后血清，证实已对抗原产生了免疫应答（图 11B）。在对 VHH 文库 13 进行两轮淘选后，挑选出 93 个噬菌体克隆并在噬菌体 ELISA 中进行测试。通过 PCR 扩增噬菌体结合物的序列并进行测序，并根据 CDR3 序列同一性对翻译的 VHH 进行聚类。从三个主要簇中的每一个中选择一个代表性克隆，以小规模（4 mL 培养物）表达，并通过 IMAC 纯化（图 C）。通过滴定 ELISA 确认与NivG的结合（图 D）。通过 BLI 对结合解离率的分析证实，三个克隆（A8、B7 和 D5）与NivG结合（图 E），并优先用于大规模表达。

从免疫的美洲驼中产生NivG结合纳米抗体。 (A) 来自纯化NivG凝胶过滤的级分的 SDS-PAGE ，(B) 用NivG免疫后免疫前和免疫后血清的血清转化 ELISA ，(C)来自小规模表达的纯化抗NiVG纳米抗体的 SDS-PAGE (D) 通过滴定 ELISA 纯化的纳米抗体与NivG 183-602的结合，(E) 纳米抗体与NivG 183-602 结合和解离的 BLI 迹线；显示了三种纳米抗体的解离速率。

用于纯化和成像的纳米抗体的功能化

使用表 1 中所示的三种载体对纳米抗体进行功能化，并使用抗 GFP [9] 和抗波形蛋白 (VB3) [10]纳米抗体来举例说明它们的应用。抗 GFP 纳米抗体在pOPINVHH_BAP载体中表达，在体内生物素化，并用于使用磁耦合链霉亲和素珠从加标的大肠杆菌裂解物中下拉 GFP （图 12A）。使用pOPINVHH-cys载体在大肠杆菌中表达抗 VB3 纳米抗体，纯化并与AlexaFluor TM偶联第647章经由马来酰亚胺接头。 HeLa 细胞被固定，透化细胞和波形蛋白丝用抗 VB3 纳米抗体缀合物染色（图 12B）。通过分别克隆到pOPINE -YFP 和pOPINE -GFP 载体中，将相同的纳米抗体与 YFP 或 GFP 进行基因融合。用这些载体转染活 HeLa 细胞，并通过共聚焦显微镜成像以可视化波形蛋白丝（图 12C）。

图 12. 纳米抗体的功能化。 (A) 通过与链霉亲和素磁珠偶联的生物素化抗 GFP 纳米抗体对掺入大肠杆菌裂解液中的 GFP 进行下拉。使用 (B) 荧光标记的抗波形蛋白纳米抗体 (VB3-AF647) 和 (C) 瞬时转染 VB3-eGFP 和 VB3-eYFP 检测 HeLa 细胞中的波形蛋白。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.生物素化蛋白质的制备可以通过两种方式实现：化学缀合或通过体外生物素化蛋白质与 Avi-tag® 序列并与BirA共表达。

2.– 15 分钟内显色。如果信号较低，吸光度测量前的最长孵育时间为 1 小时。

3.× 10 mL 血管中接收 170 mL 美洲驼血液，不含抗凝剂，则添加等体积的 PBS 将得到总共 340 mL 的稀释血液。每支 50 mL 管需要 15 mL 稀释血液，并已添加 15 mL Histopaque ® -1007；因此，总共需要 22.6 个管子。因此，第 23 管的稀释血液将少于 15 mL。

4.以 45° 角握住 50 mL 锥形离心管，可以将稀释的血液轻轻添加到Histopaque ® -1007 上，以防止Histopaque ® -1007 层受到干扰。在将血液轻轻地铺在许多 50 mL 锥形离心管上的Histopaque ® -1007 顶部的过程中，当较重的红细胞落到管底部时，下层会变成红色。这是可以预料的。

5.将台盼蓝与 PMNC 过度混合可能会损坏 PMNC，导致活力值较低，可能无法真实代表实际活力。

6.使用RNaseZap TM ，则保留仅用于 RNA 工作的吸头盒和微量离心管袋就足够了。

7.RNA 应储存在 -20 °C 的乙醇中，这样可以长时间保持稳定。一旦重悬于水中，稳定性就会降低，因此，为了获得最佳结果，我们建议在 RNA 重悬于水中后立即进行 cDNA 合成（步骤 C3i）。

8.对于电穿孔，预计ms值大于 4.5。

9.请注意，小型库的估计库大小与大规模库的估计库大小略有不同。

10.× 10 6的文库需要多少微升的融合反应的示例：我们使用Purelink柱纯化 10 µL 融合反应，在 20 µL 核酸酶中洗脱 -免费水。我们使用 5 µL 进行电穿孔，这意味着将 2.5 µL 原始融合反应添加到 30 µL感受态 TG1 中。因此，如果 2.5 µL 融合文库在 1:100 稀释度下产生 373 CFU，则小规模文库大小将为 1.492 × 10 5 CFU/ mL。要创建 1 × 10 6 CFU/mL 文库，需要 6.7 × 2.5 µL 的融合反应，即略多于 1 × 10 µL 的融合反应。如果已准备好足够的 VHH2 和消化的 pADL23c 主链，我们通常会使用比所需更多的输注反应，即 10 × 10 µL，以确保我们有最佳机会生成 1 × 10 6 CFU/mL 文库。

11.如果按滴定度计算的文库大小与按板密度计算的文库大小之间存在较大差异，如果文库足够大，请使用板密度来指导您的决策。参见图 7。

12.准备起始培养物时，首先使用 200 µL TG1 库存。

13.在准备起始培养物时，首先使用 20 µL 分离的文库噬菌体和平底锅 1 子文库库存。

14.在某些情况下，培养物可能需要 2 小时以上才能达到 OD 600 0.5。继续培养直至达到所需的 OD 600 。只要步骤 D3k 或 D6i 中的 TG1 对照板为阴性，您就可以确信这可能只是文库和/或子文库中的差异。

15.仅限 TG1 的对照可显示所使用的 TG1 在该滴定步骤之前尚未被噬菌体感染。请参阅故障排除 1 。

16.步骤 C8h –我展示了库的多样性。扩增和回收的文库的滴定（步骤D3l）表明我们可以使用我们的多样化文库制造多少噬菌体颗粒。

17.根据实际 ELISA 阳性克隆的数量调整制备的 PCR 主混合物的体积。

18.DNA 和引物的体积和浓度可能是供应商特定的。检查当地测序公司的要求。

19.使用足够的抗原加载生物传感器，导致 1 nm 信号增加。

20.必须使用聚丙烯板，因为它们不结合蛋白质。

21.IMGT 站点一次只能处理 48 个序列。如果已对超过 48 个克隆进行测序，请将两个生成的 IMGT Excel 文件合并在一起，然后按 V-DOMAIN 功能和 CDR3-IMGT 进行排序。

故障排除

问题 1： TG1 对照板上的生长。

可能的原因：在添加我们分离/洗脱的噬菌体之前，表明大肠杆菌受到噬菌体污染。

解决方案：在 -80 °C 下从新鲜的 TG1 等分试样中制备新鲜的对数期 TG1。重复有问题的噬菌体的滴定。

问题 2： TG1 对照板上的生长。

可能的原因：氨苄青霉素库存已过期。

解决方案：使用新的氨苄青霉素等分试样，制备含有氨苄青霉素的新鲜 1% 琼脂 LB 平板。从“受污染”的 TG1 对照平板以及用于生长对数期 TG1 的甘油原液中取出一个菌落，并将其在新平板上划线。如果没有观察到生长，则表明氨苄青霉素原液是旧的，并且 TG1 在此之前没有被噬菌体感染。

问题3：抗M13 ELISA 板上仅发现单次命中。

可能的原因：几轮淘选后仅存在少量粘合剂。

解决方案：可以挑选另外 93 个菌落来制备第二个主板，以在抗 M13 ELISA 中进行测试。

问题 4：使用 5 nM目标蛋白进行第二轮淘选后，出现一个或极少数抗 M13 ELISA 命中。

可能的原因：可能没有浓缩。

解决方案：返回 50 nM噬菌体并使用 10 nM抗原进行平移。如果仍然没有命中，请尝试故障排除 3 。如果仍然没有命中，请考虑查看另一个库。使用血清转化 ELISA 数据来指导这一决定。

致谢

这项工作得到了罗莎琳德·富兰克林研究所的支持，资金交付合作伙伴英国工程和物理科学研究委员会 (EPSRC) 以及英国生物技术和生物科学研究委员会 (BBSRC) 为纳米抗体发现提供的赠款（参考号 BB/V018523/1））和威康技术开发信托基金（参考号223733/Z/21/Z）。使用BioRender创建的图形概述。

利益争夺

作者声明他们对所描述的工作没有竞争利益。

道德考虑

美洲驼的免疫接种和处理是在英国内政部项目许可证 PA1FB163A 的授权下进行的。

参考

1.Hamers- Casterman , C.、 Atarhouch , T.、 Muyldermans , S.、Robinson, G.、Hammers, C.、Songa, EB、 Bendahman , N. 和 Hammers, R. (1993)。天然存在的抗体不含轻链。自然363（6428）：446–448。

2.鲍国光、唐明、赵建和朱新 (2021)。纳米抗体：一个有前途的分子成像和疾病治疗工具包。 EJNMMI 研究中心。 11（1）：6。

3.穆德曼斯，S.（2020）。指南：纳米抗体的生成和设计。 FEBS J. 288(7): 2084–2102。

4.Parker, JL、Deme, JC、Wu, Z.、 Kuteyi , G.、Huo, J.、Owens, RJ、Biggin, PC、Lea, SM 和 Newstead, S. (2021)。 PepT2 的冷冻电镜结构揭示了哺乳动物中质子偶联肽和前药转运的结构基础。科学。副词。 7(35)：eabh3355。

5.Girt, GC、Lakshminarayanan, A.、Huo, J.、Dormon, J.、Norman, C.、 Afrough , B.、Harding, A.、James, W.、Owens, RJ、Naismith, JH 等人。（2021）。使用纳米抗体对 SARS-CoV-2 Spike 1 蛋白进行灵敏 ELISA 测试。 R.苏克。打开科学。 8（9）：e211016。

6.Huo, J.、 Mikolajek , H.、Le Bas, A.、Clark, JJ、Sharma, P.、 Kipar , A.、Dormon, J.、Norman, C.、 Weckener , M.、Clare, DK 等等人。（2021）。一种有效的 SARS-CoV-2 中和纳米抗体在 COVID-19 叙利亚金仓鼠模型中显示出治疗效果。纳特。交流。 12（1）：5469。

7.Akkermans, O.、 Delloye -Bourgeois, C.、Peregrina, C.、Carrasquero-Ordaz, M.、 Kokolaki , M.、 Berbeira -Santana, M.、 Chavent , M.、Reynaud, F.、Raj, R. ，阿吉尔，J.，等人。（2022）。 GPC3-Unc5 受体复合物结构及其在细胞迁移中的作用。单元格185(21)：3931–3949.e26。

8.Pardon, E.、 Laeremans , T.、Triest, S.、Rasmussen, SGF、 Wohlkönig , A.、Ruf, A.、 Muyldermans , S.、Hol, WGJ、Kobilka, BK、Steyaert, J. 等。（2014）。结构生物学纳米抗体生成的通用方案。纳特。协议。 9（3）：674-693。

9.Kirchhofer, A.、Helma, J.、 Schmidthals , K.、Frauer, C.、Cui, S.、Karcher, A.、Pellis, M.、 Muyldermans , S.、Casas-Delucchi, CS、Cardoso, MC,等人。（2010）。使用纳米抗体调节活细胞中的蛋白质特性。纳特。结构。摩尔。生物。 17（1）：133-138。

10.Maier, J.、 Traenkle , B. 和 Rothbauer, U. (2015)。使用荧光单域抗体实时分析上皮间质转化。科学。报告5(1)：13402。

11.Tonikian , R.、Zhang, Y.、Boone, C. 和 Sidhu, SS (2007)。从噬菌体展示的肽库中识别肽识别模块的特异性概况。纳特。协议。 2（6）：1368-1386。

12.Le Bas, A.、 Mikolajek , H.、Huo, J.、Norman, C.、Dormon, J.、Naismith, J. 和 Owens, R. (2022)。与 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域复合的纳米抗体的生产和结晶。生物协议。 12(9)：e4406。

从骆驼到纳米抗体：用于生成功能化 VHH 的简化工作流程

Lauren EA Eyssen 1, *, Siva Ramadurai 1 , Sahar Abdelkarim 1, $ a , Imogen Buckle 1 , Katy Cornish 1, $b , Hong Lin 2 , AK Jones 3 , Gary J. Stephens 2和 Raymond J. Owens 1, 4 , *

1结构生物学，罗莎琳德·富兰克林研究所，迪德科特，OX11 0QX，英国

2雷丁大学药学院，雷丁，RG6 6UB，英国

3 雷丁大学乳品研究中心，雷丁，RG2 9HY，英国

4牛津大学纳菲尔德医学系结构生物学部，牛津，OX3 7BN，英国

$牛津大学生物化学系，牛津，OX1 3QU，英国

$ b约克大学化学系，约克，YO10 5DD，英国

*对于信件：劳伦.eyssen@rfi.ac.uk ； ray.owens@strubi.ox.ac.uk

抽象的

主要特征

•标准化构建纳米抗体库和寻找纳米抗体结合剂的过程，以便可以在任何具有合理设备的实验室中重复进行。

•引入两套载体来功能化纳米抗体，以便在细菌或哺乳动物细胞中生产。

关键词：骆驼重链抗体，纳米抗体，噬菌体展示，纳米抗体标记

图形概览

背景

大约三十年前，布鲁塞尔自由大学的研究人员偶然发现了骆驼科动物产生独特的重链抗体这一事实 [1]。比利时小组的开创性工作表明，这些抗体的可变重链结构域（称为 VHH）可以作为单结构域结合蛋白（称为纳米抗体）产生。随后，纳米抗体被产生用于细胞和结构生物学中的多种抗原应用，包括作为高价值膜和非结构蛋白的结晶伴侣以及作为超分辨率显微镜的探针[2]。通常，纳米抗体是通过筛选噬菌体展示文库产生的，其中的 VHH 结构域是从带有目标免疫原的免疫美洲驼和羊驼的外周血细胞中克隆出来的 [3]。自 2019 年以来，我们的团队已经生成了针对 75 种不同抗原的纳米抗体。抗原多种多样，包括复合物、膜和可溶性蛋白质。我们发现的一些纳米抗体已被用作 SARS-CoV-2 [6] 的结构伴侣 [4]、诊断剂 [5] 和抗病毒治疗剂，以及体外和体内细胞生物学 [7]。尽管之前已经发表了几种生产纳米抗体的方案[8]，但我们已经确定了简化该过程的领域，例如，纳入不依赖于连接的克隆以促进VHH结构域文库的构建和小规模表达筛选以鉴定高产克隆。

此外，通过使用通用 VHH 克隆引物，我们设计了一套表达载体，能够使用各种羧基末端标签（例如 Flag、Avi-tag ® 或SNAP -tag ®）对后续位点的任何克隆 VHH 进行功能化-特定标签。总的来说，我们的目标是让任何拥有适当装备的实验室的研究小组都能轻松使用这项技术。