材料和试剂

1.5 ml管架
15毫升试管架
50 ml管架
玻璃珠（MP Biomedicals，目录号：MP07DP1070）
丁腈手套（FisherBrand ，目录号：19-130-1597）
乙醇喷雾瓶
MilliQ 喷水瓶
漂白剂喷雾瓶
冰桶
泡沫液氮容器
1.5 ml半微量塑料比色杯（Fisherbrand ，目录号14955127）
96孔板（Corning，目录号：08-757-230）
镜头纸（FisherBrand ，目录号：11-995）
玻璃显微镜载玻片（Fisherbrand ，目录号：12548B）
1.5 ml高压灭菌的Eppendorf管（Eppendorf，目录号：05-408-129）
1.5 ml蛋白质LoBind 管（Eppendorf，目录号：22431081）
15 ml锥形管（Thermo Scientific，目录号：12-565-268）
50 ml锥形管（Thermo Scientific 目录号：339652）
50 ml圆底塑料离心管（Thermo Scientific，产品目录号：05-529C）
移液器技巧
0.1-10 µl（USA Scientific，目录号：1121-3810 ）

2-20 µl（Fisherbrand ，目录号：02-707-432 ）

20-200 µl （Fisherbrand ，目录号：02-707-430 ）

200-1 ，000微升（FISHERBRAND ，目录号：02-707-40）

血清移液器
5毫升，10毫升，25毫升和50毫升血清移液器（Fisher b rand ，型号：13-678-11）
BL21（DE3）Ril 电池（安捷伦，目录号：230245）
pDUET vect 或（Addgene Plasmid＃29629）中的FUS表达构建体（图2A）
甲在β2表达构建的pGEX-TEV 载体（图2B）
LB液体介质（Fisher Chemical，目录号：BP9723-2）
氨苄青霉素（Gold Bio，目录号：A-301-25）
LB +氨苄西林琼脂板
溶菌酶（Gold Bio，目录号：L-040-25）
冰
液氮
布拉德福德Rea的绅士（热小号系统求解，目录号：PI23236）
显微镜浸油（Carl Zeis s，目录号：12-070-397）
Bio-spin色谱柱（Bio-Rad，目录号：7326008）
HiTrap -Q阴离子交换色谱柱（GE H ealthcare，目录号：17115301）
IPTG（GoldBio ，目录号：367-93-1）
磷酸盐缓冲盐水片（Fisher Scientific，目录号：BP2944100）
D-（+）- 海藻糖（Fisher Scientific，目录号：BP2687100）
谷胱甘肽琼脂糖4快速流动珠（GE Healthcare，目录号：17-5132-01）
NaCl （Fisher Scientific，目录号：S271-3）
EDTA （Fisher Scientific，目录号：BP2482500）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP2294）
DTT （Gold Bio，目录号：DTT10）
抑肽酶（Gold Bio，目录号：P-020-25
EGTA （密理博，目录号：324626-25GM）
MgCl 2 （Fisher BioReagents ，目录号：BP214-500）
蛋白酶抑制剂片剂（Thermo Scientific，目录号：A32955）
咪唑（Fisher Scientific，目录号：O3196-500）
还原型谷胱甘肽（Fisher Scientific，目录号：AC120000250）
FUS洗涤缓冲液（请参阅配方）
FUS洗脱缓冲液（请参阅配方）
Kapβ2 重悬缓冲液（请参阅食谱）
Kapβ2ATP 缓冲液（请参阅食谱）
Kapβ2 缓冲液A（请参阅食谱）
Kapβ2 洗脱缓冲液（请参见配方）
TEV缓冲液（请参阅配方）

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003111--1463林国641755 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.实验中使用的构建体的质粒图。A.pDUET 载体中FUS表达构建体的质粒图。B.质粒图谱的甲中β2表达构建的pGEX-TEV 载体。

设备

50毫升烧杯（派热克斯（Pyrex），货号：CLS100050）
100毫升烧杯（派热克斯（Pyrex），货号：CLS100050）
250 ml锥形瓶（派热克斯（Pyrex），货号：4980250）
2800毫升锥形瓶（派热克斯（Pyrex），目录号：CLS44202XL）
纳尔金1 L 塑料离心罐（Thermo Scientific，目录号：11-825B）
0.1-10微升，2-20微升，20-200微升，和200-1 ，000微升的移液管
5424 R离心机（埃彭多夫（Eppendorf），目录号：2231000655）
离心机5810 R（Eppendorf，目录号：022625004）
Sorvall Lynx 4000超速离心机（Thermo Scientific，目录号：75-006-580）
Sorvall BP 8离心机（Thermo Scientific，目录号：75007681）
带SmartBlock的Thermomixer TM C （Eppendorf，目录号：2231000667）
MaxQ TM 4450台式轨道振动器（Thermo Scientific，目录号：SHKE4450）
伊诺® 44系列摇床（新不伦瑞克省，目录号：M1282）
Heratherm TM 通用协议微生物培养箱（Thermo Scientific，目录号：51028063）
左轮手枪/旋转器（Thermo Scientific，目录号：88881001）
多功能管旋转器（Fisherbrand ，目录号：88-861-049）
数字涡旋混合器（Fisherbrand ，目录号02-215-418）
Cimarec + TM 搅拌加热板S（Thermo Scientific，目录号：P88857100）
Entris TM 精密天平（Sartorius TM ，目录号：ENTRIS423i-1S）
Accumet ® AB150的pH台式计（FISHERBRAND ，目录号：13-636-AB150）
模型705声波粉碎仪（FISHERBRAND ，目录号：FB705110）
160紫外可见分光光度计（Biomate ，目录号：840-301000）
Tecan公司TM 星火® 多模酶标仪
HP Z230塔式工作站
LEICA TM DMi8 S平台倒置显微镜
戴尔英特尔酷睿i7
冷室
4°C冰箱
-20°C冷冻室
-80°C冷冻室
AKTA纯FPLC

软件

电子邮件（Microsoft Office）
Tecan SparkControl
徕卡LAS X硬件
AKTA独角兽

再修改的è

FUS纯化
在带有TEV可切割位点的pDuet 载体中生成FUS表达构建体，从而产生GST-TEV-FUS构建体。从大肠杆菌BL21- CodonPlus（DE3）-RIL细胞（安捷伦）表达和纯化GST-TEV-FUS蛋白的方法如下。
在37 °C的6 L Lennox Broth（LB）中培养表达FUS的细胞，并以250 rpm的速度摇动，直到OD 600 在0.4-0.6之间。用1 ml的1 M IPTG（最终浓缩为1 mM IPTG）诱导细胞，然后在15°C下以250 rpm摇动生长过夜。
在4°C 下以4,000 rpm 旋转细胞20分钟。要裂解细胞，将沉淀物重悬于FUS洗涤缓冲液（配方1）中，每1毫升重悬细胞加入20克溶菌酶，并在冰上孵育30分钟。开/关以30 s的间隔超声处理细胞4分钟（振幅35）。然后在4°C下以16,000 rpm旋转裂解的细胞20分钟。
为了结合和分离带有GST标签的蛋白，将5 ml谷胱甘肽琼脂糖4快速流动珠（GE Healthcare）添加到裂解液上清液中，并将混合物在4°C下孵育90分钟。在4°C下以1,792 xg的速度离心珠3分钟，并丢弃上清液。用洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，在4°C下以1,124 xg离心2分钟。
加入5 ml FUS洗脱缓冲液（配方2）洗脱FUS，并在室温下孵育20分钟。在玻璃管中的Bio-spin 色谱柱（Bio-Rad）中于4°C下在1,124 xg的离心缓冲液中将珠粒离心2分钟，以收集洗脱液。
通过Bradford分析测定纯化的FUS。在液氮中快速冷冻纯化的FUS，并储存在-80°C。蛋白质可以使用长达3年。冻融循环应最小化。

Kapβ2 纯化
生成甲在β2表达构建的pGEX 与TEV-可切割位点-TEV向量，产生了GST-TEV- 甲β2构建体。表达并纯化此甲从β2构建体大肠杆菌BL21- CodonPlus（DE3）-RIL细胞（安捷伦）如下。
生长甲β2表达细胞在6升伦诺克斯肉汤（LB）的在37℃下以250rpm振荡培养直至OD 600 为0.6-0.8之间。用1 ml的1 M IPTG（最终浓缩为1 mM IPTG）诱导细胞，然后在25°C下以250 rpm摇动生长过夜。在4°C下以4,000 rpm旋转细胞20分钟。
要裂解细胞，请在重悬缓冲液（配方3）中重悬沉淀，每1毫升重悬细胞添加20克溶菌酶，然后在冰上孵育30分钟。在振幅15、30 s开/关下超声处理细胞1分钟30 s，然后在4°C下以16,000 rpm旋转裂解的细胞60分钟。
将裂解液上清液与5 ml谷胱甘肽琼脂糖4快速流动珠（GE Healthcare）在4°C下孵育90分钟。在4离心机珠，500 ×g下在4℃下3分钟，弃去上清液。
洗珠用25ml重悬每个缓冲器四次，通过在1124离心XG 用于在4℃下3分钟。加入10 ml ATP缓冲液（配方4），在室温下静置10分钟，然后在4°C下以1,124 xg离心3分钟。分别用20 ml ATP缓冲液洗涤小珠两次，方法是在4°C下以1,124 xg离心3分钟。通过在4°C下以1,124 xg离心3分钟，每次用10 ml缓冲液A洗涤磁珠3次（配方5）。
洗脱甲β2通过加入20ml 甲β2洗脱缓冲液（配方6），并在4孵育30分钟℃。在玻璃管中的Bio-spin色谱柱（Bio-Rad）中于4°C下以1,124 xg的离心力将珠子在洗脱缓冲液中离心2分钟，以收集洗脱液。
测量纯化的Kapβ2 的浓度，然后每10 µg Kapβ2 加入1 µg TEV 。将混合物分装到低绑定试管中，在30°C下孵育过夜，以裂解GST标签。
裂解的Kapβ2 通过HiTrap -Q阴离子交换色谱柱（GE Healthcare）进一步纯化。

通过FUS聚集的抑制甲β2
在4°C 下以16,100 xg 的转速旋转FUS 10分钟，然后将上清液转移到新的试管中。通过Bradford测定法测量FUS和Kapβ2 的浓度，并使用BSA生成校准曲线。
在96孔板，空白孔，标准FUS孔和实验孔中设置聚集测定。
在每个实验孔中，添加4μM的FUS （表1），4μM 甲β2 （表1），5微升缓冲液TEV（配方7），1.5微升100mM DTT，和0.8微克TEV的。用FUS缓冲液（配方2）填充至100 µl。轻轻上下吹打混合。
在空白孔中，加入5 µl TEV缓冲液，1.5 µl 100 mM DTT和0.8 µg TEV。用Kapβ2 缓冲液匹配添加到实验孔中的Kapβ2 的体积。用FUS缓冲液填充至100 µl。轻轻上下吹打混合。
在标准FUS孔中，添加4 µM FUS，5 µl TEV缓冲液，1.5 µl 100 mM DTT和0.8 µg TEV。用Kapβ2 缓冲液匹配添加到实验孔中的Kapβ2 的体积。用FUS缓冲液填充至100 µl。轻轻上下吹打以混合。
设置TECAN p 后期阅读器。将印版类型识别为Costar 96 Flat Black（无盖，无湿度盒）。进行90个循环的动态循环编程，固定间隔为00:01:00，无晃动。在每个循环中在395 nm处编程程序吸光度读数。将板插入板读取器，并在室温下进行聚集测定。
1.5小时后，数据将自动存储在excel电子表格中（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003111--1463林果641755 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. FUS聚集的浊度测量显示，Kapβ2 抑制FUS聚集。A.从TECAN导出的原始数据。B.背景扣除后的数据。C.标准化后的数据。

FUS的纤丝解聚由甲β2
在4°C 下以16,100 xg 的转速旋转FUS 10分钟，然后将上清液转移到新的试管中。测量FUS的浓度和浓度甲β2。
在96孔板，空白孔，标准FUS孔和实验孔中设置聚集测定。
在每个实验孔中，添加4 µM FUS （表1），5 µl TEV缓冲液（配方7），1.5 µl 100 mM DTT和0.8 µg TEV。填充FUS缓冲液（配方2），以便添加4 µM Kapβ2 将产生100 µl的总体积（表1）。轻轻上下吹打混合。
在空白孔中，加入5 µl TEV缓冲液，1.5 µl 100 mM DTT和0.8 µg TEV。填充FUS缓冲液，以便添加4 µM Kapβ2 将产生100 µl的总体积。轻轻上下吹打混合。
在标准FUS孔中，添加4 µM FUS，5 µl TEV缓冲液，1.5 µl 100 mM DTT和0.8 µg TEV。填充FUS缓冲液，以便添加4 µM Kapβ2 将产生100 µl的总体积。轻轻上下吹打以混合。
设置TECAN读板器。将印版类型标识为Costar 96 Flat Black（无盖，无湿度盒）。编程90个循环的动态循环，固定间隔为00:01:00。在每个循环中在395 nm处编程程序吸光度读数。将板插入板读取器，并在室温下进行聚集测定。
在90个循环的最后，向每个实验孔中加入4 µM Kapβ2 。添加甲β2缓冲空白以及与STA ndard FUS好，匹配的容积金甲β2。轻轻上下吹打以混合。编程另一个90循环的动力学循环，固定间隔为00:01:00。在每个循环中在395 nm处编程程序吸光度读数。将板插入板读取器并进行解离分析（图4）。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003111--1463林果641755 \ Figs jpg \图4.jpg

图4 的分解FUS显示浊度测量甲β 2点反转FUS聚集。A.从TECAN导出的原始数据。B.背景扣除后的数据。C.标准化后的数据。

Kapβ2 反向FUS液-液相分离和异常相变
在4°C 下以16,100 xg 的转速旋转FUS 10分钟，然后将上清液转移到新的试管中。测量浓度。
用FUS缓冲液（配方2）将FUS 稀释至10 µM （表1）的浓度。移液管加入30μl 的10 μMFUS到一个新的试管中。将试管在室温下放置在工作台上约2小时。
设置LEICA显微镜以使用100倍油浸物镜观察液滴。
将10 µM FUS样品中的10 µl吸到滴油上方的盖玻片上。
观察液-液滴的形成。液滴流动并在接触时融合。
加入1μl100 μM 甲β2 （表1）到各10μlFUS 样品盖玻片上拆卸FUS液滴和反向FUS液-液相分离（图5A）。Kapβ2 可以在30 s内分解预制的FUS液滴。
在室温下孵育6小时后，液滴会老化成水凝胶。在盖玻片上加10 µl 10 µM FUS样品，观察水凝胶。加入1μl100 μM 甲β2到盖玻片上拆卸FUS水凝胶和逆向FUS异常的相分离（图5B）的加入10μlFUS样品。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003111--1463林国641755 \ Figs jpg \图5.jpg

图5. 甲β2反转FUS的LLPS和异常相变。前和添加后FUS液滴A. DIC图像的甲β2。B. 在添加Kapβ2 之前和之后的“老化” FUS液滴（> 6小时）的DIC图像。比例尺小号：10 微米。

d ATA analysi小号

一个FUS聚合的nalysis

完成任何浊度测定后，数据将自动从Tecan SparkControl 导入Microsoft Excel。
绘制每个孔的吸光度与时间的关系。减去空白的吸光度以及从标准井和t 他EXPE riment井获得的信号。
归一化的信号，以标准反应的最大信号，以确定聚集/解聚的相对程度（图小号3和4）。

菜谱

FUS洗涤缓冲液
在纯化FUS之前制作1 x PBS
将1升MilliQ H 2 O加到1升瓶中
向MilliQ H 2 O中添加5种磷酸盐缓冲盐水片
搅拌直至片剂完全溶解。过滤并储存在4°C
纯化当天将新鲜试剂加入300 ml 1x PBS中
将6种蛋白酶抑制剂片剂添加到1x PBS中
搅拌直至片剂完全溶解
过滤并储存在4°C
FUS洗脱缓冲液
将1 ml 1 M Tris（pH 8）缓冲液添加到50 ml烧杯中
加入1.513 g D -（+）- 海藻糖[最终浓度。4.4 mM ]以增加FUS的溶解度
加入112.9毫克还原型谷胱甘肽[最终浓度。364 µM]从谷胱甘肽1 Sepharose 4 Fast Flow珠粒中去除带有GST标签的蛋白
加入Millipore水至最终总体积为20 ml。搅拌直至试剂完全溶解并且pH达到pH8。过滤并在4°C储存
Kapβ2 重悬缓冲液
做一个1升原液之前净化金甲β2
加入50 ml 1 M Tris（pH 7.5）[最终浓度。50毫米]
加入5.844 g NaCl [最终浓度。100 mM]
加入2 ml 0.5 M EDTA [最终浓 1毫米]
加入200毫升甘油[最终浓度。20％]
加入MilliQ 水至1 L
搅拌直至试剂完全溶解，并且pH达到pH 7.5。过滤并储存在4°C
在纯化的当天将新鲜的试剂添加到300 ml的储备液中
加入600 µl 1 M DTT [最终浓度。2毫米]
加入300 µl 5 mM 抑肽酶[最终浓度。5 µM]
添加6蛋白酶抑制剂片
搅拌溶液直至蛋白酶抑制剂片剂完全溶解，并且pH达到pH 7.5。过滤并储存在4°C
Kapβ2ATP 缓冲液
做一个1升原液之前净化金甲β2
加入50 ml 1 M Tris（pH 7.5）[最终浓度。50毫米]
加入5.844 g NaCl [最终浓度。100 mM]
加入2 ml 0.5 M EGTA [最终浓 1毫米]
加入0.10165 MgCl 2 [最终浓度。0.5毫米]
加入200毫升甘油[最终浓度。20％]
加入MilliQ 水至1 L
搅拌直至试剂完全溶解，并且pH达到pH 7.5。过滤并储存在4°C
纯化当天将新鲜试剂添加到100 ml储备液中
加入200 µl 1 M DTT [最终浓度。2毫米]
加入2 ml 250 mM ATP储备液[最终浓度。2毫米]
加2蛋白酶抑制剂片
搅拌溶液直至蛋白酶抑制剂片剂完全溶解，并且pH达到pH 7.5。过滤并在室温下储存
Kapβ2 缓冲液A
做一个1升原液之前净化金甲β2
加入50 ml 1 M咪唑（pH 6.5）[最终浓度。50毫米]
加入4.383 g NaCl [最终浓度。74毫米]
加入2 ml 0.5 M EDTA [最终浓 1毫米]
加入200毫升甘油[最终浓度。20％]
加入MilliQ 水至1 L
搅拌直至试剂完全溶解，并且pH达到pH 6.5。过滤并储存在4°C
纯化当天将新鲜试剂添加到100 ml储备液中
加入200 µl 1 M DTT [最终浓度。2毫米]
pH值至pH 6.5，过滤并储存在4°C
Kapβ2 洗脱缓冲液
加入20毫升新鲜的100毫升缓冲液A
加入减少的122.9 mg谷胱甘肽
搅拌直至还原的谷胱甘肽完全溶解并且pH达到pH 6.5。过滤并储存在4°C
TEV缓冲液
加入1 M Tris-HCl（pH 8.0）
加入10 mM EDTA
搅拌并pH至pH 8.9 。过滤并在室温下储存

表1.实验测定的最终蛋白质浓度

FUS浓度

Kapβ2 浓度

FUS聚集的抑制由甲β2（实验C）

4微米

4微米

DIS 通过FUS原纤维的聚集甲β2 （实验d）

4微米

4微米

FUS LLPS的逆转金甲β2 （实验E）

10微米

100微米

致谢

该协议在Guo 等人中进行了简要描述。，2018年。这项研究得到了NIH R21NS090205（授予J. Shorter），G。Harold和Leila Y. Mathers慈善基金会（致J. Shorter），Target ALS（致J. Shorter），ALSA（致J. Shorter）和Packard ALS研究中心（J. Shorter）。我们也感谢阿尔茨海默氏症协会（AARF-16-441196）和LG的目标ALS跳板奖学金

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考文献

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Yoshizawa，T.，Ali，R.，Jiou，J.，Fung，HYJ，Burke，KA，Kim，SJ，Lin，Y.，Peeples，WB，Saltzberg，D.，Soniat，M.，Baumhardt，JM， R.Oldenbourg，R.，Sali，A.，Fawzi，NL，Rosen，MK和Chook，YM（2018）。核输入受体通过结合多个位点抑制FUS的相分离。细胞173（3）：693-705 e622。