材料和试剂

mRNA-LNP生产：
T7 RNA聚合酶（Megascript，Ambion，目录号：AMB13345）
一甲基假尿苷（m1Ψ）-5'-三磷酸（TriLink，目录号：N-1081）
带有 2'-O-甲基转移酶的 m7G 封盖试剂盒（ScriptCap，CellScript，目录号：C-MSC11610）
快速蛋白质液相色谱 (FPLC)（Akta Purifier，GE Healthcare）
琼脂糖（Denville Scientific，目录号：CA3510-8）
TAE 缓冲液（Promega，目录号：V4271）
mRNA-LNP 储存于 -80°C
注意：所有核苷经修饰的mRNA小号都可以从RNAx创建德鲁博士威斯曼公司。

用于 mRNA 合成的 eGFP DNA 序列：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACG AGCTGTACAAG

mRNA-LNP的体内给药：
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS 1×），无菌，（-）氯化钙，（-）氯化镁（Gibco，目录号：14190-144）
Isothesia Isoflurane，USP（Henry Schein Animal Health，目录号：029405）
1/2cc 低剂量胰岛素注射器，0.5 ml，29 G，无菌（Exel International，目录号：26028）

组织固定、冷冻保存、切片和切片上的免疫荧光：
FluorSave 试剂（EMD Millipore Corp，MilliporeSigma TM ，目录号：345789-20ML ）
Triton-X 100（Sigma Life Science，目录号：T9284-100ML）
16% 多聚甲醛水溶液，EM 级（电子显微镜科学，目录号：15710 ）
Tissue Plus 4585 OCT 化合物，透明（Fisher Healthcare，目录号：23-730-571）
蔗糖（MP Biomedicals，LLC，目录号：0219401891 ）
正常驴血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，目录号：017-000-121）
注意：冻干粉在 2-8°C 下储存。再水化后，分装未稀释的血清，并在 -20°C 或以下保存。
DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸（Invitrogen，Molecular Probes，目录号：D3571）
注意：粉末在室温下储存。再水化后，分装未稀释的溶液，并储存在 -20°C 或以下。

肝脏灌注和流式细胞术：
静脉内（IV）给药组（Med Vet International，IV10，Fisher Scientific，目录号：NC0196893）
导管，IV，24 G × 3/4"，无菌，SURFLO ® ，（Terumo TM ，目录号：SROX2419CA ）
泵管，12 个 1.52 毫米 PVC 流量管的 3P 组（Gilson Inc，目录号：3P F117942 ）
40 µm 无菌细胞过滤器（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：22-363-547）
100 µm 无菌细胞过滤器（Fisher Scientific，Corning，目录号：07-201-432 ）
60 mm 培养皿（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：FB0875713）
1cc 胰岛素注射器，1.0 ml，28 G，无菌（Exel International，目录号：26027）
带有细胞过滤器卡扣帽的圆底聚苯乙烯试管（Falcon，目录号：352235 ）
肝灌注培养基 1×，在程序中称为“溶液 1 ”，每只小鼠约 30 毫升（ThermoFisher Scientific，Gibco，目录号：17701038）
注意：2-8°C 避光保存。
Earl 平衡盐溶液（EBSS），Ca 2+ ，Mg 2+ ，酚红，pH 7.4，在程序中称为“溶液 2 ” ，每只小鼠约 20 毫升（ThermoFisher Scientific，Gibco，目录号：24010043）
注意：储存在 2-8°C。
肝消化培养基，在程序中称为“溶液 3 ”，每只小鼠约 50 毫升（ThermoFisher Scientific，Gibco，目录号：17703034）
注意：储存于-20°C 至 -5°C ，避光。
肝细胞洗涤培养基（ThermoFisher Scientific，Gibco，目录号：17704024）
注意：2-8°C 避光保存。
IV型胶原酶（Worthington Biochemical Corporation，目录号：LS004188 ）
注意：储存在 2-8°C。
DNase I，脱氧核糖核酸酶 I，来自牛胰腺（Sigma- A ldrich，目录号：DN25）注意：储存在 -20°C。
胰蛋白酶-EDTA（1×），0.05%，酚红（ThermoFisher Scientific，Gibco，目录号：25300-054）
注意：储存于 -5°C 至 -20°C 。
磷酸盐缓冲盐水（PBS），10×溶液（Fisher Scientific，Fisher BioReagents，目录号：BP39920）
注意：在大多数应用中使用前稀释至 1 倍工作溶液。
小型棉尖涂抹器，3 英寸es ，木轴，灭菌（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：23-400-118）
注意：高压灭菌。
盐酸氯胺酮（Covetrus，目录号：056344）
注：受控物质。
盐酸赛拉嗪（MP Biomedicals，目录号：0215830701 ）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS 1×），无菌，（-）氯化钙，（-）氯化镁（Gibco，目录号：14190-144）
Fc Block，CD16/CD32 Purified Rat anti-Mouse（BD Biosciences，BD Pharmingen，目录号：553141 ）
注意：在 4°C 下储存未稀释。
乙二胺四乙酸（EDTA），0.5M，UltraPure TM ，pH 8.0（Life Technologies，Invitrogen，目录号：15575-038）
胎牛血清（FBS）表征（GE Life Sciences，HyCLone，目录号：SH30071.03）
注意：储存在-10°C或以下。
Zombie NIR Fixable Viability Dye（Biolegend，目录号：423105）
注意：-20°C 避光干燥处保存。
红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max（Millipore Sigma，Sigma Aldrich，目录号：R7757-100ML ）
抗体（表 1）

表 1. 用于冷冻固定组织 (IF-Fr) 和流式细胞术 (FC) 免疫荧光的抗体列表

DNase I 原液（10 毫克/毫升）（见配方）
NPC 消化液（见配方）
洗涤介质（见配方）
氯胺酮/赛拉嗪麻醉溶液（见配方）
FACs 缓冲液（见配方）
4% 多聚甲醛（见配方）
3% 普通驴血清（见配方）
DAPI 原液（见配方）

设备

磁力搅拌棒（Fisherbrand，目录号：14512132）
HotHands 暖手器，用作麻醉小鼠的加热垫（Kobayashi Consumer Products, LLC, hothands.com）
流式细胞仪（Stratedigm，S1000 Exi 3 激光，10 检测器）
蠕动灌注泵（Gilson，型号：Minipuls 3，目录号：F155005）
高速冷冻离心机（Eppendorf，型号：5804R，目录号：022623508）
荧光显微镜（尼康，型号：Eclipse Ni-E）
低温恒温器（Leica，目录号：CM1950）
磁力搅拌器（Research Productions Inc.，Biomega）
Zetasizer Nano ZS 动态光散射仪 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)
电泳机（Bio-Rad）

软件

适用于 Mac 的FlowJo TM软件，版本 10.7.1。(Becton, Dickinson and Company, Ashland, OR. 2019. https://www.flowjo.com/ )
斐济- ImageJ的图像处理softwar È （Schindelin等人。，2012）

程序

A. mRNA 生产
在编码 eGFP 的线性化质粒上使用 T7 RNA 聚合酶生成 mRNA。
转录 mRNA 以包含 101 个核苷酸长的 poly(A) 尾巴。使用一甲基假尿苷 (m1Ψ)-5'-三磷酸代替 UTP 来生成含有修饰核苷的 mRNA。
使用带有 2'-O-甲基转移酶的 m7G 加帽试剂盒获得 cap1 的帽 RNA。
通过快速蛋白质液相色谱法 (FPLC) 纯化 mRNA。
通过琼脂糖凝胶电泳分析所有 mRNA，并在 -20°C 下冷冻保存。
注意：所有核苷经修饰的mRNA小号都可以从RNAx创建由卡塔琳Kariko博士和德鲁博士威斯曼公司。核苷修饰的 mRNA 序列列于材料和试剂中。

B. mRNA 的 LNP 封装
使用自组装过程将 FPLC 纯化的含 m1Ψ 的 mRNA 封装在 LNP 中，在该过程中，pH = 4.0 的 mRNA 水溶液与溶于乙醇的脂质溶液快速混合。
注意：本研究中使用的 LNP 含有可电离的阳离子脂质（pKa 范围为 6.0-6.5，Acuitas Therapeutics 专有）/磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-脂质。专有的脂质和 LNP 组合物在题为“用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒配方”的美国专利 US10,221,127 中有描述( https://www.lens.org/lens/patent/183-348-727- 217-109）。使用 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern , UK) 仪器通过动态光散射测量它们的直径约为 80 nm 。Acuitas 愿意与希望测试这项工作中使用的 LNP 的学术研究人员合作。

mRNA-LNP的体内给药
使用前立即在冰上解冻 mRNA-LNP。
每次实验前，在无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中稀释冰上新鲜的 mRNA-LNP。
注意：将 mRNA-LNP 稀释到工作浓度，以便每只小鼠注射不超过 50 μl。额外考虑注射器尖端的体积损失。我们在每只约 20 g 体重的小鼠中使用了 5-10 μg mRNA-LNP。
使用异氟醚室麻醉小鼠 (图 1)。
从麻醉室中取出小鼠，并使用 1/2cc 胰岛素注射器将 mRNA-LNP 快速注入眶后窦。
注意：尾静脉注射也是一种有效的静脉给药方法。

图 1. 用于麻醉小鼠的异氟醚设置

组织固定、冷冻保存、切片和切片上的免疫荧光（图3A 中的数据）
直接在 1× PBS 稀释的 4% 多聚甲醛 (PFA) 中收集完整的肝脏和其他器官，包括脾、肠和肺。
注意：在 mRNA-LNP 注射后 5 小时到 7 天之间可以看到来自 mRNA-LNP 的蛋白质表达。因此，可以在该时间范围内的任何时间点收集组织，具体取决于产生的蛋白质的稳定性和所需的读数时间。mRNA-LNPs 在雄性和雌性肝细胞中同样表达良好。
在室温下固定至少 2 小时。
注意：最好在 4°C 下过夜。
对于冷冻保存，用 1× PBS 清洗组织 3 次，然后在 15% 蔗糖溶液中浸泡 15 分钟。
将组织转移到 30% 蔗糖溶液中并保持直到它们沉到底部。
注意：如果组织非常脂肪，它们可能不会下沉；在这些情况下，等待一夜就足够了。
将组织嵌入 OCT 化合物中。块可以储存在 -80°C 直到进一步需要。
用低温恒温器切割 5 μm 肝脏切片，并将载玻片储存在 -20°C 直至需要进行免疫染色。
在室温下解冻冷冻载玻片 30 分钟并干燥。
将载玻片浸入 1× PBS 中 10 分钟。
透用0.3％的组织Ť瑞通- X在1×PBS中10分钟。
在 1× PBS 中冲洗载玻片 3 次，每次 10 分钟。
用 3% 正常驴血清在 1× PBS 中稀释 30 分钟，封闭组织。
将切片在 4°C 下用鸡抗小鼠 GFP 抗体以 1:300 的浓度稀释在 1×PBS 中过夜孵育，如表 1 所示。其他标记可用于识别转染的特定细胞类型，例如图 3A 中概述的那些.
用 1× PBS 清洗载玻片 3 次，每次 10 分钟。
用荧光标记的抗鸡二抗在室温下避光孵育 1 小时，浓度为 1:500，在 1× PBS 中稀释。
用 1× PBS 清洗载玻片 3 次，每次 10 分钟。
与 DAPI（1:3,000 在 1×PBS 中）孵育 3-5 分钟，避光。
用 1× PBS 冲洗玻片两次，每次 5 分钟。
使用 FluorSave 试剂安装。
使用荧光显微镜对幻灯片进行成像。

肝脏灌注
在水浴中将所有溶液加热至 40°C。
注意：溶液 1 和 2 保持在 4 ° C。溶液 3 在使用前新鲜解冻。为确保整个手术温度为 37°C，请将水浴温度设置为 40°C。在进行灌注时保持溶液的温度。
用 70% 乙醇对泵管进行消毒，然后用溶液 1 清洗。
将 IV 给药装置的一端连接到导管，另一端连接到泵管并填充溶液 1。
注意：一旦动物准备好解剖，就用溶液填充，以避免溶液中的温度下降。
使用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉溶液以 100 μl/20 g 小鼠体重麻醉小鼠，并将小鼠放在加热垫上以保持体温。
注意：所述的一个nesthetic溶液由具有一个氯胺酮浓度：甲苯噻嗪的浓度比; 见下面的食谱。通过捏脚检查鼠标的响应能力。
一旦固定水分深麻醉下用胶带鼠标的四肢-吸收表面。打开腹部和胸部区域，用无菌棉尖涂抹器将肠子推到一边，从而暴露血管。在胸部区域和肝脏下方的门静脉中找到下腔静脉 (IVC) (图 2)。
注意：IVC 是一条大血管，将血液从下肢输送到心脏的右心房，在横膈膜和心脏之间延伸的胸腔中很容易区分。

图 2. IVC 的识别 (A) 和插管 (B) 以及门静脉的切割 (C)

如图 2 所示，小心地使用导管对 IVC 进行插管，并以 4 ml/min（泵设置 6.5-6.8）启动泵的流量。肝脏会在几秒钟内充满溶液变成褐色。快速定位并切断门静脉。用胶带将导管和管道牢固地固定下来。
大约 30 ml 的溶液 1 后，运行大约 10 ml 的溶液 2，最后运行溶液 3 10-15 分钟。
注意：要测量肝脏消化的进度，请在用溶液 3 灌注 10 分钟后用棉签涂抹器戳肝脏。未消化的肝脏将保持弹性，而完全消化的肝脏将保留凹痕。
当肝脏被消化后，取出导管，切除胆囊，然后小心地取出肝脏，如果可能的话不要破坏肝囊。
将肝脏转移到含有 10 毫升溶液 3 的 60 毫米培养皿中。用镊子破坏肝脏胶囊并通过旋转培养皿洗出肝细胞。收集肝细胞并通过 100 µm 过滤装置过滤到含有 10 ml 冷洗涤培养基的无菌 50 ml 锥形管中（参见下面的食谱）。
对于非实质细胞 (NPC) 的研究，收集保留在过滤器上的组织，并按照步骤 E12 中的指示进一步消化。
在 4°C 下以 50 × g离心2 分钟，沉淀肝细胞。收集上清液并以300 × g离心5 分钟，然后重悬在冷洗涤培养基中。这是 NPC 部分 1。将肝细胞沉淀重悬在 50 ml 冷洗涤培养基中。
将步骤 E10 中收集的组织碎片转移到 60 毫米培养皿中。加入 5 ml NPC Digest Solution（参见下面的食谱）。添加磁力搅拌棒并在 37°C 下搅拌 10 分钟。10 分钟后，上下吸管溶液以帮助分解剩余的组织碎片。
注意：使用 1 ml 移液器并将 1 ml 移液器吸头的末端切一点，以帮助拾取组织碎片。移液器上下几次以分离组织并将 NPC 释放到溶液中。
通过 40 µm 过滤器收集分离的细胞。以 300 × g旋转并将沉淀重悬在冷洗涤培养基中。这是NPC分数2。
将步骤 E13 中剩余的组织转移到装有 5 ml 0.05% 胰蛋白酶的新培养皿中，并在 37°C 下搅拌孵育 10-15 分钟。搅拌后，上下吸移溶液以帮助分解剩余的组织碎片。
通过 40 µm 过滤器收集新分离的细胞。以 300 × g旋转并重悬于冷洗涤培养基中。这是NPC分数3。
池在步骤E11，E13收集所有级分，NPC ，以及E15，通过离心沉淀细胞，并在5毫升冷的洗涤介质重悬。这给出了总 NPC 分数。

流式细胞术（图3B 中的数据）
以 50 × g离心肝细胞，以 300 × g离心NPC，并重悬在 1-2 ml RBC 裂解缓冲液中。
在室温下在裂解缓冲液中保持 2 分钟，然后加入 10 ml 至 20 ml 洗涤培养基。
通过以 50 × g离心肝细胞和 300 × g离心NPC 来洗涤细胞。根据分析所需的孔/样品数量，在 1-2 ml PBS 中重悬肝细胞和 NPC。
在室温下在 Zombie NIR 染料中孵育分数 30 分钟。用洗涤培养基洗涤，适当离心，然后在 FACS 缓冲液中重悬（参见下面的食谱）。
根据需要在 96 孔板的每个孔中分配 100 μl 细胞悬液。
每孔加入 2 μl Fc 块并等待 10 分钟。
添加相应的流式细胞仪抗体并在室温下孵育 20 分钟。例如，图 3B 概述了内皮细胞、白细胞和泛免疫细胞的标记物。
700 × g离心板4 分钟。
去除上清液，每孔加入 100 μl FACS Buffer。
700 × g离心板4 分钟。
去除上清液，每孔加入 100 μl FACS Buffer。
彻底重悬，然后将细胞转移到用 300 μl FACS 缓冲液制备的 FACS 管的过滤器顶部。
在流式细胞仪上运行细胞。

图 3. IV eGFP mRNA-LNP 注射后 5 小时鉴定转染的肝细胞类型。A.联合免疫染色EGFP（绿色）和肝细胞类型-特异性标记物（红色，HNF4A为肝细胞，CK19用于胆管，用于CD31内皮细胞和F4-80为KC）; 显示了 200 倍放大图片和特写。白色箭头表示共染细胞。B. 代表性流式细胞术分析显示CD11b +中 eGFP +细胞的百分比（最有可能将 KC/巨噬细胞识别为炎症很小，因此不太可能存在 CD11b +中性粒细胞和 CD11b + NK 细胞）、CD45 + （用于血细胞）、和 CD31 + （用于内皮细胞）来自注射 Poly(C) RNA-LNP 或 eGFP mRNA-LNP 的小鼠的 NPC 部分。所有 NPC 级分都针对存在于 Zombie NIR 阴性群体中的活细胞进行门控。数据表示为平均值每组 n = 3 只小鼠的 ± SEM。比例尺代表所有 200 倍放大图像的 100 µm。数据最初发表在 Nature Communications 上（Rizvi等人，2021 年）。

食谱

DNase I 原液 (10 mg/ml)
将 100 mg DNase I 悬浮在 0.15 M NaCl 中。
以适当的体积分装 DNase I，以防止频繁冻融。
将等分试样储存在 -20°C。
NPC 摘要解决方案
EBSS 中含有 2.5 mg/ml 胶原酶 IV 和 0.1 mg/ml DNase I（每只小鼠约 5 ml）；将 50 μl DNase I (10 mg/ml) 和 12.5 mg 胶原酶 IV 添加到 5 ml EBSS。
洗涤介质
肝细胞洗涤培养基中的 10% FBS 和 0.1 mg/ml DNase I；在 50 ml 肝细胞洗涤培养基中加入 5 ml FBS 和 500 μl DNase I (10 mg/ml)。
氯胺酮/赛拉嗪麻醉溶液
100 μl/20g 体重的小鼠鸡尾酒；对于一个10毫升鸡尾酒，加1.75毫升氯胺酮（100毫克/毫升），加入0.25ml甲苯噻嗪（100毫克/毫升）至8毫升盐水或无菌水。
FAC缓冲液
2 mM EDTA + 2% FBS 在 1× PBS 中；将 1 ml FBS 和 200 μl 0.5M EDTA 添加到 50 ml 1× DPBS 中
4% 多聚甲醛
用 PBS 稀释 16% 多聚甲醛。
3% 普通驴血清
重新构建冻干-通过添加10.0毫升卫生署干燥正常驴血清，以100％的储液浓度2在-80℃下O.分装和储存。使用 1× PBS 将原液稀释至 3% 工作浓度。
DAPI 原液
要制作 5 毫克/毫升 DAPI 储备溶液（10.9 mM 的二乳酸盐），将 DAPI（10 毫克）的内容物溶解在 2 毫升的去离子水（dH 2 O）中。分装并储存在 -80°C。使用 1:3,000 稀释的溶液对细胞核进行染色。

致谢

该协议是从原始的研究论文“鼠肝脏修复通过使用脂质纳米粒子复合的核苷修饰的mRNA的肝细胞的再生路径的瞬时激活”衍生的（里兹维等人。，2021）。这项工作得到了 Dimes 研究补助金 #6-FY14-530、NIH NIDDK R01DK124361-01A1 和 Alpha-1 基金会研究补助金 ID614163 的支持。我们感谢 BUSM 流式细胞术核心的 Brian R. Tilton 在 NIH Grant 1UL1TR001430 和 Drs 的支持下提供技术援助。CReM 的 Greg Miller 和 Marianne James，由 R24HL123828 和 U01TR001810 资助。Elissa Everton 和 Anna R. Smith 得到 TL1TR001410 奖的支持。

利益争夺

根据宾夕法尼亚大学的政策和程序以及我们作为研究人员的道德义务，我们报告 Drew Weissman 被命名为专利，这些专利描述了使用核苷修饰的 mRNA 作为提供治疗性蛋白质的平台。与本研究相关，Drew Weissman 和 Norbert Pardi 也在一项专利中命名，该专利描述了在脂质纳米颗粒中使用修饰的 mRNA 美国专利 US8,278,036，题为“含有修饰核苷的 RNA 及其使用方法” 。Mitchell Beattie 和 Ying Tam 是 Acuitas Therapeutics 的员工，该公司专注于开发用于治疗应用的脂质纳米颗粒核酸递送系统。所有其他作者声明没有竞争利益。

伦理

所有动物研究均获得波士顿大学 IACUC 的批准（PROTO201800461 批准至 2023 年 10 月 25 日），并符合适用的地方、州和联邦法规。

参考

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