材料和试剂

植物材料
本协议中使用的 IR29 和 FL483 水稻幼苗在我们之前的出版物中有所描述（Wu等人，2017）。FL483 是源自 IR29 ( Oryza sativa L., ssp. indica ) 和 Pokkali (ssp. indica )杂交的重组自交系。IR29 和 FL483 显示出对比鲜明的 AO 和 DHAR 活性，在数据分析部分进一步介绍。

化学品和试剂
L-（+）-抗坏血酸，C 6 H 8 O 6 （Alfa Aesar，目录号：A15613），储存在2-8°C
抗坏血酸氧化酶，Cucurbita sp。（默克，目录号：189724），储存在-20°C
牛血清白蛋白，BSA（Sigma-Aldrich，目录号：05470）；储存在 2-8°C
Bradford 试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）；储存在 2-8°C
脱氢-L-（+）-抗坏血酸二聚体，C 12 H 12 O 12 （Sigma-Aldrich，目录号：D8132），储存在-20°C
EDTA二钠盐2-水合物，C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 ·2H 2 O（PanReac AppliChem，目录号：A2937），室温（RT）储存
L-谷胱甘肽还原，C 10 H 17 N 3 O 6 S（Sigma-Aldrich，目录号：G4251），储存在2-8°C
甘油（默克，目录号：G5516-100ML），储存在 RT
氯化氢，HCl（Carl Roth，目录号：7476.1），储存于室温
过氧化氢，H 2 O 2 （默克，目录号：386790-100ML），在2-8°C避光保存
六水氯化镁，MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M9272），储存在2-8°C
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钠水合物，NADH（Sigma-Aldrich，目录号：N8129），储存在-20°C
磷酸氢二钾，K 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P3786），储存于室温
磷酸二氢钾，KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P0662），储存于室温
氯化钠，NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：31434），储存在室温下
磷酸二氢钠一水合物，NaH 2 PO 4 ·H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：S9638），储存于室温
磷酸氢二钠脱水物，Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：71643），储存于室温
Tris超纯，C 4 H 11 NO 3 （PanReac AppliChem，目录号：A1086），储存在RT
水稻肥料（ICL/SF，Peter Excel CalMag Grower，目录号：2152），储存在 RT
水稻生长用人造土壤（见配方中的表2 ）
可溶性部分的 AO 提取缓冲液（参见配方），储存在室温下
用于离子结合部分的 AO 提取缓冲液（参见配方），储存在 RT
AO 检测缓冲液（参见配方），储存在室温下
APX/MDHAR 提取缓冲液（见配方），准备新鲜的
APX 检测缓冲液（见配方），准备新鲜的
来自葫芦科植物的 AO。酶溶液（见配方），储存在-20°C
MDHAR 检测缓冲液（见配方），准备新鲜的
DHAR 提取缓冲液（见配方），储存在室温下
DHAR 测定缓冲液（见配方），储存在室温下

耗材
的枪头0.1-10微升仪（Eppendorf，epT.IPS ®标准，目录号：0030000811）
的枪头2-200微升仪（Eppendorf，epT.IPS ®标准，目录号：0030000889）
的枪头100-1000微升仪（Eppendorf，epT.IPS ®标准，目录号：0030000927）
离心管 1.5 ml（Eppendorf，Safe-Lock Tubes，目录号：0030120086）
离心管 2.0 ml（Eppendorf，Safe-Lock Tubes，目录号：0030120094）
离心机管50毫升（康宁，隼®管，目录号：352070）
滤纸（Schleicher 和 Schuell，目录号：311609）
紫外线透明 96 孔微孔板（Greiner Bio-One，UV-Star ® Microplate，目录号：655801）
微孔板（Greiner Bio-One，96 孔微孔板，目录号：655101）
血清移液管 5 ml（Eppendorf，Serological Pipets，目录号：0030127714）
血清移液管 25 ml（Eppendorf，Serological Pipets，目录号：0030127730）
血清移液管 50 ml（Eppendorf，Serological Pipets，目录号：0030127749）
Parafilm（Bemis，Parafilm M，目录号：2910057）
PCR条（Biozym，PCR SingleCap 8er-SoftStrips 0.2 ml，目录号：710970）
培养皿（Greiner Bio-One，100×20 mm，目录号：664102）
储液器（Corning，Axygen ® 25 ml 一次性，目录号：RES-V-25）
植物生长盆，2 L（Nitsch，圆盆，目录号：503402）
用于植物生长的托盘（Hermann Meyer，目录号：749651）

设备

注意：其他具有类似功能的设备型号，例如具有覆盖 265-595 nm 光谱范围的吸光度测量功能的酶标仪、具有冷却功能的离心机、多道移液器，也可以代替所列型号使用。在该协议中，我们描述了需要研杵和研钵进行研磨的水稻芽样品的测定。对于少量组织，研究人员还可以使用 2 ml 离心管和组织研磨机进行样品制备。
-80°C 冷冻机（Thermo Scientific，TSX ULT 冷冻机，目录号：TSX70086V）
具有冷却功能的离心机（Eppendorf，Centrifuge 5425R，目录号：5406000216）
实验室培养箱（Memmert，通用烤箱，目录号：UN110m）
分析实验室天平（Sartorius，1702 分析天平，目录号：05771）
台式 pH 计（Xylem Analytics，WTWTM inolab ® 7110，目录号：9920090）
冰桶
实验室涡流混合器（Scientific Industries，Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
磁力搅拌器（IKA，RH basic 2，目录号：0003339000）
移液器控制器（Eppendorf，Easypet 3，目录号：4430000018）
多道移液器0.5-10微升仪（Eppendorf，研究®加，目录号：3125000010）
多道移液器10-100微升仪（Eppendorf，研究®加，目录号：3125000036）
吸管2-20微升仪（Eppendorf，研究®加，目录号：3123000039）
移液管100-1,000微升仪（Eppendorf，研究®加，目录号：3123000063）
酶标仪（TECAN;无限® 200 Pro的中号Plex的，目录号：INF-MPLEX）
容量瓶100毫升（默克，杜兰® ，目录号：DWK213722473）
容量瓶250毫升（默克，杜兰® ，目录号：DWK213723675）
容量瓶500毫升（默克，杜兰® ，目录号：DWK213724474）
带螺旋盖和倾倒环的实验室瓶 100 ml（Merck，Duran ® ，目录号：Z305170）
实验室瓶 250 ml，带螺旋盖和倾倒环（Merck，Duran ® ，目录号：Z305189）
实验室瓶 500 ml 带螺旋盖和倾倒环（Merck，Duran ® ，目录号：Z305197）
研杵和研钵（Fisher Scientific，Haldenwanger 55-2，目录号：15292519）
恒温温室

软件

酶标仪 i-control TM （TECAN，https ://lifesciences.tecan.com ）
Microsoft Excel（微软，https://www.microsoft.com/en-ww/microsoft-365/excel）

程序

图 2简要演示了本协议中描述的整个过程。此外，图 3 显示了一个工作流程，描述了分析不同抗坏血酸周转酶活性的详细步骤。

在气候控制的温室中种植水稻
将 15-20 粒种子放在用去离子水浸泡过的滤纸上，放在一个培养皿中；用封口膜密封培养皿并在 30°C 的黑暗中发芽三天。
用水稻生长土壤填充 2 升盆，并用自来水彻底浸泡土壤。
将 3 天大的水稻幼苗小心地移植到 2 升盆中，每盆一株。
注意：要轻柔，不要损坏幼苗，并用 1-2 厘米的土壤覆盖根部。
设置水稻生长条件如下：昼/夜温，28/22°C；相对湿度，60-70%；光强，500-600 µmol m -2 s -1 ；和昼/夜时段，8/16 小时（短日）。
定期检查生长盆，确保积水充足；从幼苗 2 周龄开始，每周向每个托盘施用 20 毫升 15 克/升的 Peter Excel 肥料溶液。
收获并用液氮速冻 3 周龄植物的地上枝条。
使用预冷杵和研钵将大约 1-2 克收获的样品研磨成细粉；将它们储存在无菌的 15 ml Falcon 管中，并在提取时将它们置于 -80°C 的冰箱中。

图 2. 总结本协议中描述的工作程序的代表性照片。(A) 将 15-20 粒种子放在浸透的滤纸上，在 30°C 的黑暗中发芽 3 天。(B) 将 3 天大的幼苗移植到装满水稻生长土壤的盆中。(C) 将植物种植 3 周，并用液氮收获芽。(D) 用杵和研钵在液氮中研磨植物样品。(E) 称取 80-100 mg 样品到离心管中并加入提取缓冲液。(F) 4°C 离心后将上清液转移到新管中。(G) 通过混合测定缓冲液、植物提取物和反应底物来建立酶促反应；通过吸光度动力学测量监测底物/产物的变化。

图 3. 本协议中描述的抗坏血酸转换酶活性的测定步骤总结。用液氮将植物材料研磨成细粉，以便进一步分析。应用提取缓冲液来制备用于目标酶学测定的植物提取物。灰色背景突出显示了 AO-SF 和 AO-IBF 活动的步骤。APX（以绿色背景突出显示）和 MDHAR（以蓝色背景突出显示）分析共享相同的提取步骤，但分析步骤不同。黄色背景突出显示了 DHAR 检测的步骤。检测和酶促计算的更多细节在以下部分进行了描述（参见程序 BD 、数据分析和食谱）。
AO-SF，抗坏血酸氧化酶可溶性部分；AO-IBF，抗坏血酸氧化酶离子结合部分；APX，抗坏血酸过氧化物酶；MDHAR，单脱氢抗坏血酸还原酶；DHAR，脱氢抗坏血酸还原酶。

可溶性和离子结合部分的AO活性测定
在预冷的 2 ml 离心管中称取 80 mg 研磨样品；添加 1 ml AO 提取缓冲液用于可溶性部分 (AO-SF)。
剧烈涡旋混合物 30 秒，并将管子放在冰上。
在 4°C 下以 14,000 × g离心10 分钟。
将上清液转移到新的 1.5 ml 试管中进行 AO 可溶性组分活性测定；将上清液再次离心 1 分钟以清除提取物。
注意：我们建议在提取后立即分析样品。但是，提取的样品在分析前可以在 -20°C 的冰箱中储存长达 1 周或在 -80°C 的冰箱中储存长达 1 个月。步骤B5-B6用于AO离子结合馏分提取；AO 的可溶性和离子结合部分的测定步骤相同。
用 1 ml AO 提取缓冲液重悬沉淀，用于离子结合部分（AO-IBF）；剧烈涡旋 20 秒。
将提取物在4°C 下以 14,000 × g离心10 分钟，并将上清液转移到置于冰上的新 1.5 ml 管中。
在紫外线透明的 96 孔微孔板中混合 80 µl AO 检测缓冲液和 10 µl 植物提取物；为每个样品准备两个分析重复。
使用多通道移液器加入 10 µl 2 mM AsA，开始反应；通过上下移液 6-8 次混合均匀。
在 25°C 下监测 265 nm 处的吸光度动力学 5 分钟。
使用 AO 提取缓冲液制备一系列 BSA 标准溶液：0、0.1、0.2、0.5 和 1.0 毫克/毫升。
注意：要确定 AO 可溶性部分提取物中的蛋白质浓度，请使用 AO-SF 提取缓冲液（不含 1 M NaCl，参见配方）溶解 BSA；对于 AO 离子结合部分提取物，使用 AO-IBF 提取缓冲液（含 1 M NaCl，参见配方）溶解 BSA。
将 25 µl BSA 标准品或植物提取物与 475 µl Bradford 试剂溶液混合；涡旋 15 秒，并在室温下将混合物孵育 10 分钟。
将 100 µl 反应混合物装入 96 孔微孔板（非紫外线透明）并测量 595 nm 波长处的吸光度；为标准品和植物提取物准备两个分析复制品。

APX 和 MDHAR 活性测定
注意：使用相同的提取缓冲液为 APX 和 MDHAR 测定制备植物提取物。
称取 100 mg 样品放入预冷的 2.0 ml 试管中；添加 1 ml APX/MDHAR 提取缓冲液。
剧烈涡旋 30 秒，然后在 4°C 下以 10,000 × g离心30 分钟。
将上清液转移到置于冰上的 1.5 ml 管中；再离心 1 分钟以清除提取物。
注意：我们建议在提取后立即分析样品。对于 APX 和 MDHAR 活性测定，植物提取物不适合在冷冻条件下长期储存，这会降低酶活性。
对于 APX 检测，通过上下移液 6-8 次将 80 µl APX 检测缓冲液和 10 µl 植物提取物在紫外线透明微孔板中彻底混合；为每个样品准备两个分析重复。
加入 10 µl 0.03% (V/V) H 2 O 2溶液开始反应；在 25°C 下监测 290 nm 处的吸光度动力学 1 分钟。
注意：反应非常迅速。将微孔板放入读数器中，准备立即进行吸光度检测。
对于 MDHAR 检测，通过上下移液 6-8 次将 80 µl MDHAR 检测缓冲液和 10 µl 植物提取物混合在 UV 透明板中。
加入 10 µl 1 mM NADH 开始反应；在 25°C 下监测 340 nm 处的吸光度动力学 2 分钟。
注意：APX 和 MDHAR 检测提取物中的总蛋白质浓度相同。
使用 APX/MDHAR 提取缓冲液制备一系列 BSA 标准溶液：0、0.1、0.2、0.5 和 1 mg/ml。
在 1.5 ml 试管中将 25 µl BSA 标准溶液或植物提取物与 475 µl Bradford 试剂混合；涡旋 15 秒，并在室温下孵育 10 分钟。
将 100 µl 蛋白质测定混合物装入 96 孔微孔板（非紫外线透明）并测量 595 nm 处的吸光度；为每个标准或样品准备两个分析重复。

DHAR活性测定
在预冷的 2 ml 试管中称取 100 mg 样品；添加 1 ml DHAR 提取缓冲液。
剧烈涡旋 30 秒，然后在 4°C 下以 13,000 × g离心10 分钟。
将上清液转移到置于冰上的新的 1.5 ml 管中；重新离心 1 分钟以清除提取物。
注意：我们建议在提取后立即分析样品。但是，植物提取物可以在分析前在 -20°C 的冰箱中储存长达 1 周或在 -80°C 的冰箱中储存长达 1 个月。
将 70 µl DHAR 测定缓冲液、10 µl 植物提取物和 10 µl 5 mM DHA 溶液通过上下吹打 6-8 次混合到 UV 透明微孔板中；对空白使用 DHAR 提取缓冲液；为每个样品准备两个分析重复。
注意：在 DHAR 检测中包含空白是必不可少的，因为 GSH 可以在没有 DHAR 的情况下减少 DHA。
向混合物中加入 10 µl 50 mM GSH 溶液，开始反应；在 25°C 下监测 265 nm 处的吸光度动力学 5 分钟。
使用 DHAR 提取缓冲液制备一系列 BSA 标准：0、0.1、0.2、0.5 和 1.0 毫克/毫升。
将 25 µl BSA 标准品或植物提取物与 475 µl Bradford 试剂混合，涡旋 15 秒；在室温下孵育混合物 10 分钟。
将 100 µl 混合物装入微孔板（非紫外线透明）并测量 595 nm 处的吸光度；为每个标准和样品准备两个分析重复。

数据分析

酶活性计算依赖于每毫克总蛋白质每分钟转化的底物或生成的产物的量（mol/min/mg 蛋白质）。反应混合物的吸光度动力学反映了底物转化率或产物生成率（图 4）。使用比尔定律计算反应混合物中一分钟内的底物/产物浓度变化率。
比尔定律：A = ɛlc ，其中
A为吸光度；
ɛ是特定波长下底物/产物的摩尔消光系数；
l为光程长度，cm；
c是底物/产物的浓度。

可溶部分和离子结合部分的 AO 活性计算
确定 265 nm 处吸光度的动力学斜率；检查线性相关系数（图 4A）。
注意：对于可靠的 AO 活性测定，确定系数 R 2应大于 0.99 。
应用比尔定律计算每分钟 AsA 氧化的速率。将斜率 ( A , OD min -1 )的绝对值除以ɛ 265 nm (14 mM -1 cm -1 ) 和光路长度l (在本协议中为 0.278 cm)，以获得一分钟内 AsA 的浓度变化。
注意：对于其他类型的 96 孔微孔板，请参考产品数据表计算 100 µl 溶液的光程长度。
将每分钟 AsA 浓度的变化乘以反应混合物的体积（100 µl 或 0.0001 L），计算每分钟 AsA 氧化的速率。
根据标准曲线计算 10 µl 植物提取物中的总蛋白质含量（图 5）。
注意：在应用线性相关公式计算蛋白质浓度之前，用 0 mg/ml 标准吸光度值空白样品吸光度值。
使用每分钟 AsA 氧化速率（步骤 A3）除以 10 µl 植物提取物中的蛋白质量（步骤 A4）计算 AO 活性。

图 4. 基于吸光度的酶活性测定动力学散点图。(A) 通过监测 265 nm 处的吸光度动力学来指示抗坏血酸氧化速率的 AO 测定。(B) 通过分析 290 nm 处的吸光度动力学进行 APX 测定。(C) 通过测量 340 nm 处的吸光度动力学来指示 NADH 氧化速率的 MDHAR 测定。(D) DHAR 测定通过测量 265 nm 处的吸光度动力学来揭示抗坏血酸生成率。用Excel分析线性相关系数。使用动力学斜率的绝对值进行酶活性计算。显示了每个样品的两个分析复制品。AO，抗坏血酸氧化酶；APX，抗坏血酸过氧化物酶；MDHAR，单脱氢抗坏血酸还原酶；DHAR，脱氢抗坏血酸还原酶。

图 5. 植物提取物中蛋白质测量的标准曲线。使用在提取缓冲液中制备的一系列浓度范围为 0.1 至 1.0 mg/ml 的 BSA 溶液生成标准曲线。该曲线中使用的空白 (0 mg/ml BSA) 是特定酶促测定的提取缓冲液。将 25 µl 标准溶液与 475 µl Bradford 试剂混合，并在室温下孵育 10 分钟。用酶标仪测量 595 nm 处的吸光度。分析吸光度值（用 0 mg/ml BSA 样品空白）与 BSA 浓度之间的线性相关性。

APX 活动计算
确定 290 nm 处吸光度的动力学斜率；检查线性相关系数 (图 4B)。
注：测定系数R 2应大于0.9，以获得可靠的APX 活性结果。
应用比尔定律计算每分钟 AsA 氧化的速率。将斜率 ( A , OD min -1 )的绝对值除以ɛ 290 nm (2.8 mM -1 cm -1 ) 和光路长度l (在本协议中为 0.278 cm)，以获得一分钟内 AsA 的浓度变化。
注意：当使用其他类型的 96 孔 UV 透明微孔板时，请参考产品说明计算 100 µl 溶液的光程长度。
将每分钟 AsA 浓度的变化乘以反应混合物体积（100 µl 或 0.0001 L），计算每分钟 AsA 氧化的速率。
根据用 BSA 制备的标准曲线计算 10 µl 植物提取物中的总蛋白质含量（图 5）。
注意：在应用线性相关公式计算蛋白质浓度之前，用 0 mg/ml 标准吸光度值空白样品吸光度值。
使用每分钟 AsA 氧化速率（步骤 B3）除以 10 µl 植物提取物中的蛋白质量（步骤 B4）计算 APX 活性。

MDHAR活性计算
确定 340 nm 处吸光度动力学的斜率；检查线性相关系数（图 4C）。
注：确定系数R 2应大于0.99，以获得可靠的MDHAR 活性结果。
应用比尔定律计算每分钟 NADH 氧化的速率。将斜率 ( A , OD min -1 )的绝对值除以ɛ 340 nm (6.2 mM -1 cm -1 ) 和光路长度l (在本协议中为 0.278 cm) 以获得一分钟内 NADH 的浓度变化。
注意：当使用其他类型的 96 孔 UV 透明微孔板时，请参考产品说明计算 100 µl 溶液的光程长度。
将每分钟 NADH 浓度的变化乘以反应混合物体积（100 µl 或 0.0001 L）以计算每分钟 NADH 氧化的速率。
根据用 BSA 制备的标准曲线计算 10 µl 植物提取物中的总蛋白质含量（图 5）。
注意：在应用线性相关公式计算蛋白质浓度之前，用 0 mg/ml 标准吸光度值空白样品吸光度值。
使用每分钟 NADH 氧化速率（步骤 C3）除以 10 µl 植物提取物中的蛋白质量（步骤 C4）计算 MDHAR 活性。

DHAR活性计算
确定样品和空白处 265 nm 处吸光度的动力学斜率；检查线性相关系数（图 4D）。
注意：对于可靠的 DHAR 活性测定，决定系数 R 2应大于 0.99。对于 DHAR 测定，必须监测空白中的反应，因为在没有 DHAR 的情况下，GSH 可以减少 DHA。
用空白减去样品的斜率；应用比尔定律计算每分钟产生 AsA 的速率。将斜率 ( A , OD min -1 )的绝对值除以ɛ 265 nm (14 mM -1 cm -1 ) 和光路长度l (在本协议中为 0.278 cm)，以获得一分钟内 AsA 的浓度变化。
注意：对于其他类型的 96 孔微孔板，计算 100 µl 溶液的光程长度，请参阅产品数据表。
将每分钟 AsA 浓度的变化与反应混合物体积（100 µl 或 0.0001 L）相乘，计算每分钟 AsA 生成率。
根据用 BSA 制备的标准曲线计算 10 µl 植物提取物中的总蛋白质含量（图 5）。
注意：在应用线性相关公式计算蛋白质浓度之前，用 0 mg/ml 标准吸光度值空白样品吸光度值。
使用每分钟 AsA 氧化速率（步骤 D3）除以 10 µl 植物提取物中的蛋白质量（步骤 D4）计算 AO 活性。

在下表 1 中，我们描述了使用吸光度动力学斜率和蛋白质浓度计算酶活性的基本步骤。

表 1. 不同酶活性计算的详细步骤
使用比尔定律将吸光度动力学斜率（图 4）转换为底物/产品变化率。确定 10 µl 植物提取物中的蛋白质含量，用于酶活性计算。
AO，抗坏血酸氧化酶；APX，抗坏血酸过氧化物酶；MDHAR，单脱氢抗坏血酸还原酶；DHAR，脱氢抗坏血酸还原酶；ɛ 265nm = 14 mM -1 cm -1 ; ɛ 290nm = 2.8 mM -1 cm -1 ；ɛ 340nm = 6.2 mM -1 cm -1 ；ɛ 265nm = 14 mM -1 cm -1 ; l ，光路长度；P ，总蛋白浓度；P' , 10 µl 提取物中的总蛋白质含量；R ，底物/产物转化率；E、酶活性。

统计分析和数据呈现
在该协议中，我们研究了一个单一因素：基因型对酶活性的影响。在 Excel 中使用单向方差分析来测试酶活性的基因型差异（图 6）。使用 BoxPlotR ( http://shiny.chemgrid.org/boxplotr/ )生成箱线图( Spitzer et al. , 2014)。

图 6. IR29 和 FL483 中与抗坏血酸转换相关的酶活性。 (A) AO 可溶性部分、(B) AO 离子结合部分、(C) APX、(D) MDHAR 和 (E) DHAR 活性在水稻芽中测量。数据以箱线图形式呈现，红色加号表示重复样本的平均值 (N = 4)。单向方差分析用于测试 IR29 和 FL483 之间差异的显着性水平。AO，抗坏血酸氧化酶；APX，抗坏血酸过氧化物酶；MDHAR，单脱氢抗坏血酸还原酶；DHAR，脱氢抗坏血酸还原酶。**，P < 0.01；***，P < 0.001。

笔记

始终将地面样品和植物提取物保持在凉爽的条件下。在称重过程中，用液氮预冷离心管和微刮刀。将植物材料彻底研磨成细粉，以确保充分提取。称重后立即向样品中加入提取缓冲液，并在整个分析过程中将提取混合物保持在冰上。
吸光度测量需要没有任何碎屑的清澈溶液。小心转移上清液，不要干扰颗粒；额外离心 1 分钟可提高提取物的澄清度。请参阅程序部分。
在混合物中彻底混合不同的反应组分将有助于获得良好的线性动力学。
APX 检测需要在反应开始后快速处理。将准备好的微孔板放入读数器中；加入 H 2 O 2溶液后立即开始测量。
在开始分析之前，一定要新鲜制备 MDHAR 检测缓冲液。
测量 265、290 和 340 nm 波长的吸光度需要紫外线透明微孔板。使用非 UV 透明微孔板会导致检测失败。
在计算蛋白质浓度时，在使用线性相关公式之前，使用 0 mg/ml BSA 标准的吸光度值空白样品吸光度值，例如，如图 5 所示。
该协议可用于分析烟草、拟南芥、玉米、菠菜和番茄植物的叶或芽组织。将植物组织研磨成细粉并清除植物提取物以去除干扰碎片对于成功的检测至关重要。

食谱

水稻生长用人造土壤（见表2）

表 2. 水稻生长人工土壤的组成。

AO 可溶部分提取缓冲液，AO-SF
100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 6.5。
将 100 ml 的 100 mM NaH 2 PO 4 （13.799 g NaH 2 PO 4 ·H 2 O 溶解在 1 L 去离子 H 2 O 中）添加到 250 ml 烧杯中，并使用 100 mM Na 2 HPO 4 (14.196 g Na 2 HPO 4溶解在 1 L 去离子 H 2 O) 溶液中。
用于离子结合部分的 AO 提取缓冲液，AO-IBF
100 mM 磷酸钠缓冲液，含有 1 M NaCl，pH 6.5。
将 5.844 g NaCl 溶解在 100 ml AO 提取缓冲液中。
AO 测定缓冲液和物质
100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 5.6。
在无菌蒸馏水中将 AsA 溶解至 2 mM；为每一轮分析新鲜准备。
APX/MDHAR 提取缓冲液
50 mM 磷酸钾缓冲液，含有 1 mM EDTA 和 1 mM AsA，pH 7.8。
将 0.2 ml EDTA 储备溶液（500 mM，pH 8）和 1 ml AsA 储备溶液（100 mM）加入 98.8 ml 50 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.8）中。
APX 测定缓冲液和物质
100 mM 磷酸钾缓冲液，含有 0.12 mM AsA，pH 6.8。
0.03% (V/V) H 2 O 2溶液；准备新鲜。
来自葫芦科植物的AO 。酶液
将 1 U/µl AO 溶解在用 100 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 6.0) 制备的 50% 甘油中。
MDHAR 测定缓冲液和物质
50 mM Tris-HCl 缓冲液，含有 2.5 mM AsA 和 0.125 U 抗坏血酸氧化酶，pH 7.6；为每一轮分析新鲜准备。
1 mM NADH 在 50 mM Tris-HCl 缓冲液中，pH 7.6；准备新鲜。
DHAR 提取缓冲液
50 mM Tris-HCl 缓冲液，含有 100 mM NaCl、2 mM EDTA 和 1 mM MgCl 2 ，pH 7.4。
DHAR 测定缓冲液和物质
50 mM 磷酸钾缓冲液，pH 6.5。
5 mM DHA 溶解在测定缓冲液中；准备新鲜。
溶解在测定缓冲液中的 50 mM 还原 GSH；准备新鲜。

致谢

该协议是根据我们之前出版物（Wu等人，2017 年）中的方法部分建立的，并稍作修改。

利益争夺

作者声明没有财务或非财务竞争利益。

参考

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