材料和试剂

1. 6孔板

2. 20 G 钝头插管，尖端被切断（BD Microlance 3，目录号：301300）

3. 1 mL注射器（BD Plastipak，目录号：303172）

4. U100胰岛素注射器（Braun，目录号：9151125）

5. 未涂层的 Ibidi 35 mm 细胞培养皿（ibidi GmbH，目录号：80131）

6. 棉花播种线（不太细； Wenco，目录号：140720）

7. 一次性手术刀（Braun，目录号：5518075）

8. Kimtech 论文（Kimtech Science，目录号：05511）

9. 25 mm 圆形盖玻片，170 µm 厚（Menzel-Gläser；VWR，目录号：631-1346）

10. 荧光标记的凝集素（来自 Bandeiraea simplicifolia，Sigma GmbH 的异凝集素 B4）

11. 1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS，Gibco，目录号：14190-144）

12. 异氟醚（Forene，abbvie）

13. 70％乙醇（霍尼韦尔，目录号：32205-2.5L-GL）

14. 1% 琼脂糖（BioFroxx，目录号：16500-500）在 DMEM 中，不含酚红（Gibco，目录号：31053-028）（参见配方）

细胞

为了可视化，肿瘤细胞需要荧光或预装荧光 NP。在这里，我们使用：

1. LLC-红色荧光蛋白 (RFP) 肺肿瘤细胞

2. 人 A549-mCherry 肺肿瘤细胞，用荧光 Atto488-Barium-NPs 预标记

动物

1. 用于可视化免疫细胞或肿瘤细胞的荧光报告鼠标。这里我们使用 C57BL/6-Tg(CD68-EGFP)1Drg/J 转基因小鼠（杰克逊实验室，库存号：026827）

2. NMRI-Foxn1nu 小鼠（Charles River Laboratories Inc，菌株代码：639）

设备

1. 外科瓦格纳剪刀（FST，目录号：14068-12）

2. 组织钳（FST，目录号：11021-12）

3. 标准模式钳（FST，目录号：11000-14）

4. 40 °C水浴（Memmert GmbH）

5. 异氟醚蒸发器（VetEquip，目录号：911104）

6. 配备可调谐激光器 (470-670 nm) 的共聚焦/超分辨率激光扫描显微镜系统和 GaAsP-PMT/光谱检测器（Carl Zeiss，型号：配备 Airyscan 检测模式的 LSM880）

7. 微波（夏普）

软件

1. 禅黑（卡尔蔡司）

2. Imaris ( https://imaris.oxinst.com ) (Bitplane, 版本 9.1.2)

3. 斐济（免费软件； https://fiji.sc/ ）

程序

描述了两种情况，以进行评估：

A. 肿瘤细胞之间的相互作用，预先用荧光 NPs 标记。例如，我们使用用 Atto488-NPs 预先标记的人类 A549-mCherry 肺肿瘤细胞，通过在6孔板中在³⁷℃，5% CO ₂。我们在NMRI-Fox1nu/nu 小鼠中使用了 Atto488-NP 加载细胞（视频 1）。

视频 1. 在小鼠肺中活跃的两个 A549-mCherry 肺肿瘤细胞之间交换绿色荧光纳米颗粒[来自 Ramos-Gomes等人。（2020 年） ]。

B. 荧光肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用。例如，我们在 C57BL/6-Tg( CD68-EGFP )1Drg/J (The Jackson Laboratory) 转基因小鼠中使用小鼠 LLC-红色荧光蛋白 (RFP) 肺肿瘤细胞（视频 2）。

对于这两种描述的场景，小鼠的年龄和性别没有限制。然而，小鼠的年龄和性别可能会在其他环境或实验中发挥作用，因此可能取决于要回答的个别问题、要使用的细胞系或选择的转基因小鼠。

视频 2. LLC-RFP 肺肿瘤细胞与小鼠肺中CD68-EGFP ^{+巨噬细胞/单核细胞的相互作用}[来自 Ramos-Gomes等人。（2020）] 。

为了血管的可视化，荧光凝集素（例如，Alexa-647-凝集素）与肿瘤细胞或负载NP的肿瘤细胞一起注射。

1. 在无酚红 DMEM 中制备 1% 琼脂糖的新鲜溶液，并保存在 40°C 水浴中。

2. 体内注射肿瘤细胞、NPs 和凝集素

a. 在 1 L/min 氧气中使用一致的 2% 异氟醚流量麻醉小鼠。

b. × 10 ⁶肿瘤细胞或 NP 负载的 1 × 10 ^{6肿瘤细胞和 100 µg 凝集素}到 U100 胰岛素注射器中，加入适当体积的 PBS，取决于小鼠的体重（最大 5mL/kg体重）。

c. 将鼠标放在 37°C 的热垫上，侧卧，尾巴悬在边缘，以便容易看到其中一条侧尾静脉。

d. 将小鼠尾巴浸泡在 37°C 温水中 1-2 分钟，以扩张血管。

e. 将针放置在几乎平行于静脉的表面上并小心地插入静脉。一旦针尖进入皮肤下，在插入过程中将注射器稍微向后拉，以确认血液会回流，然后在不移动针尖的情况下缓慢注射混合物。

f. 等待 5 分钟，然后用过量的麻醉剂牺牲动物。

3. 肺准备

a. 牺牲后立即用针将鼠标固定在手术板上，并用 70% 乙醇清洁胸部区域。

b. 用手术剪刀打开胸腔，露出肺和气管。

c. 将两条 10 厘米长的棉线放在气管下方（图 1），方法是小心地将一些标准模式镊子滑到气管下方并将线拉过。

d. 使用手术剪刀在气管顶部做一个小切口。

e. 将平淡的套管插入气管约 5 毫米。

图 1. 气管下方棉线位置的可视化。

f. 用顶部的棉线打一个双结，将插管固定在气管上。

g. 在 1 mL 注射器中装入 600 μL 的温暖 1% 琼脂糖，立即将其插入套管中，然后将琼脂糖缓慢注入肺部，以防止琼脂糖过早聚合（图 2）。

图 2. 用 1% 琼脂糖填充肺部的过程图像。

h. 用套管下方的结拧紧下部棉线，以密封肺。

i. 通过切断第一根线小心地取出插管。

j. 整块切除，从胸腔解剖肺。食道是通过颈部区域的背部标志。胸主动脉与心脏/肺一起被移除。

k. 将肺放在干燥的表面上，用手术刀取出心脏（图 3）。

图 3. 填充 1% 琼脂糖注射液的解剖肺外观。

l. 用手术刀在支气管分支处将它们切断，从而隔离单个肺叶。在 PBS 中短暂冲洗它们以去除任何血液。

m. 在 Kimtech 纸上擦干肺叶。

n. 选择单个肺叶进行成像，并将它们以最平坦的表面放置在Ibidi 35 mm 细胞培养皿上。

o. 用 500-800 µL 的 37°C 温 1% 琼脂糖覆盖整个肺叶，使肺叶刚好被琼脂糖覆盖，确保肺叶不会漂浮，并牢固地留在 Ibidi 培养皿底部。

p. 将盖玻片放在琼脂糖密封肺的顶部，以防止肺干燥（图4）。

图 4. Ibidi 室内肺叶样本的排列。

q. 立即进行成像。

4. LSM880进行实时图像采集

a. 蔡司LSM880 环境系统的设置：在图像采集前至少 4 小时打开显微镜环境培养箱，以尽量减少焦点漂移：37°C 和 5% CO ₂。

b. 图像采集

i. 将含有样品的 Ibidi 室放在显微镜台上（图5）。

图 5. 将样品放置在显微镜的环境室中。

ii. ×空气目标执行盖玻片的反射。

iii. 将外部盖玻片反射设置为零 µm 位置。

iv. 根据所选的荧光团组合设置适当的激光器和过滤器。在我们的示例中，我们使用了以下内容：CD68-EGFP 小鼠肺的 GFP 标记的单核细胞和 Atto488 标记的 NP 被 488 nm 的氩激光激发，LL2-RFP 和 A549-mCherry 肿瘤细胞被 561 nm 激光激发, Lectin-Alexa647 被 633 nm 激光激发。光路由分束器 488/561/633 划分，并由 GaAsP-PMT 检测器检测。对于高分辨率成像，我们使用 1024 × 1024 像素和 20 倍物镜，在放大图像的情况下，视场为 400 µm ^{2或更小。}为了准确量化荧光信号，我们建议位深度至少为 12，针孔设置为 1 个通风单位，尽管这些设置应根据特定样品和实验目标进行调整。以 4 分钟的时间间隔收集 10-12 μm 范围（步长为 1-2 μm）的 3 色图像的 z 切片。（例如，这个时间适合单核细胞动力学观察）。

v. 原始数据集（每个时间点的 z 切片 3 色图像）导出为 czi 文件。

数据分析

有几种软件和免费软件程序可用于图像分析。我们推荐 ImageJ 软件和 Imaris（Bitplane，版本 9.1.2）的斐济分布。我们通常为所需的时间间隔调整最大灰度值显示范围和时间序列。背景噪声也可以通过应用中值滤波器来降低。最后，如果数据被捕获为 z 堆栈，则可以通过应用最大强度投影将部分或整个堆栈显示为 2D 图像。最大投影适用于显示，但不适用于量化。

在视频 1 和 2 中可以看到通过这些程序获得的最终延时视频的示例。视频 1显示了在肺中活跃的两个 A549-mCherry 肺肿瘤细胞之间绿色荧光纳米颗粒的交换，这些细胞呈黄色。纳米材料的交换发生超过 3 小时。视频 2 显示了 LLC 肺肿瘤细胞（黄色）与转基因 C57BL/6-Tg(CD68-EGFP)1Drg/J 小鼠的巨噬细胞/单核细胞的相互作用，这些细胞出现绿色荧光（箭头）。可以在血管内观察到巨噬细胞/单核细胞对肿瘤细胞的监视，这些血管发出红色荧光。肺组织在 3 小时 20 分钟内显示出最小的运动和高度的焦点稳定性。

食谱_

1. 1% 琼脂糖 DMEM 溶液，不含酚红

a. 在微波烧瓶中混合 1 克琼脂糖粉在 100 mL 的 DMEM 中，不含酚红。

b. 将溶液微波 1-3 分钟，直到琼脂糖完全溶解（不要过度煮沸，因为过度蒸发会改变最终的琼脂糖浓度）。

c. 保持在 40 °C直至使用。

致谢

该项目已获得欧盟 Horizon 2020 研究和创新计划的资助，该计划根据 Marie Skłodowska-Curie 赠款协议 No. 861190 (PAVE) 以及 BMBF (VDI) 资助的项目 THERAKON (No. 13GW0218A) 和 ELICIT (No. 13N14346) ）。

该协议已改编自Ramos-Gomes等人。（2020 年）。

利益争夺

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

伦理

动物研究由 Nds 审查和批准。 Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit。

所有动物体内实验均按照欧洲指令 (2010/63/EU)进行。

参考

1. Blank, F.、Fytianos, K.、Seydoux, E.、Rodriguez-Lorenzo, L.、Petri-Fink, A.、von Garnier, C. 和 Rothen-Rutishauser, B. (2017)。生物医学纳米粒子与肺免疫系统的相互作用。 J 纳米生物技术15（1）：6。

2. Dinndorf, PA, Gootenberg, J., Cohen, MH, Keegan, P. 和 Pazdur, R. (2007)。 FDA药物批准摘要：培门冬酶（oncaspar）用于儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的一线治疗。 肿瘤学家12(8)：991-998。

3. Ediriwickrema, A. 和 Saltzman, WM (2015)。癌症纳米疗法：癌症疗法未来的靶向性和多功能性。 ACS 生物材料科学工程1（2）：64-78。

4. Jain, RK 和 Stylianopoulos, T. (2010)。为实体瘤提供纳米药物。 Nat Rev Clin Oncol 7（11）：653-664。

5. Mudshinge, SR, Deore, AB, Patil, S. 和 Bhalgat, CM (2011)。纳米颗粒：用于药物输送的新兴载体。 沙特医药 J 19（3）：129-141。

6. Ramos-Gomes, F.、Ferreira, N.、Kraupner, A.、Alves, F. 和 Markus, MA (2020)。离体现场小鼠肺中纳米粒子-细胞相互作用的细胞成像。 Front Bioeng Biotechnol 8：588922。

7. Shi, J.、Kantoff, PW、Wooster, R. 和 Farokhzad, OC (2017)。癌症纳米医学：进展、挑战和机遇。 Nat Rev Cancer 17（1）：20-37。