材料和试剂

注意：除非另有说明，所有试剂均在室温下保存。

1. 锥形瓶（2,000 mL 和 1,000 mL）

2. 6厘米培养皿（Genesee Scientific，目录号： 32-105G）

3. 10厘米培养皿（Genesee Scientific，目录号： 32-107G）

4. 杵和管（Bel-Art F650000006，目录号： 03-421-221），如果遵循“选项 1”；如果遵循“程序”步骤 C 中的“选项 2”，或清空 2 mL 带锥形底部的无裙边螺旋盖微管（Thermo Scientific 3468，目录号： 21-403-200）

5. Bead Bug 1.5 mm锆珠（Benchmark Scientific，目录号： D1032-15）

6. 移液器吸头（P1000、P200、P20 或 P10）

7. 磁力搅拌棒

8. 高压灭菌胶带

9. 500 mL Olympus 真空过滤瓶（Genesee Scientific，目录号： 25-227）

10. Lennox Luria 肉汤粉（Genesee Scientific，目录号： 11-125）

11. 琼脂（Fisher Scientific，目录号： BP1423）

12. 双蒸水 (ddH ₂O)

13. NaCl（Fisher Scientific，目录号： S671-500）

14. 胰蛋白酶蛋白胨（Gibco，目录号： 211921）

15. 胆固醇（MP Biomedicals，目录号： ICN10138201 ）

16. 乙醇，200-proof（Decon Laboratories，目录号： 04-355-223）

17. CaCl ₂· 2H ₂O（Fisher Scientific，目录号： C79-500）

18. MgSO ₄· 7H ₂O（Fisher Scientific，目录号： A14491）

19. KH ₂PO ₄（Fisher Chemical，目录号： P285-3）

20. NA ₂HPO ₄· 7H ₂O（Fisher Scientific，目录号： S373-500）

21. 盐酸左旋咪唑（MP biomedicals，目录号： 155228）

22. Triton X-100（Promega，目录号： H5142）

23. 磷酸盐缓冲盐水（PBS），10 × （Fisher Scientific，目录号： J62036）

24. 硫酸庆大霉素溶液（Cassion Labs，目录号： ABL03）

25. LB琼脂板（见食谱）

26. 磷酸盐缓冲液 (PBS)，1 × （见配方）

27. M9 最小培养基（见食谱）

28. 左旋咪唑原液（见配方）

29. M9/左旋咪唑溶液（见配方）

30. 庆大霉素原液（见配方）

31. 庆大霉素洗涤液（见食谱）

32. 胆固醇原液（见食谱）

33. 1 M CaCl ₂储备溶液（见配方）

34. 1 M MgSO ₄储备溶液（见配方）

35. 1 M KH ₂PO ₄，pH 6.0 储备溶液（见配方）

36. NGM 板（见食谱）

37. 1% Triton X-100 溶液（见配方）

设备

1. 微管均质器系统（ Bel-Art，目录号： F65000-0000 ）

2. BeadBug3 Microtube均质器（ Benchmark Scientific，目录号： D1030 ）

3. Zeiss Stemi 305 立体显微镜（Zeiss，目录号： 435063-9010-000）

4. 细菌培养箱 (37 °C ) 和秀丽隐杆线虫(15-25 °C )

5. 移液器（Eppendorf，型号：P1000、P200 或 P20，多道型号 P200、P10 或 P20）

6. 铂金线虫镐（如Wollenberg等人所述，内部制造，2013 年）

7. 乙醇蜡烛（DWK Life Sciences，目录号： 04-245-1）

8. 高压釜

9. 生物安全柜

10. Denver Instrument Summit SI-4002 Summit 系列顶部装载天平（Denver 仪器，目录号：EW-11422-13）

11. pH计（Thermo Electric Corporation）

12. Fisher Scientific 等温搅拌器（Fisher Scientific，目录号： 11-100-49S）

软件

1. 微软 Excel ( http://office.microsoft.com/excel )

2. Graphpad Prism v8.4.3。（Graphpad 软件公司， https: //www.graphpad.com ）

3. BioRender ( www.biorender.com )

程序

注意： _

1. 除非另有说明，否则所有步骤均使用无菌技术在生物安全柜 (BSC) 外进行。

2. 该协议假设线虫已经被培养并随后被感兴趣的细菌定殖。

3. 该协议描述了从固体线虫生长介质 (NGM) 中获取蠕虫。蠕虫也可以从液体培养物中获得。

A. 蠕虫准备（预洗）

1. 要去除多余的细菌，请从感兴趣的盘子中挑选 12 条或更多蠕虫到一个普通的、未播种的 NGM 盘子上。静置约 30 分钟。可能需要定期将盘子周围的蠕虫从转移的细菌中移开，以防止它们留在转移的细菌中。

B. 洗涤蠕虫以去除外部细菌

1. 将 10 条蠕虫从步骤 A1 的普通 NGM 板转移到 1 mL的 M9/左旋咪唑溶液中。

注意：如果将遵循步骤 C 中的“选项 2”，则必须将蠕虫放置在与均质机兼容的管中，例如 2 mL带锥形底部的螺旋盖无裙边管。

2. 让蠕虫沉降到管底，轻轻吸出 950 μL 的上清液。

注意：为确保蠕虫不被吸入，建议在此过程中使用解剖显微镜观察蠕虫。由于大的移液器吸头会增加吸出蠕虫的机会，因此建议使用 1 mL移液器去除不超过约 800 μL ，然后使用较小体积的移液器和移液器吸头去除 150 μL，大约 50微升一次。在此步骤结束时，管中应剩余 50 μL。

3. 使用 950 μL 的庆大霉素洗涤溶液进行庆大霉素洗涤。让蠕虫在庆大霉素溶液中沐浴 15-20 分钟。

4. 按照步骤 B2“注意”中提到的注意事项吸出 950 μL 上清液。

5. 重复步骤 B3 和 B4。

6. 按照步骤 B2“注意”中提到的注意事项，用 950 μL M9/左旋咪唑溶液清洗蠕虫并吸出 950 μL 上清液。

7. 重复步骤 B6。

8. 如步骤 B6 中所述执行第三次也是最后一次洗涤，但将 950 μL 去除的上清液保留在无菌微量离心管中。这将用于量化剩余的外部细菌，以在最终计算中获得肠道 CFU 的实际数量。

注意：为确保在洗涤过程中没有蠕虫丢失，应在均质化之前对蠕虫进行计数。

C. 裂解秀丽隐杆线虫

注意：我们描述了两种裂解线虫的方法：选项 1使用手持式电池供电的均质器，选项 2使用电动台式均质器。

使用手持式均质器裂解秀丽隐杆线虫

注意：“选项 1”步骤 2-3 的视频演示可以在视频 1中找到。

视频 1. 使用手持式均质器演示全蠕虫裂解。

1. 加入 200 μL 的 1% Triton X-100，静置 5 分钟。让蠕虫沉入试管底部。每管中的总体积应为 250 μL。

2. 将杵轻轻推向微量离心管的底部，以避免重新悬浮蠕虫。使用尽可能少的向上运动捣碎蠕虫。扭转运动最好磨碎蠕虫。

3. 将手持式均质器连接到研杵上，不要将研杵从管底部提起。研磨蠕虫，直到它们在显微镜下观察时看起来像是切碎的，例如 Zeiss Stemi。样品之间的均质化时间应尽可能保持一致。由于持续时间、力、运动、管和杵类型，此步骤通常会引入可变性。

使用电动台式均质器裂解线虫

1. 加入 200 μL 的 1% Triton X-100，静置 5 分钟。每管中的总体积应为 250 μL。

2. 在每个管中加入 30 个 1.5 mm 无菌锆珠。

3. 以 4 , 000 转每分钟 (rpm) 的速度连续运行 90 秒，两次。

注意：工作中的台式均质器的视频演示可以在视频 2中找到。

视频 2。使用台式均质器演示全蠕虫裂解。

D. CFU电镀

1. 在 BSC 中，使用无菌 PBS 对步骤 B8 中保存的上清液和均质蠕虫混合物进行连续稀释。首先将 200 μL的每个未稀释样品转移到 96 孔板的顶行，并进行至少 5 次十倍稀释。通过从前一个孔中取出 20 μL溶液并转移到填充有 180 μL无菌 PBS 的后续孔中来进行稀释。

注意：如果均质化后出现气泡，请短暂离心管以去除气泡。

2. 10 μL以及未稀释的样品放在含有适当培养基（即LB）的琼脂板上，让其干燥，并在37 °C下倒置。孵育时间取决于所使用的细菌，但通常 16-24 小时孵育就足够了。

注意：每个样品至少板三个内部重复。

E. 枚举 CFU

1. μL点的 CFU 数量并记录相应的行。计算和分析可以在“数据分析”中找到。

数据分析

每个内部复制中的 CFU/蠕虫总数可以使用以下公式计算： CFU/蠕虫 = [CFU _W*DF _W– CFU _SN(10 ^r+1– DF _SN)]/w ，其中CFU _W= CFUs来自整个蠕虫裂解物的板上， CFU _SN= 来自上清液的板上的 CFU， DF _W= 整个蠕虫裂解物的稀释因子， DF _SN= 上清液的稀释因子， r = 行数， w = 样本中的蠕虫数。稀释因子 (DF) 可以在表 1 中找到，并且对应于计算 CFU 的行。如“程序”步骤 D2“注”中所述，建议将样品一式三份电镀，在这种情况下，将通过取每个样品中所有内部重复的 CFU/蠕虫的平均值来计算平均 CFU/蠕虫。

统计分析取决于样本集。在计算对之间的统计显着性时，应使用学生 t 检验。在比较多个测试细菌与对照细菌的定植时，应使用单向方差分析 (ANOVA) 计算统计显着性，然后与 Dunnett 的事后检验进行多重比较。如果没有单个控制集，则应使用单向方差分析计算显着性，然后与 Tukey 的事后检验进行多重比较。应使用星号在图表中证明显着性，其中 * P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。

表 1. 稀释因子。

笔记

所有试剂、移液器吸头、微量离心管、珠子和研杵都应无菌，以免污染样品。所有其他预防措施都包含在“程序”中协议的相应步骤中。

食谱

1. LB琼脂板

a. 在 2 L 烧瓶中，混合 20 克 Luria 肉汤粉和 15 克琼脂。

b. 填充 ddH ₂O 至 1 L。

c. 添加磁力搅拌棒。

d. 放在搅拌板上，让试剂混合几分钟。

e. 盖上盖子（拧松）或用铝箔盖住瓶口。

f. 贴上高压灭菌胶带。

g. °C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。

h. 冷却至 50 °C，倒入 10 cm 培养皿中。

i. 将板干燥一天，放回袖子中，并在 4°C 下倒置存放。

2. 磷酸盐缓冲液 (PBS)，1 ×

在无菌容器中，在无菌 ddH _{2 O 中稀释 10}×无菌 PBS，最终浓度为 1 × PBS。在室温 (RT) 下储存。

3. M9 最小中号

a. 1L烧瓶中混合5.8 g Na ₂HPO ₄· 7H ₂O、3.0 g KH ₂PO ₄、5.0 g NaCl 和 0.25 g MgSO ₄· 7H ₂O。

b. ₂O填充至 1 L。

c. 放置在搅拌板上，混合直至所有试剂溶解。

d. 过滤消毒成两个 500 mL瓶。

e. 如果需要，分装成较小的无菌瓶，并储存在 RT。

4. 左旋咪唑原液

a. 左旋咪唑粉末溶解在 ddH ₂O 中，最终库存浓度为 240.75 mg/ mL (1 M)。

b. 过滤消毒、等分并储存在 -20 °C直至使用。

5. M9/左旋咪唑溶液

将 M9 中的左旋咪唑原液稀释至最终浓度为 80 μM 左旋咪唑。

注意：使用当天新鲜。

6. 庆大霉素原液

a. 无菌 ddH _{2 O 中的}庆大霉素 (50 mg/ mL ) 稀释至最终浓度为 5 mg/ mL 。

b. 分装并储存在 -20 °C直至使用。

7. 庆大霉素清洗液（M9/左旋咪唑/庆大霉素溶液）

将庆大霉素原液添加到 M9/左旋咪唑溶液中，最终浓度为 100 μ g/ mL庆大霉素。

注意：使用当天新鲜。

8. 胆固醇原液

将胆固醇溶解在 200 级乙醇中，最终浓度为 5 mg/ mL胆固醇。储存在 -20 °C 直至使用。

9. 1 M CaCl ₂储备溶液

a. 将 147 g CaCl ₂· 2H ₂O 添加到 1 L 烧瓶中。

b. ₂O填充至 1 L。

c. 添加磁力搅拌棒。

d. 放置在搅拌板上直到试剂溶解。

e. 等分并松散地拧上瓶子的盖子。

f. 贴上高压灭菌胶带。

g. 高压灭菌器流体循环 30 分钟。

h. 冷却，完全拧上盖子，并储存在 RT 直到使用。

10. 1 M MgSO ₄储备溶液

a. 将 246.5 g MgSO ₄· 7H ₂O 添加到 1 L 烧瓶中。

b. ₂O填充至 1 L。

c. 添加磁力搅拌棒。

d. 放置在搅拌板上直到试剂溶解。

e. 等分并松散地拧上瓶子的盖子。

f. 贴上高压灭菌胶带。

g. °C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。

h. 冷却，完全拧上盖子，并在室温下储存直到使用。

11. 1 M KH ₂PO ₄, pH 6.0 原液

a. 将 136.1 g KH ₂PO _4添加到 1 L 烧瓶中。

b. 溶解在 800 mL的 ddH ₂O中。

c. 添加磁力搅拌棒。

d. 放置在搅拌板上直到试剂溶解。

e. 用 10 g KOH 将 pH 值调节至 6.0。最多带 1 升。

f. 待试剂完全溶解，确认 pH 为 6.0 后，分装，拧松瓶盖。

g. 贴上高压灭菌胶带。

h. °C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。

i. 冷却，完全拧上盖子，并在室温下储存直到使用。

12. NGM 板

a. 在 2 L 烧瓶中，结合 3.0 g NaCl、2.5 g 胰蛋白酶蛋白胨和 17.0 g 琼脂。

b. 将 ddH ₂O 填充至 1 L。

c. 添加磁力搅拌棒。

d. 放在搅拌板上，让试剂混合几分钟。

e. 将盖子（松散地拧上）或箔放在瓶子的开口上。

f. 贴上高压灭菌胶带。

g. °C 下使用流体循环高压灭菌 30 分钟。

h. 冷却至 50 °C。

i. 加入 1 mL 的 5 mg/mL 胆固醇原液、1 mL 的 1 M CaCl ₂原液、1 mL 的1M MgSO ₄原液和 25 mL 的1M KH ₂PO ₄、pH 6.0 原液。

注意：让胆固醇储备溶液 (5 mg/mL) 达到室温，并确保胆固醇在添加到 NGM 之前重新溶解在溶液中。

j. 盖上盖子并放回搅拌板上一分钟。

k. 倒入 60 mm 培养皿中。

l. 冷却并倒置在塑料盒中，盖上 4°C。

13. 1% Triton X-100 溶液：

在 M9 中稀释 Triton X-100，总浓度为 1% Triton X-100。

注意：如果两种试剂都没有保持无菌，过滤灭菌并储存在 RT 直到使用。

致谢

这项工作得到了美国传染病学会的部分支持，以及佛罗里达大学食品和农业科学研究所微生物学和细胞科学系向 DMC 提供的启动资金。沃克等人。（2021 年）是该协议的原始研究论文。

利益争夺

资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。作者宣称不存在竞争利益。

参考

1. Avery, L. 和 You, YJ (2018)。 C. elegans喂养。 WormBook： C. elegans生物学的在线评论 [互联网]。蠕虫书。

2. 布伦纳，S.（1973 年）。行为遗传学。 Br Med Bull 29（3）：269-271。

3. Ortiz, A.、Vega, NM、Ratzke, C. 和 Gore, J. (2021)。种间细菌竞争调节秀丽隐杆线虫肠道中的群落组装。 ISME J 15(7)：2131-2145。

4. Vega, NM 和 Gore, J. (2017)。随机组装在秀丽隐杆线虫肠道中产生异质群落。 公共科学图书馆生物学15（3）：e2000633。

5. Walker, AC, Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, AS, Pourciau, C., Donahue, ET, Dove, AS, Gebhardt, MJ, Ellward, GL, Romeo, T. 和 Czyz, DM (2021)。人类肠道细菌病原体在秀丽隐杆线虫肠道中的定植导致蛋白质稳态破坏，而丁酸盐可以挽救这种破坏。 PLoS Pathog 17（5）：e1009510。

6. Wollenberg, AC, Visvikis, O., Alves, AMF 和 Irazoqui, JE (2013)。秀丽隐杆线虫的金黄色葡萄球菌杀灭试验。生物协议3(19)：e916。

7. Zhang, J.、Holdorf, AD 和 Walhout, AJ (2017)。秀丽隐杆线虫及其细菌饮食作为系统级理解宿主-微生物群相互作用的模型。 Curr Opin Biotechnol 46：74-80。