材料与试剂

原代人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）（Cell Systems，目录号：ACBRI 181）。在内皮生长培养基-2（EGM-2）[EGM ^TM -2内皮细胞生长培养基-2 BulletKit ^TM（Lonza，目录号：CC-3162）]中生长HRMEC。BulletKit ^TM包含HRMEC 生长所需的EBM-2 基础培养基（目录号：CC-3156）和SingleQuots 生长因子补充剂（目录号：CC-4176）。BulletKit ^TM还包含一小瓶抗生素（庆大霉素）和胎牛血清（FBS）。将 EBM-2 储存在 4 °C 下，将 SingleQuots 和 FBS 储存在 -20 °C 下。^{按照 BulletKit TM}中提供的制造商说明准备 EGM-2 介质。将 FBS 添加到培养基中，终浓度为 2%（参见配方）。含 2% FBS 的 EGM-2 培养基以下简称 EGM-2 完全培养基
RPMI-1640 介质（ATCC，目录号 30-2001）
胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA）（ATCC，目录号：30-2101）。-20℃长期保存；但是，请等分胰蛋白酶-EDTA 并保存在 4 °C 下以便立即使用
不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Corning，Fisher，目录号：21-031-CM）。储存于 4°C
无水乙醇（200 度）（Pharmaco，Greenfield Global，目录号：111000200）。用蒸馏水稀释乙醇，得到70%乙醇溶液，用于擦拭层流罩
PR-Matrigel 膜基质（Fisher，目录号：CB-40234）。将基质胶分装在康宁无菌冷冻瓶中，并储存在-70°C下以便长期储存。实验前，将基质胶等分试样在 4°C（冰箱中）过夜解冻。在测定过程中，基质胶应在整个实验过程中保持在冰上
无 PR-Matrigel 膜基质（Fisher，目录号：CB-40234C）
PP2（Enzo Biosciences，目录号：50-201-0681）。PP2 是 Src 家族酪氨酸激酶的有效选择性抑制剂。将 PP2 储存在 -20 °C 下并溶解在 DMSO（Fisher，目录号：MT-25950CQC）中，得到浓度为 10 mM 的储备溶液（参见配方）。将 PP2 库存溶液等分到微量离心管中并储存在-20°C。使用前，将 EBM-2 基础培养基（不含 FBS 或生长因子）中的 PP2 解冻并稀释至 10 µM 的工作浓度。使用后，丢弃剩余的 10 µM PP2 溶液

组织培养塑料器具及相关用品

康宁细胞计数室（Fisher，目录号：07-200-988）
Nunc Lab-Tek 8 孔 Permanox 塑料室玻片系统（Fisher，目录号：12-565-22）
Corning BioCoat 胶原涂层 T-25（Fisher，目录号：08-774-327）和 T-75（Fisher，目录号：08-774-327）组织培养瓶。BioCoat 烧瓶储存于 4 °C
Corning 无菌低温瓶（Fisher，目录号：13-700-504）
无菌聚丙烯离心管，50 mL（Fisher，目录号：06-443-20）
无菌聚丙烯离心管，15 mL（Fisher，目录号：05-539-5）
用于储存 70% 乙醇的安全通风洗瓶（1,000 mL）（Fisher，目录号：11-865-170）
微量离心管，1.5 mL（Fisher，目录号：05-408-129）。将微量离心管用于 MDA 之前对其进行高压灭菌
无菌 5 mL 微量离心管（Eppendorf，目录号：0030119487）
无菌塑料血清移液器（独立包装、纸剥离包装、带塞）：

25 mL 移液器（Fisher，目录号：12-567-604）

10 mL 移液器（Fisher，目录号：12-567-603）

5 mL 移液器（Fisher，目录号：12-567-602）

2 mL 移液器（Fisher，目录号：12-567-601）

1 mL 移液器（Fisher，目录号：12-567-600）
Fisherbrand 5 3/4 英寸一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液器（Fisher，目录号：13-678-20B）。将巴斯德移液器用于 MDA 之前对其进行高压灭菌
Fisherbrand 无菌高精度 #22 型手术刀片（Fisher，目录号：12-000-161）
Drummond ^TM便携式 Pipet-Aid ^TM XP 移液器控制器（Fisher，目录号：13-681-15E）
PIPETMAN ^® 4 移液器套件 P2、P20、P200、P1000（Gilson，目录号：F167360）
Fisherbrand SureOne 无菌气溶胶屏障吸头（100–1,000 µL）（Fisher，目录号：02-707-404）
Fisherbrand SureOne 无菌气溶胶屏障吸头（20–200 µL）（Fisher，目录号：02-707-430）
Fisherbrand SureOne 无菌气溶胶屏障吸头（0.1–20 µL）（Fisher，目录号：02-707-470）

其他实验室耗材

Labcoat（Fisher，目录号：19-181-596）
Ansell MICROFLEX ^TM NeoPro ^TM NEC-288 氯丁橡胶小尺寸（Fisher，目录号：19-350-340F）

和中型手套（Fisher，目录号：19-350-340A）
用于长期储存基质胶和 PP2 的冷冻盒（Cole-Parmer Essentials 81-Place 冷冻盒，目录号：UX-04396-63）
Kimtech Kimwipe 精细任务雨刷（Fisher，目录号：06-666A）
无菌无纺纱布海绵 4 × 4 英寸（Fisher，目录号：22-028-558）
海曼式微铲（Fisher，目录号：21-401-25A）

解决方案

EGM-2 完全培养基（参见配方）
EGM-2 培养基（含有生长因子）（参见食谱）
10 mM PP2（参见配方）
200 µM PP2（参见配方）
VEH-20X（参见配方）

食谱

EGM-2完全培养基

EGM ^TM -2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit ^TM含有以下成分：

1× EBM-2 基础培养基 (CC-3156), 500 mL

1× EGM-2 SingleQuots 补充包 (CC-4176) 包含：

1× 装有 VEGF 的白盖小瓶，0.50 mL
1× 灰色盖小瓶，装有 hFGF-B，2 mL
1× 黄色盖小瓶，装有 R3-IGF-1，0.50 mL
1× 绿盖小瓶，含 hEGF，0.50 mL
1× 橙色盖小瓶，装有肝素，0.50 mL
1× 蓝色盖小瓶，装有抗坏血酸，0.50 mL
1× 红盖小瓶，装有 GA-1000，0.50 mL
1× 天然盖小瓶，含氢化可的松，0.20 mL

1× 瓶胎牛血清，10 mL

请按下表准备所需体积的EGM-2完全培养基：

EGM-2 完整培养基 (mL)	血管内皮生长因子（微升）	FGF（微升）	IGF-1（微升）	表皮生长因子（微升）	肝素 (μL)	抗坏血酸 (μL)	庆大霉素 (GA-1000) (μL)	氢化可的松 (μL)	胎牛血清（毫升）
50	50	200	50	50	50	50	50	20	1
100	100	400	100	100	100	100	100	40	2
250	250	1,000	250	250	250	250	250	100	5
400	400	1,600	400	400	400	400	400	160	8
500	500	2,000	500	500	500	500	500	200	10

EGM-2 培养基（含生长因子）

我们通常在瓶子中制作EGM-2培养基（含有生长因子），然后将FBS直接添加到T-75烧瓶中。这是因为我们经常在无血清条件下进行实验，所以我们在细胞培养时根据需要单独添加FBS。

10 毫米 PP2

PP2的分子量=301.78

在无菌微量离心管中称取 6 mg PP2。在层流罩中，将 PP2 溶解在 2 mL 的 DMSO 中。短暂涡旋以获得 10 mM PP2 库存溶液。将此 PP2 库存溶液（50 µL 等份）等分到微量离心管中，并储存在 -20 °C 下。

200 µM PP2

在水浴（保持在 37°C）中解冻一等分的 PP2（浓度 = 10 mM）。在 100 μL 基础 EBM-2 介质中添加 2 μL PP2。剧烈涡旋。现在 PP2 的浓度为 200 µM（文中称为 PP2-20X）。按照 D 部分步骤 8 中的说明使用该 PP2 溶液。丢弃剩余的 PP2-20X 溶液。

VEH-20X

在 100 μL 基础 EBM-2 介质中添加 2 μL DMSO。剧烈涡旋，得到VEH-20X溶液（该溶液中DMSO浓度为2% v/v），简称VEH-20X。按照 D 部分步骤 10 中的说明使用 VEH-20X 溶液。丢弃剩余的 VEH-20X 溶液。

设备

NU-540（LabGard ^® ES NU-540 II 级，A2 型）层流生物安全柜（NuAire，普利茅斯，明尼苏达州，目录号：NU-540）
细胞培养箱（Heracell VIOS 150i 细胞培养箱）（Thermo Scientific，Waltham，MA，目录号：51-032-872）
带摄像头的 Leica DM IL LED 倒置相差显微镜（VWR International，目录号：76382-982）
Fisher Isotemp 220A 水浴（Fisher，目录号：FSGPD05）
Thermo Electron Corporation IEC Centra CL2 台式离心机（Thermo Scientific，目录号：004260F）
微量天平（Sartorius，型号 1712 MP8，银色版，目录号：CUBIS_II_ANALYTICAL）
涡旋混合器（Fisher，目录号：02-215-414）

软件

LAS 图像捕获软件（徕卡显微系统）
Adobe Photoshop 2023（适用于 Windows 的 Adobe Creative Cloud）
Adobe Illustrator 2023（适用于 Windows 的 Adobe Creative Cloud）
NIH ImageJ 版本 1.47（美国国立卫生研究院，贝塞斯达）
GraphPad Prism 版本 9

程序

培养 HRMEC：从冷冻瓶中解冻 HRMEC
1. 从 Cell Systems 订购冷冻保存的 HRMEC。这些 HRMEC 是从正常、健康的供体组织中分离出来的，并在第 3 代（<12 累积群体倍增）时提供。每个小瓶均提供分析证书，其中包含约 1 × 10 ^{6 个}细胞。从供应商处获得冻存细胞后，应立即将其储存在液氮中。我们通常通过将一瓶冷冻细胞瓶添加到一个 BioCoat T-25 和一个 T-75 烧瓶中来解冻 HRMEC。所有步骤均在无菌条件下在层流罩中完成。
2. BioCoat 胶原蛋白包被的 T-25 和 T-75 组织培养瓶的再水化：
  
  BioCoat 烧瓶储存在 4 °C 下。取出装有烧瓶的包装，让其在使用前恢复至室温。在 37°C 水浴中加热一些基于碳酸氢盐的无血清培养基（例如 RPMI-1640）。将 5 mL 温热的基于碳酸氢盐的无血清培养基（例如 RPMI）添加到 T-25 烧瓶中。同样，将 15 mL 温热的无血清培养基添加到 T-75 烧瓶中。我们通常使用温热的 RPMI-1640 来给烧瓶补水。让烧瓶在保持在 37°C、5% CO ₂的湿润组织培养箱中再水化 2 小时。2 小时后，从烧瓶中吸出介质，注意不要破坏胶原蛋白涂层。
3. 将 10 mL 的 EGM-2 完整介质添加到再水化的 T-25 烧瓶中。同样，将 20 mL 的 EGM-2 完全介质添加到再水化的 T-75 烧瓶中。重要提示：冷冻保存的细胞非常脆弱。HRMEC 通常冷冻保存在补充有 5% DMSO 的完整 EGM-2 培养基中。在 37°C 水浴中解冻小瓶，轻轻旋转小瓶直至内容物完全解冻。每个小瓶含有大约 1 × 10 ⁶个第 3 代细胞（<12 累积群体倍增）。
4. 小瓶解冻后，立即将小瓶从水浴中取出，擦干，并用 70% 乙醇冲洗。随后，将小瓶转移到层流罩内。取下盖子，小心不要用戴手套的手指触摸内螺纹。
5. ^{使用 1 mL 无菌血清移液器，以建议的接种密度 6,000 个细胞/cm 2}轻轻地将小瓶中的内容物分配到含有 EGM-2 完全培养基（图 1）的再水合 BioCoat T-25 和 T-75 烧瓶中。用 1 mL EGM-2 完全培养基冲洗冷冻瓶，并将其添加到组织培养瓶中。重要提示：请勿从冷冻瓶中离心细胞。冷冻保存细胞中的 DMSO 将在烧瓶中的 EGM-2 完全培养基中稀释。因此，DMSO不会对细胞造成伤害。
  
  图 1. 示意图表示从冷冻保存的细胞中建立人视网膜微血管内皮细胞 (HRMEC) 培养物。烧瓶应平放在细胞培养箱中（水平）。
6. _{将组织培养瓶返回到保持在 37°C、5% CO 2}的湿润组织培养箱中。培养开始后至少 24 小时内请勿干扰培养。24小时后，吸出并丢弃烧瓶中的培养基，并添加新鲜的EGM-2完全培养基以去除任何残留的DMSO和未附着的细胞。健康的培养物将呈现鹅卵石形态和非颗粒状细胞质 [9, 10]。

培养 HRMEC：HRMEC 培养物的维护和传代培养
1. 将 HRMEC 培养至约 70%–80% 汇合。介质应每三天补充一次。
2. 再水化所需数量的 BioCoat T-75 烧瓶（参见 A 部分，步骤 2）。
3. 用 DPBS 冲洗细胞。对于 T-25，使用 5 mL 的 DPBS；对于 T-75 烧瓶，使用 10 mL 的 DPBS。
4. 将 3 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液添加到 T-75 烧瓶中（如果是 T-25 烧瓶，则使用 2 mL）。
5. 轻轻摇动烧瓶，确保细胞被胰蛋白酶/EDTA 溶液覆盖。将烧瓶在 37°C 培养箱中孵育 1-2 分钟或直至细胞完全变圆（用倒置显微镜监测）。如有必要，轻轻拍打烧瓶侧面，使细胞完全分离。
6. 将 2 mL 的 FBS 添加到 T-75 烧瓶（T-25 烧瓶使用 1 mL）以中和胰蛋白酶-EDTA。使用 5 mL 血清移液器，轻轻彻底冲洗烧瓶并将细胞转移到 15 mL 离心管中。
7. 用 10 mL DPBS 冲洗烧瓶的生长表面，以收集剩余的分离细胞，并在步骤 B6 中的同一 15 mL 离心管中合并。关闭并在倒置显微镜下检查烧瓶，以验证细胞收获是否完成。烧瓶中剩余的细胞（烧瓶初始密度）应少于 5%。
8. 使用台式离心机在室温下将收获的细胞悬液以 800× g离心 5 分钟。从沉淀中除去（吸出）FBS/DPBS 液体。轻轻弹动试管，使细胞脱落，并将其重新悬浮在 1 mL 的 EGM-2 完全培养基中。
9. 使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后按照 A 部分步骤 5-6 中的建议将所需体积的细胞悬浮液分配到水合 T-75 烧瓶中。_{将烧瓶放回保持在 37°C 和 5% CO 2}的细胞培养箱中。

使用基质胶
1. 将基质胶等分在冰冷的无菌康宁冷冻瓶中并储存在-70°C。
2. 在开始 MDA 之前，应将所需量的基质胶在 4°C 下解冻过夜。实验过程中基质胶始终保持在冰上。
3. Matrigel在4°C时为液体，在37°C时聚合成凝胶状固体。我们建议在处理基质胶时，塑料器皿和试剂应保持冰冷。
4. 解冻的基质胶是一种粘稠的液体。应修剪移液器吸头的尖端（以增加吸头的直径），以便将基质胶运入/运出冷冻瓶。在处理基质胶时，所有微量离心管和移液器吸头应保持冰冷，以避免聚合。在我们的实验室中，我们使用冰冷的无血清 RPMI-1640 作为冷却介质。将所有移液器吸头浸入冰冷的介质中以使其冷却，然后再使用它们处理基质胶。

基质胶双重检测

第一天

该测定在 8 孔室载玻片中进行。在开始实验之前，绘制测定方案（图2）。腔室载玻片右侧的区域（带有方格图案）用于提升和运输载玻片。

图 2. Matrigel Duplex 检测的示意图

所有实验均在第 3-7 代之间使用 HRMEC 进行。整个实验在无菌条件下在层流罩中进行。
将 HRMEC 细胞培养至大约 70%–80% 汇合（在水合胶原蛋白包被的 BioCoat T-75 烧瓶中（请参阅 A 部分，关于烧瓶补水说明的步骤 2），在 37 ℃ 的湿润环境中，在完整的 EGM-2 培养基中°C（含 5% CO ₂）细胞培养箱中。
用 DPBS 清洗 HRMEC 一次，并使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 对烧瓶进行胰蛋白酶消化。
添加 2 mL 的 FBS 以中和胰蛋白酶，并将细胞悬浮液转移至 15 mL 管中。用 DPBS 冲洗烧瓶并将溶液转移至 15 mL 管中。
在台式离心机中室温下以800× g轻轻旋转细胞5 分钟。吸出介质并在含有 4% FBS 的 EGM-2 中重新悬浮 HRMEC。
使用康宁细胞计数室对细胞进行计数。在无菌 5 mL 微量离心管中将细胞浓度调整至 1.6 × 10 ^{7 个细胞/mL（使用含有 4% FBS 的 EGM-2 介质）。}该管标记为TUBE A。
应将 PP2 (10 mM) 储备液在无菌微量离心管中的基础 EBM-2 培养基中稀释至 200 µM 浓度（参见配方）。PP2 以 20× 工作浓度制备并标记为 PP2-20X。PP2-20X 是用于建立 MDA 的 PP2 浓度。用于 MDA 的 PP2 的最终浓度为 10 µM。
在单独的 1.5 mL 微量离心管中，将细胞（来自管 A）与 PP2-20X 以 10:1 (v/v) 的比例混合。这会将 PP2-20X 稀释至 20 µM 浓度。例如，您可以将 45 µL 细胞悬浮液（来自TUBE A）添加到 5 µL PP2-20X 中。轻轻弹动试管，使药物与细胞悬液充分混合。不要涡旋，因为这会剪切（并裂解）细胞。因此，PP2 的新浓度为 20 µM。该管标记为TUBE B。
PP2-20X 的载体是 2% DMSO（以下称为 VEH-20X，参见配方）。就像上一步一样，将细胞（来自TUBE A）与 VEH-20X 以 10:1 (v/v) 的比例混合。不要涡旋，因为这会剪切（并裂解）细胞。因此，载体的新浓度现在为 0.2% DMSO。该管标记为TUBE B-VEH。
将一些空的 1.5 mL 微量离心管放在冰上以冷却它们。将细胞与基质胶以 1:1 的比例混合在冰冷的微量离心管中。例如，将 20 µL 基质胶与 20 µL 细胞悬浮液（取自TUBE B）混合。通过轻弹管子将细胞与基质胶混合。轻弹时不要让管升温，也不要在基质胶细胞悬浮液中产生气泡。管中的最终 PP2 浓度现在为 10 µM。该管标记为TUBE C。
同样，将 20 µL HRMEC（用 0.2% DMSO 处理）与 20 µL Matrigel 在单独的微量离心管中混合。管中载体的最终浓度现在为 0.1% DMSO。该管标记为TUBE C-VEH。

表 1 详细描述了管 A、B 和 C。

表 1. Matrigel Duplex 测定中管 A、B 和 C 的描述

管名称	车辆组成	管内容物
A		^{HRMEC 以 1.6 × 10 7 个}细胞/mL的浓度重悬于补充有 4% FBS 的 EGM-2 培养基中。
乙		45 µL HRMEC 悬浮液（浓度为 1.6 × 10 ^{7 个}细胞/ml，取自管 A）与 5 µL 200 µM PP2（文中称为 PP2-20X）混合。PP2 的最终浓度现在为 20 µM。轻轻弹动试管，使药物与细胞悬液充分混合。
B-VEH	PP2-20X 的载体是 2% DMSO（文中称为 VEH-20X）	45 µL HRMEC 悬浮液（浓度为 1.6 × 10 ^{7 个}细胞/mL，取自管 A）并与 5 µL 2% DMSO（这是 PP2-20× 的载体，也称为 VEH-20%）混合文本）。
C		20 µL 基质胶与 20 µL 细胞悬浮液（用 PP2 处理并取自TUBE B）的混合物。通过轻弹管子将细胞与基质胶混合。
VEH		TUBE C-VEH含有 20 µL 基质胶和 20 µL 细胞悬浮液（用媒介物处理并取自TUBE B-VEH）的混合物。通过轻弹管子将细胞与基质胶混合。

从包装中取出腔室玻片。将室幻灯片放在层流罩内的一张薄纸上的盘子中。使用 Kimwipe 或无菌纱布垫防止室载玻片粘在引擎盖表面，因为这可能会导致在转移到培养箱期间破坏主要基质胶层。

从TUBE C中取出 6 µL 细胞悬浮液，并将其作为一滴放在室载玻片的中心。每个样品均进行两次测定。TUBE C-VEH遵循类似的过程。_{然后将室载玻片在具有 5% CO 2}的加湿细胞培养箱中于 37°C 孵育 1 小时。下面是腔室载玻片的示意图，其中液滴位于孔的中间（图 3）。我们还提供了室载玻片的照片，其中液滴位于孔的中间（图 4）。

图 3. 液滴位于孔中部的室载玻片示意图

注意：水滴不需要正好位于载玻片的几何中心。要记住的重要事实是它应该足够居中，以便细胞可以径向侵入第二层。即使液滴（主层）稍微偏离中心，对于检测来说也是可以的。

图 4. 腔室载玻片的照片，其中主层位于载玻片中间

1 小时后，向每个孔中添加 250 μL EGM-2 完整介质。将室幻灯片在细胞培养箱中于 37°C（含 5% CO _{2 ）下放置 24 小时。}
将一小瓶不含 PR 的基质胶在 4°C 下解冻过夜。如果按照上面示意图（图 5）所示设置测定，则实验将需要 1 mL 无 PR 基质胶。

图5.室载玻片侧视图示意图。(A) 室载玻片的组件已贴上标签。(B) 在室载玻片中心添加初级层（含 PR 的基质胶和 HRMEC）的过程。(C) 使液滴在细胞培养箱中在 37°C（5% CO _{2 ）下聚合 1 小时。}(D) 1 小时后，将 250 µL EGM-2 完整介质添加到每个孔中。

第二天

24小时后，用等体积补充有4％FBS的EGM-2稀释无PR基质胶。将此溶液置于冰上。
在相差显微镜下观察腔室载玻片，以确认初级基质胶层（液滴）内是否存在视网膜内皮细胞管状结构网络。
从室幻灯片中吸出介质。使用移液器轻轻地从细胞中取出介质，而不会干扰室载玻片中心的液滴。
轻轻地将 200 µL 无酚红基质胶的 1:1 溶液（在补充有 4% FBS 的 EGM-2 中稀释）覆盖在液滴上。图6表示室载玻片的示意图。粉色液滴代表基质胶的主层，浅灰色区域（粉色液滴周围）代表由不含酚红的基质胶组成的次层。图 7 提供了室载玻片的侧视图。室载玻片在细胞培养箱中于 37°C 下孵育 1 小时（5% CO _{2 ）。}1 小时后，向每个孔中添加 250 μL EGM-2 完整介质。将室幻灯片在细胞培养箱中于 37°C 放置 24 小时。

图 6. 具有初级层和次级层的室载玻片示意图

图 7. 孔中具有初级层和次级层的室载玻片侧视图示意图。(A) 室载玻片的侧视图，其中主层（中心的液滴）覆盖有 EGM-2 介质（浅红色）。(B) 小心地吸出介质。(C) 第二层包含 EGM-2 培养基（含 4% FBS）和不含 PR 的基质胶的 1:1 溶液，覆盖在第一层上。(D) 第二层（以灰色表示）允许在细胞培养箱中在 37°C 下聚合 1 小时。(E) 随后，将 EGM-2 培养基（以浅红色表示）添加到孔中，并将载玻片在细胞培养箱中于 37°C 下孵育 24 小时（5% CO _{2 ）。}

第三天

24 小时后，在相差显微镜下观察室载玻片。应清楚地看到血管生成管状结构（来自初级基质胶层中的 HRMEC）径向侵入次级基质胶层。为每个样品拍摄三个独立的视野（放大 10 倍）以进行定量分析。

使用 Adobe Illustrator 和 ImageJ 处理图像
1. 下图显示了从 MDA 获得的代表性图像。黑色箭头表示发芽的血管生成HRMEC管状结构，其已从初级层侵入次级基质胶层（图8）。
  
  图 8. 从 Matrigel Duplex Assay (MDA) 获得的代表性照片。黑色箭头表示侵入第二层的血管生成管状结构。
2. 在 Adobe Illustrator 2023 中打开图像。使用钢笔曲率工具，在两个图层之间的界面上绘制一条虚线。带有虚线的代表性图像如下所示（图 9）。
  
  图 9. 使用 Adobe Illustrator 2023 在两层交界处绘制虚线
3. 将图像导出到 Adobe Photoshop 2023 并以 jpeg 格式保存。在 ImageJ 中打开 jpeg 文件。使用线条工具，绘制一组六条线，标记血管生成管状结构侵入次级基质胶层的距离（图10）。绘制每条线后，按 CTRL-M 即可获取所绘制线的长度。遇到大于两个单元格的间隙时停止画线。我们的显微镜图像由三名独立观察者使用 ImageJ 程序以双盲方式进行分析。原始数据在补充信息中提供。
  
  图 10. Matrigel Duplex Assay (MDA) 的代表性图像，其中使用 Adobe Illustrator 绘制线条
4. 打开 GraphPad Prism（版本 9）。使用 ImageJ 程序获得的数字，创建数据的柱形图并执行统计分析（图 11）。数据的统计分析也在数据分析部分中描述。
  
  图 11. 通过 ImageJ 程序（由三名独立观察者）分析显微镜图像。使用 GraphPad Prism（版本 9）以图形方式表示数据。通过未配对的非参数t检验和曼-惠特尼检验来分析数据。相同字母表示的值之间差异不具有统计学显着性（P≤0.05）。

数据分析

每个样品在 MDA 中均经过一式两份的测试。整个测定独立重复四次。使用相差显微镜对测定进行量化以获得用于分析的图像。为每个样品捕获三张代表性图像（放大 10 倍）。这些图像通过 Adobe Illustrator 2023 和 Adobe Photoshop 2023 进行量化，然后由三名独立观察者以随机双盲方式进行 ImageJ 分析。使用 GraphPad Prism（版本 9）绘制数据图表。所有数据均绘制为平均值±标准差。通过未配对的非参数t检验和曼-惠特尼检验来分析数据。所有分析均应使用 95% 置信区间完成。当P < 0.05时，数据被认为是显着的。

注：我们实验室使用 Adobe Illustrator 和 Adobe Photoshop 结合 ImageJ 对 MDA 中获得的数据进行分析。我们意识到，并非所有实验室都可以使用 Adobe Illustrator 和 Adobe Photoshop 软件。用于数据分析的替代程序包括开源图像处理程序，例如 ImageJ 或 Fiji。这些平台提供了大量的工具和宏，例如 GitHub 位置提供的绘图工具集： https: //github.com/fiji/fiji/blob/master/macros/toolsets/Drawing%20Tools.txt。这种开源替代方案将扩大协议的可访问性，使更多用户受益。然而，我们没有使用这些开源软件程序的经验，因此我们无法评论它们对数据分析的功效。

协议验证

该 MDA 协议用于以下研究论文：

Dom, AM, Buckley, AW, Brown, KC, Egleton, RD, Marcelo, AJ, Proper, NA, Weller, DE, Shah, YH, Lau, JK, Dasgupta, P. (2011) α7-烟碱乙酰胆碱受体和MMP-2/-9 通路介导尼古丁在人视网膜内皮细胞中的促血管生成作用。投资。眼药水。维斯。科学。, 52, 4428-4438。

一般注意事项和故障排除

故障排除提示

HRMEC 应培养至大约 70%–80% 汇合。每三天至少更换一次培养基。避免细胞生长至超过 80% 汇合，以防止接触抑制和培养物衰老。
HRMEC 的健康对于检测来说非常重要。细胞应呈现鹅卵石形态和非颗粒状细胞质。因此，我们通常在所有实验中使用第 3 代和第 7 代之间的 HRMEC。
应仔细对 HRMEC 进行胰蛋白酶消化。过度的胰蛋白酶作用（或胰蛋白酶的中和不足）会促进细胞聚集和细胞死亡并释放细胞碎片，这将损害测定的质量。
基质胶等分试样应在 4°C 下解冻过夜。或者，在进行实验之前，可以将基质胶等份在冰上解冻（5-6 小时）。避免基质胶快速解冻。
使用 Matrigel 时，请使用预冷的移液器吸头。或者，在与基质胶一起使用之前，用冰冷的无菌 PBS 或基础介质填充 15 mL 离心管，通过填充和喷射冷液体数次来冷却尖端。
等分基质胶非常重要。不要重新冷冻基质胶两次以上。反复冷冻和解冻基质胶原液或等分试样会降解基质胶内的基底膜蛋白。同样，基质胶在室温下储存会导致其聚合（固化），从而无法使用。
将 HRMEC 和基质胶（用于第一层）的混合物保持在冰上，以防止基质胶凝固。确保在电镀前上下吹打以保持细胞均匀悬浮。不要涡旋 HRMEC 和 Matrigel 的混合物。轻轻移液以避免在此过程中基质胶中形成任何气泡。
第二层包含用 EGM-2 稀释并补充有 4% FBS 的 1:1 不含酚红基质胶溶液。通过轻轻地上下移液混合不含酚红的基质胶和 EGM-2（补充有 4% FBS）。避免摇动管子或涡旋它们，因为这会在第二层中产生气泡。

致谢

我们感谢 S. Chellappan 博士和他的实验室的持续支持。PD 和 MAV 得到美国国立卫生研究院 R15 学术研究增强奖 (2R15CA161491-03) 的支持。MAV 受 NIH R15AI15197-01 和 R15HL145573-01 支持。这项工作得到了西弗吉尼亚州 IDeA 生物医学研究卓越网络 (WV-INBRE) 资助（NIH 资助 P20GM103434；PI：G. Rankin 博士）的部分支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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补充资料

从 ImageJ(CTRL-M) 函数获得的 MDA 原始数据

每个样品在 MDA 中均经过一式两份的测试。整个测定独立重复四次。使用相差显微镜对测定进行量化以获得用于分析的图像。每个样品捕获三幅代表性图像（10 倍放大倍数）。这些图像由 Adobe Illustrator 2023 和 Adobe Photoshop 2023 进行量化，然后由三名独立观察员以随机双盲方式进行 ImageJ 分析。

术语 Control-1、Control-2 和 Control-3（在 EXCELOBSERVER-1-MDA-COUNTS-RAW-DATA 中，由绿色行 R1、R2、R3 表示）表示三个图像（三个独立字段）车辆处理的HRMEC。同样，PP2-10 µM-1、PP2-10 µM-2 和 PP2-10 µM-3（由橙色行 R4、R5、R6（EXCELOBSERVER-1-MDA-COUNTS-RAW-DATA）表示）代表PP2 处理的 HRMEC 的三张图像（三个独立视野）。EXCELOBSERVER-2-MDA-COUNTS-RAW-DATA 和 EXCELOBSERVER-3-MDA-COUNTS-RAW-DATA 也使用了类似的注释。
在文件 EXCELOBSERVER-1-MDA-COUNTS-RAW-DATA 中，C1–C6 列表示为每个图像绘制的六条线的尺寸（由 ImageJ 分析，然后由 CRTL-M 分析），如 OBSERVER-1 所描述。标记为“AVERAGE”的 C7 列（并以黄色表示）表示每行的平均值。C9 列中的数字（粉红色）显示 C7 列中前三个数字（R1、R2、R3 行）的平均值。该数字是实验 1 中所有经过媒介物处理的对照 HRMEC（以粉色表示，在 C8 列中称为 VEH）的平均值。实验2-4重复该过程。EXCELOBSERVER-2-MDA-COUNTS-RAW-DATA 和 EXCELOBSERVER-3-MDA-COUNTS-RAW-DATA 也使用了类似的注释。
C8 列和 R5 行（蓝色）中的数字显示 C7 列的最后三行（R4、R5、R6）中数字的平均值。该数字是实验 1 中经 PP2 处理的 HRMEC（以蓝色表示，在 C8 列中称为 PP2-Av）的平均值。实验2-4重复该过程。EXCELOBSERVER-2-MDA-COUNTS-RAW-DATA 和 EXCELOBSERVER-3-MDA-COUNTS-RAW-DATA 也使用了类似的注释。
上述过程为车辆处理的对照 HRMEC 产生了 12 个值（来自四次实验的三名观察者），这些值显示在文件 EXCELDATA-PROCESSING-FROM-THREE-OBSERVERS 中的 A 列（黄色列）中。同样，PP2 处理的 HRMEC 的 12 个值显示在文件 EXCELDATA-PROCESSING-FROM-THREE-OBSERVERS 的 B 列（红色列）中。计算媒介物处理对照（A 列）的平均值（= 595.5）。使用该值，将数据转换为对照百分比（表 4，C 列和 D 列）。C 列和 D 列中的数字用于在 GraphPad Prism 中生成图表（图 11）。

可以在此处下载以下支持信息：

EXCELSUPPL-DATA-OBSERVER-1-MDA-COUNTS-RAW-DATA：第一个观察者获得的原始数据。
EXCELSUPPL-DATA-OBSERVER-2-MDA-COUNTS-RAW-DATA：第二个观察者获得的原始数据。
EXCELSUPPL-DATA-OBSERVER-3-MDA-COUNTS-RAW-DATA：第三个观察者获得的原始数据。
EXCEL SUPPL-数据处理-来自三个观察者的结果：使用 GraphPad Prism 处理来自观察者的原始数据以创建图表（图 11）。