材料与试剂

生物材料

布朗博文受精鸡蛋（Medeggs Ltd）

分离和培养试剂

Leibovitz 的 L-15 培养基（含酚红）（Fisher Scientific，目录号：11415056）
分散酶 1 级（Roche，目录号：4942086001）
康宁胶原蛋白（Fisher Scientific，目录号：11563550）
Corning Matrigel GFR 膜基质（Fisher Scientific，目录号：354236）
外植体培养基：

Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985-062）

1% L-谷氨酰胺（Fisher Scientific，目录号：11574466）

1% 青霉素/链霉素（Fisher Scientific，目录号：11528876）

< 3% 胎牛血清（Sigma，目录号：F2442）
0.8 M 碳酸氢钠 (NaHCO ₃ )，无菌（Sigma，目录号：S5761）
10× DMEM（不含碳酸氢盐，含酚红，过滤，无菌）（Thermo Fisher Scientific，目录号：31600091）
热灭活山羊血清（HINGS）（科学实验室用品，目录号：G9023）
牛血清白蛋白（BSA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：B14）
磷酸盐缓冲盐水片（Fisher Scientific，目录号：18912014）
Tween 100（VWR，目录号：A4974.0250）
70%乙醇
卫生纸

多重杂交链式反应试剂

0.2 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 (PB)：6 g/L 磷酸二氢钠 (NaH ₂ PO ₄ )（VWR Chemicals，目录号：28013.264），21.8 g/L 磷酸氢二钠 (Na ₂ HPO ₄ ) (VWR化学品，目录号：102494C)
0.12 M PB 中的 4% 多聚甲醛 (PFA)（Sigma，目录号：P6148）：将 10 mL H ₂ O 加热至 65 °C，加入 1 g 多聚甲醛，颠倒混合，然后加入两滴 1 M NaOH（ VWR 化学品，目录号：28244.262）。翻转直至溶液澄清，用 0.2 M PB 定容至 25 mL，然后过滤
甲醇 (MeOH)（Fisher Scientific，目录号：M/4450/17）系列，溶于 PBS + 0.1% Tween 100（VWR 化学品，目录号：A4974.0250），用于外植体脱水和再水化（25% MeOH/75% PBST）；50% 甲醇/50% PBST；75% 甲醇/25% PBST；100% 甲醇）
定制探针（分子仪器）
定制放大器（发夹 h1 和发夹 h2）（分子仪器）
杂交缓冲液（Molecular Instruments，目录号：BPH01825）
洗涤缓冲液（Molecules Instruments，目录号：BPW02025）
扩增缓冲液（Molecular Instruments，目录号：BAM012125）
蛋白酶 K（Thermo Fisher Scientific，目录号：11444822）
盐水柠檬酸钠（SSC）（Sigma，目录号：S/3320/53）
SSC + 0.1% 吐温 100 (SSCT)
DNase I 重组无 RNase 溶胶（ROCHE，目录号：4716728001）
甲酰胺（SLS，目录号：47670-1L）
OCT 冷冻包埋矩阵（Fisher Scientific UK，目录号：12678646）
乙酸酐（Sigma Aldrich，目录号：320102）
三乙醇胺（Sigma Aldrich，目录号：90279）

影像学

转盘共焦显微镜（尼康，型号：W1）
显微镜（蔡司，型号：Apotome 2）
显微镜（徕卡，型号：MZ16F）
2% 低熔点琼脂糖（Promega，目录号：V2831）
4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D1306）
防褪色封固剂（SLS，目录号：F6182-20ML）
玻璃底培养皿（VWR，目录号：734-2906）

设备

18 ℃ 孵化器用于储存受精卵，37 ℃ 孵化器用于将卵孵化到合适的阶段（Panasonic、PHCbi 可编程冷却孵化器 238l）
37 ℃、5% CO ₂培养箱用于原代外植体培养
带顶灯和底灯的解剖显微镜（Leica MZ6 体视显微镜；Zeiss KL1500 LCD）
解剖工具

标准弯钳（Fine Science Tools，目录号：11001-20）
硬化精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14090-11）
Vannas 剪刀（精细科学工具，目录号：15000-01）
Dumont 5号精细镊子（精细科学工具，目录号：11254-20）
微型刀塑料手柄（Fine Science Tools，目录号：10316-14）
钨针（固定和切割）（Fine Science Tools，目录号：10130-05和20616-12）

汉堡汉密尔顿演出指南（汉堡和汉密尔顿，1951）
Nunc 4 孔培养皿（Sigma，目录号：734-1175）
10 厘米、30 毫米培养皿（SLS，目录号：PET2000）
Eppendorfs（VWR，目录号：525-0794）
组织切碎器（McILWAIN 组织切碎器）
剃须刀刀片（威尔金森）（可选）
65℃水浴
3 mL 宽孔巴斯德移液器（VWR，目录号：SLIN200C）
吉尔森移液器

软件和数据集

Axiovision 软件（蔡司）
LAS X1.1.0.12420 成像软件
斐济 ImageJ2 版本 2.3.0/1.53q
Adobe Photoshop 2023 版本 24.7.0

程序

从鸡蛋中取出胚胎

以下部分描述了从鸡蛋中取出鸡胚的过程。该方法适用于开发的所有图案形成阶段。分离可以在层流罩外进行，但鸡蛋和器械应使用 70% 乙醇进行消毒，并且在使用之间，器械应放置在消毒的薄纸上（不需要高压灭菌解剖工具）。
1. 将胚胎在 37°C 培养箱中孵化至适当的 HH 阶段。用标准细剪刀打开蛋壳，用5号细尖镊子小心地剥去外、内壳膜和卵黄膜，不要损坏胚胎。
2. 使用5号细尖镊子和标准细剪刀在胚胎周围进行切割。取出并放入 10 厘米培养皿中的冰冷 L-15 介质中（图 1B）。
  
  图 1. 收获鸡胚胎的实验装置。(A) 所需的解剖工具。(B) 冰上的 L-15 培养基和 Brown Bovan 受精卵。(C) 从鸡蛋中收获并去除膜、蛋黄和多余的胚胎外组织后的 HH10 鸡胚胎的示例。比例尺：1 毫米。
3. 去除绒毛尿囊膜和任何污染的蛋黄。使用大口径 3 mL 巴斯德移液器将胚胎（使用最少量的培养基）转移到 30 mm 培养皿中清洁的 L-15 培养基，并评估发育阶段。
4. 使用 Vannas 剪刀或电解磨尖的钨针剪掉多余的胚胎外组织，使胚胎被少量的胚胎外组织包围（图 1C）。
5. 如果需要，通过 PCR 分析一小块胚胎组织以确定性别。我们下面描述的协议同样适用于雄性和雌性动物。

下丘脑隔离

B1。方法一

神经外胚层的分离

以下部分描述了前神经外胚层在三个不同阶段的分离：神经板 [汉堡-汉密尔顿 (HH6–HH8)]、神经管 (HH9–HH12) 和系统发育 (HH13–HH25) 阶段。相同的方案可以适用于将组织与其他胚层和其他物种分离。分散酶在快速、温和地将神经外胚层与其他组织层分离方面特别有效，同时保持其完整性和活力。

使用钨针，在冷 L-15 介质中修剪胚胎，以隔离前胚胎区域，丢弃胚胎的后部分和任何剩余的胚胎外组织（图 2A、2F、2K）。留下足够的多余组织，以避免在手术的后续步骤中损伤下丘脑，因此在 Hensen 结（在 HH6）、体节 1（在 HH7-HH12）和中脑（HH13-HH25）水平进行后切口。

图 2. 在神经板、神经管和发育阶段的下丘脑组织的 Dispase 处理和细分所涉及的步骤。（A、F、K）在 Dispase 处理之前从卵中收获的整个胚胎的腹视图（A、F）或头部的侧视图（K）。在系统发育的后期，在 Dispase 治疗之前将眼睛移除。(B–D) 神经板阶段的分离。(B) 隔离和分散处理后 (A) 中的方框区域。(C) HH6 神经外胚层或中内胚层，在 Dispase 处理后分离。虚线轮廓显示半透明的内侧中线神经外胚层细胞。(D) 与 (C) 中相同的分离神经外胚层，修剪以去除头褶和外胚层。方框区域显示预期下丘脑。(G–I) 神经管阶段的分离。注意：通常，（F）中的方框区域将被分离并用分散酶处理。然而，为了更好地显示组织分离，(G) 中的视图显示了 Dispase 处理后的整个 HH10 胚胎。(G) 中的虚线勾勒出与相邻中内胚层分离的神经外胚层。(H, I) 分离的前神经外胚层的腹视图，在解剖显微镜 (H) 或 DAPI 标记后的明场照明 (I) 下观察。方框区域显示发育中的下丘脑，其围绕形态上不同的神经上皮褶皱发育。(K-O) 系统发育阶段的分离。(L) Dispase 处理后 HH24 头部的侧视图。视柄和下丘脑开始在形态上变得不同。(M) 分离的神经外胚层：圆圈区域标记下丘脑和视柄。(N) 侧视图显示了细分解剖的神经外胚层（(M) 中的圆圈区域。椭圆轮廓出预期的下丘脑，其在形态上不同的视柄和头曲之间向腹侧突出。(O) (N) 中所示的组织的开卷制备小提琴形的下丘脑在形态上是不同的。（E、J、P）HH6、HH10 和 HH24 神经外胚层的示意图，突出显示的区域显示了感兴趣的解剖区域。椭圆形勾画出下丘脑。缩写：HYP：下丘脑；ME：中内胚层； NE：神经外胚层；OS：视柄，CF：头曲。比例尺：250 μm。

在室温下，将前胚胎区域转移到 Nunc 4 孔盘中 L-15 培养基中的 0.5 mL 新鲜制备的分散酶 (1 mg/mL) 中。根据组织的大小，使用硅化玻璃移液器、适当尺寸的 Gilson 移液器（P200 或 P1000）或镊子（分别从小尺寸到大尺寸）进行转移，注意转移最少量的 L-15 培养基。孵育时间的长短与阶段高度相关（参见表 1）。经验法则是观察胚胎，直到组织层开始明显分离：中内胚层相对于外胚层收缩（图 2B、2G、2L）。反应完成后，将胚胎区域从分散酶溶液转移到 10 厘米培养皿中的大量冷 L-15 培养基中。让胚胎/胚胎区域休息 5-10 分钟。

表 1. 不同雏鸡发育阶段的 Dispase 处理持续时间

HH阶段	1 mg/mL Dispase 处理的持续时间
赫赫6	5分钟
赫赫8	6–8 分钟
赫赫10	10–12 分钟
HH13/14	15–17 分钟
HH17–20	18–20 分钟
HH21–25	20–25 分钟

重要提示 1：在培养皿之间转移胚胎区域时必须小心，以确保它们不会卡在移液管中或在半月板处上升和破裂[如果胚胎从温溶液转移到冷溶液，则后者很容易发生，例如，将溶液（室温）分散到冷的 L-15 介质中]。为了避免这种情况，请在显微镜下转移，避免气泡，并且一次仅转移几个胚胎区域 (3-4)。

重要提示 2：优化分散酶浓度和孵育时间至关重要。暴露于低浓度分散酶（即使孵育时间较长）的组织将无法分离；那些暴露于高浓度Dispase或孵育时间过长的细胞会变得粘稠，导致无法获得干净的分离组织层。

重要提示 3：对于比小鸡更脆弱的小鼠组织，可将 Dispase 中的时间减少 20%。

重要提示 4：用最少量的液体将经过分散酶处理的组织碎片转移到大量的 L-15 培养基中，无需灭活酶。然而，如有必要，可以使用一滴 10% HINGS 或 BSA 灭活 Dispase。

下丘脑解剖

以下部分描述了下丘脑组织在神经板、神经管和系统发育阶段的分离。

使用钨针（有些更喜欢钨针和微型刀的组合）将神经组织（即神经板、神经管或大脑，取决于胚胎阶段）与其他胚层分离。为此，用一只手用固定针固定胚胎区域（避免固定下丘脑），然后使用第二根针的长边轻轻地抚平中内胚层，将其与相邻的神经外胚层剥离。实现这一目标的难易程度和细节取决于阶段。在神经板阶段，中内胚层可以很容易地远离邻近的神经外胚层。这些组织很容易区分：神经外胚层比中内胚层更光滑、更大（图 2C）。通过头折可区分前后轴；神经板内侧中线（包含预期底板和下丘脑）通过其半透明外观显而易见（图 2C，虚线轮廓）。在神经板阶段，神经外胚层与外胚层相邻，这将在随后的解剖阶段提供有用的固定组织。在神经管和系统发育阶段，中内胚层和神经外胚层不容易分离，必须小心地剥离视泡、视柄和眼睛以及下丘脑周围的中内胚层。这可以使用钨针和（组织较大的）锋利的 5 号镊子来实现。分离后，神经组织应显得光滑且呈上皮样，没有圆形间充质/中内胚层细胞的污染（图2H，2M）。使用硅化玻璃巴斯德移液器或适当尺寸的吉尔森移液器（P10，P20）将分离的神经外胚层转移到冷的 L15 介质中，再次确保组织不会上升到半月板并破裂。
解剖神经组织后，使用形态学标准对下丘脑进行细分（图 2D、2H、2I、2M、2N）来定义其限制。在 HH6，预期下丘脑位于最前内侧中线细胞内和周围。与更多的后中线细胞一样，它们是半透明的，但可以与它们区分开，因为它们稍宽（图 2D）。在 HH10，新生的下丘脑占据以腹侧神经外胚层中一系列神经上皮褶皱为中心的区域。虽然在对比显微镜下最明显（例如，图2I），但在解剖显微镜下折叠在形态上可见（图2H），并为下丘脑位置提供精确的参考点。在系统发育的后期阶段，下丘脑在形态上不同的视交叉和头曲之间向腹侧突出（图 2L、2M）。下丘脑组织的分离通过两个步骤实现。首先，使用钨针解剖包含视柄、下丘脑和更多背侧间脑组织的域（图 2M 中椭圆形所示的限制，图 2N 中所示的隔离区域）。其次，将该组织准备成一本打开的书。下丘脑是明显的小提琴形区域，由半透明的内侧区域和较厚的周围区域组成，位于视柄/发育中的视交叉（图 2O 中的椭圆）后面。

重要提示 1： 5 分钟规则。除分散酶步骤外，避免从冰冷的 L-15 培养基中取出胚胎超过 5 分钟。通过练习，可以在 30-60 秒（早期）和 2-3 分钟（晚期）内将神经外胚层与中内胚层分离。一个好的经验法则是一次解剖一个胚胎。

重要提示 2：在神经板阶段，继续尽快解剖下丘脑（图 2C），否则中线细胞会失去半透明外观。

重要提示 3：定期磨锐切割钨针。

重要提示 4：在轻松、平静的环境中进行解剖。记住呼吸并保持肩膀放松，背部挺直。

B2. 交替切片方法

在之前的方法中，首先使用 Dispase 分离前神经板/神经管，然后对下丘脑（或预期下丘脑）进行细分。有些人发现这种方法很困难，因此更喜欢以下替代方法，其中首先将胚胎切成碎片，包括含有下丘脑的碎片，然后用分散酶处理，并分离下丘脑组织。这种方法对于神经管阶段胚胎特别有用，有些人发现很难将中内胚层从神经上皮褶皱中剥离出来，而神经上皮褶皱是该阶段新生下丘脑的特征。

将解剖的胚胎转移到干净的 5 厘米方形塑料板上，液体尽可能少（不得干燥，但不得漂浮），并将其排列平整（图 3A）。

图 3. 使用切片方法分离下丘脑组织。(A) HH9 胚胎平放在塑料板上。(B) 组织切碎机的顶视图，其中有塑料板和胚胎（虚线轮廓和箭头）准备切片。(C) 组织切碎器的前视图。(D) HH9 胚胎切成 150 μm 厚的切片。(E) 最前面的切片，从塑料支架中取出，从前部（顶部）到后部（底部）排列。箭头指向含有下丘脑的切片。(F) Dispase 处理后的 HH10 切片示例，每个切片均含有下丘脑。(G) Dispase 处理后含有 HH9 胚胎下丘脑的切片：虚线轮廓划分神经外胚层和中内胚层。(G'–G”) 分离神经外胚层 (G') 并进行细分以获得下丘脑外植体 (G”) 后的同一切片。比例尺：250 μm。
将带有胚胎的板设置到组织切碎器的底座上，胚胎的前后轴与组织切碎器刀片成直角（图3B）。
通过转动前面的厚度刻度盘（图 3C）来设置每个切片的厚度，并为每个实验使用新的刀片以保持样品无菌。
将支架底座移至起始位置并按开始。
一旦组织被切片（图3D），使用硅化玻璃移液器或吉尔森（P2或P10）小心地将前切片转移到30毫米培养皿中的L-15介质中。每个切片都有独特的形态。由于折叠的神经上皮和下面的中内胚层，包含下丘脑的切片比更多的前部切片更厚，并且比更多的后部切片具有更宽的神经管（图3E）。
将下丘脑切片转移到分散酶 5 分钟（图 3F）；然后，如上所述，通过轻轻抚摸相邻的中内胚层来分离神经组织。一旦从邻近组织中释放出来，神经上皮将稍微收缩（图3G，3G'），但包含新生下丘脑的腹侧中线仍然清晰，可以用钨针进行细分（图3G“）。

分离的下丘脑组织可以进行广泛的进一步研究，从体内功能测试（例如，将其移植到异位位置或细胞解离以进行 scRNA-Seq 分析）到离体功能测试（例如，神经球生成能力或离体培养物）。在这里，我们重点研究 3D 培养系统中的下丘脑组织外植体。

三维外植体培养的组织包埋

组织外植体是研究协调下丘脑发育的外在信号和组织内在自组织特征的高效工具。它们用途广泛，可用于分析模式、增殖和迁移。外植体培养物可能由整个下丘脑或更小的细分区域（受大小限制）组成。当外植体相对较小时，外植体的良好活力和发育会以类似于体内对应物的方式发生。这种大小的外植体可以培养长达 7 天，之后在外植体中心开始观察到组织拥挤和细胞死亡。当用于测定信号配体或抑制剂的作用时，这些因子可以与外植体培养基一起添加。外植体可以嵌入不同的基质中，最常见的是胶原蛋白或基质胶。将外植体放置在凝胶化胶原蛋白或基质胶的底层上，然后覆盖第二层，并放置在各层的界面处。以前的报告提供了如何将外植体嵌入 3D 矩阵的详细方法（Placzek 和 Dale，1999；Placzek，2008），因此这里我们仅提供简要细节。

对于胶原蛋白：
1. 在 Eppendorf 中准备所需体积（25 μL/床/孔）的 90% 胶原蛋白和 10% 10× DMEM，并涡旋 15-20 秒。涡旋后加入0.8M NaHCO ₃使溶液变成浅黄色。通常，将 2–6 μL NaHCO ₃添加到 100 μL 胶原蛋白/10× DMEM 中。胶原蛋白如果未使用，应置于冰上，因为它在室温下会开始凝固。始终为底层和顶层制作新鲜批次的胶原蛋白。
2. 在 Nunc 4 孔盘中，通过移液 20–25 μL 胶原蛋白，将其铺展到平板中来准备胶原蛋白床（图 4A）。使其凝固（室温下 20-30 分钟）。平坦的胶原床更容易嵌入组织，因为组织往往会从凸形床上滑落。
  
  图 4. 下丘脑组织包埋和培养。(A) 带 Matrigel 床的 Nunc 4 孔培养皿。(B) 培养前解剖（插图）和包埋（箭头）后的单个下丘脑外植体。(C) 72 小时后培养的下丘脑外植体。(D) 培养 72 小时的外植体的高倍视图。比例尺：(B、C) 250 μm，(D) 100 μm。
3. 使用硅化玻璃移液器/适当尺寸的吉尔森（P2、P10、P20）将外植体转移到胶原床上，定位它们，并使用细移液器去除多余的介质（图4B）。覆盖 25 μL 胶原蛋白，将其铺展以确保其覆盖底部床。当胶原蛋白凝固时，根据需要重新定位/操作外植体。胶原蛋白在室温下会很快凝固，因此工作速度很快，一次将顶部胶原蛋白层添加到一个孔中，从而提供了在胶原蛋白开始凝固之前重新定位外植体的机会。
4. 让顶部胶原蛋白床在室温下完全凝固（通过用钨针刺动胶原蛋白进行检查；凝固的胶原蛋白感觉坚硬），然后添加 400–500 μL 含有或不含因子的外植体培养基，并转移到培养箱中进行所需的孵育时间（图 4C、4D）。通常，我们将外植体培养 3 小时至 7 天。
对于基质胶：

在 Eppendorf 中制备所需体积（25 μL/床/孔）的 50% 基质胶和 50% 外植体培养基，并涡旋 15-20 秒。如果未使用，Matrigel 应置于冰上，因为它会在室温下开始凝固。始终为底床和顶床制作一批新鲜的基质胶。
对于胶原蛋白，继续执行上述步骤 2-4，但必须通过将培养皿在 37°C 下放置至少 30 分钟来设置床（通过用钨针刺入基质胶进行检查；设置基质胶感觉牢固）。

数据分析

多重 HCR 分析

胚胎和培养的外植体可以通过免疫组织化学（Manning 等人，2006）、流式细胞术（Perez 等人，2023）、显色原位杂交（Manning 等人，2006）或多重杂交链式反应（HCR）进行分析。在我们手中，我们发现免疫组织化学和原位显色对于嵌入胶原蛋白或基质胶中的外植体同样有效，但 HCR 仅对嵌入基质胶中的外植体有效。之前的报告描述了多重定量 HCR 的方法（Choi 等人，2020）及其扩展到免疫组织化学的方法（Schwarzkopf 等人，2021）。在这里，我们扩展了这些报告，以提供有关如何通过重复多轮多重 HCR 获取胚胎和外植体的详细信息。这种剥离和重新探测使得可以对每个样品 10-12 个基因进行常规分析（Chinnaiya 等人，2023）（图 5）。

图 5. 对胚胎和外植体进行整体多重杂交链式反应 (HCR) 分析(A–D) 对半解剖 HH20 进行 HCR 分析。视图显示剥离和重新探查后连续四轮 HCR 中的下丘脑区域。下丘脑结节区表达ISL1、SIX6、SHH、F GF1 0、TBX2、RAX和NKX2-1；下丘脑乳头区和乳头上区表达FOXA2、PITX2和EMX2。NKX2-1另外在腹侧端脑中表达，PAX6在背侧间脑中表达（来自（Chinnaiya 等人，2023 ）。（B）对嵌入基质胶中并培养 72 小时的整体 HH6 外植体进行多重 HCR 分析。外植体具有剥离和重新探测后经过四轮 HCR。在本例中，外植体包括预期结节下丘脑和一些眼组织。比例尺：100 μm。

胚胎和外植体均可作为整体或冷冻切片进行处理，如下详述。完成 HCR 后，可以通过沿矢状中线半解剖胚胎（我们将其称为半视图）或通过分离神经外胚层来特别清楚地观察神经外胚层。根据阶段的不同，这可以手动实现，也可能需要使用 Dispase，如上所述。HCR 期间不会从基质胶中取出外植体。

杂交链式反应

全胚胎或外植体分析

预孵化阶段

将样品固定、脱水，然后在冰上用一系列甲醇/PBST 清洗再水化，每次 5 分钟。
将样品在蛋白酶 K (10 μg/mL) 中室温孵育 2-5 分钟（取决于样品发育阶段）。
室温下将样品在 4% PFA 中后固定 20 分钟。
用 PBST、PBST + 5× SSCT (50:50) 清洗样品，然后用 5× SSCT 在冰上各清洗 5 分钟。

检测阶段

将样品在杂交缓冲液中于 37°C 预孵育 30 分钟。
通过在 500 μL 杂交缓冲液中添加 2–10 μL 1 μm 库存探针来配制所需的探针溶液，并在探针溶液中于 37 °C 下孵育样品过夜。
第二天，在 37°C 的洗涤缓冲液中洗涤样品 4 × 5 分钟，去除多余的探针。
在 RT 下用 5× SSCT 清洗样品 2 × 5 分钟。

放大阶段

将样品在扩增缓冲液中室温孵育 5 分钟。
通过快速冷却 10 μL 30 μM 库存（在 95°C 加热 90 秒，并在黑暗抽屉中冷却至室温 30 分钟），在单独的管中制备 30 pmol 的发夹 h1 和 30 pmol 的发夹 h2。
在室温下将快速冷却的 h1 和 h2 发夹添加到 500 μL 扩增缓冲液中，制备发夹混合物。
将样品在发夹混合物中室温避光孵育过夜。
第二天，在室温下用 5× SSCT 清洗去除发夹。
1. 2 × 5 分钟
2. 2×30分钟
3. 1 × 5 分钟
在 5× SSCT 中将样品在 1:1,000 DAPI (1 mg/mL) 中孵育 5–10 分钟。
用 5× SSCT 清洗去除多余的 DAPI。
在显微镜检查前，样品可以避光保存在 4°C 下。

注意：将样品放在摇床上进行所有步骤，但在蛋白酶 K 中除外。

剥离和重新探测

第一轮探针成像后，用 5× SSCT 清洗样品 2 × 5 分钟。
将样品在 1× DNase 缓冲液（100 μL/mL，溶于 H ₂ O）溶液中预孵育 5 分钟。
将样品在 DNase1 溶液（1:50，10,000 U/mL）中于 37 °C 孵育过夜。

注：对于 500 μL DNase1 溶液：50 μL DNase1 + 50 μL 10× DNase buffer + 400 μL ddH ₂ O。
在显微镜下检查样本，确认上一轮的信号消失了。
第二天，在 37°C 下，在 2× SSCT 中用 30% 甲酰胺清洗样品 3× 10 分钟。
在 37°C 下用 2× SSCT 清洗样品（3× 10 分钟）。
遵循检测和扩增步骤。

注意：使用不同的探针组可以成功重复剥离和重新探测 3-6 轮。

图像采集与分析

通过 HCR 分析获取的样品可以使用抗褪色封固剂平放在凹陷载玻片上成像，或者在玻璃底培养皿上包埋在 2% 低熔点琼脂糖中后成像。
在显微镜检查前，样品可以避光保存在 4°C 下。
使用 Nikon NIS 元件或 Zeiss Axiovision 软件将样品成像为 z 堆栈，并显示为最大强度投影。
使用 Fiji ImageJ 软件进行图像分析。

冷冻切片胚胎或外植体的分析

有关 OCT 安装和样品冷冻切片的详细协议，请参阅 Manning 等人。（2006）。

预孵化阶段

在 37 °C 下预热加湿室。
将载玻片平放在载玻片支架上，用 1× PBS 清洗 5 分钟以去除任何 OCT。
用 4% PFA 在室温下后固定 10 分钟。用 PBS 清洗载玻片 3 × 5 分钟。
将样品在蛋白酶 K (10 μg/mL) 中室温孵育 2-5 分钟（取决于样品发育阶段），然后再次固定切片 10 分钟。在 PBS 中清洗载玻片 3 × 5 分钟。
用乙酰化混合物处理载玻片 10 分钟：11.2 μL 三乙醇胺 + 2.5 μL 乙酸酐溶于 1 mL ddH ₂ O。在 PBS 中清洗载玻片 3 × 5 分钟。

检测阶段

在加湿室中于 37°C 下在杂交缓冲液中预孵育载玻片 1 小时。
按照上述检测阶段所述制备探针溶液。
取出杂交溶液，将 200 μL 探针溶液涂在每张载玻片上，盖玻片，用透明胶带密封加湿室的侧面，并在 37°C 下孵育过夜。
第二天，将载玻片浸入 37°C 的探针洗涤缓冲液中，以从盖玻片上浮起。
通过在 37 °C 下孵育载玻片去除多余的探针：
1. 75% 探针洗涤缓冲液/25% 5× SSCT 15 分钟。
2. 50% 探针洗涤缓冲液/50% 5× SSCT 15 分钟。
3. 25% 探针洗涤缓冲液/75% 5× SSCT 15 分钟。
4. 100% 5× SSCT 15 分钟。
在 5× SSCT 中室温清洗载玻片 5 分钟。
通过在薄纸上吸干边缘来干燥载玻片。

放大阶段

加入 200 μL 扩增缓冲液，室温预扩增 30 分钟。
如上所述制备发夹混合物，并添加 200 μL 发夹混合物、盖玻片，并在室温下孵育过夜。
第二天，将载玻片浸入 5× SSCT 中，使其从盖玻片上浮起。
在室温下用 5× SSCT 清洗去除多余的发夹：
1. 1× 5 分钟
2. 2×30 分钟
3. 1× 5 分钟，使用 DAPI。
4. 1× 5 分钟
通过在薄纸上吸干边缘来干燥载玻片。
添加 50–100 μL 抗褪色封固剂，并将盖玻片安装到载玻片上进行显微镜检查。

剥离和重新探测

第一轮探针成像后，用 5× SSCT 清洗样品 2× 5 分钟。
在 1× DNase 缓冲液（100 μL/mL，溶于 H ₂ O）溶液中预孵育 5 分钟。
将样品在 DNase1 溶液（1:20，1,000 U/mL）中在 37°C 下孵育 4 小时。

注：对于 500 μL DNase1 溶液：25 μL DNase1 +50 μL 10× DNase buffer + 425 μL ddH ₂ O。
在显微镜下检查载玻片，确认上一轮的信号已消失。
第二天，在 37°C 下，在 2× SSCT 中用 30% 甲酰胺清洗样品 3× 10 分钟。
在 37°C 下用 2× SSCT 清洗 3 × 10 分钟。
遵循检测和扩增步骤。

注意：使用不同的探针组可以成功重复剥离和重新探测 3-6 轮。

图像采集与分析

通过 HCR 分析采集的样品可以使用防褪色封固剂封固并盖上盖玻片。
在显微镜检查前，载玻片可避光保存在 4°C 下。
使用 Zeiss Axiovision 软件将样品成像为单堆栈或 z 堆栈，并显示为最大强度投影。
使用 Fiji ImageJ 软件进行图像分析。

重要提示 1：在某些情况下，形态学标准可用于对齐不同轮次的图像。当这不可能时，可以在每轮中重新部署参考探针。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

钦奈亚等人。（2023）。BMP 信号传导的神经上皮波驱动结节性下丘脑的前后规范。eLife（图1，面板T-T''；图3；图4；图5面板E-H；图6。

上述研究文章可以证明我们协议的稳健性和可重复性。

致谢

本研究全部或部分由 Wellcome Trust [212247/Z/18/Z] 资助给 MP 为了开放获取的目的，作者已对任何作者接受的手稿版本应用了 CC BY 公共版权许可从这个提交。

该协议源自 Chinnaiya 等人的原创工作。（2023）。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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