材料和试剂

A、 BMDM的分离培养

1. 271. 27½G针头（BD Biosciences，目录号：305109）

2. 10ml一次性塑料注射器（Thermo Scientific，目录号：S7515-10）

3. 70 μm单元过滤器（赛默飞世尔科学公司，目录号：087712）

4. 0.45 μm PES过滤装置（赛默飞世尔科技公司，目录号：162-0045）

5. 50毫升锥形管（赛默飞世尔科技公司，目录号：339652）

6. 伯爵夫人细胞计数室（Invitrogen，目录号：C10283）

7. 培养皿（Fisherbrand，目录号：FB0875712）

8. 6孔培养板（Eppendorf，目录号：0030720113）

9. 175 cm2烧瓶（Eppendorf，目录号：0030710029）

10. 无菌顶部过滤器（Nalgene，目录号：596-3320）

11. 电池刮板（康宁，目录号：3008）

12. 6周以上大鼠（C57BL/6J，杰克逊实验室）*

13. L929电池（ATCC®，目录号：CCL-1TM）

14. 0.4%台盼蓝染色（Gibco，目录号：15250-061）

15. 70%乙醇（Pharmco，目录号：1110002000）

16. DMEM高糖培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D1152）

17. 青霉素链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15-140-122）

18. 胎牛血清（FBS，Hyclone，目录号：89133-098）

19. 透析胎牛血清（dFBS，Hyclone，目录号：16777-212）

20. 重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（mCSF，研发系统，目录号：416ML050）

21. 不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Hyclone，目录号：SH30096.01）

22. 谷氨酰胺（赛默飞世尔，产品目录号：BP379-100）

23. HEPES（VWR，目录号：16777-032）

24. 大肠杆菌O111:B4中的脂多糖（LPS，Sigma-Aldrich，目录号：L3024）**

25. 干扰素-γ（干扰素γ，研发系统，目录号：485-MI-100）**

26. Accutase（STEMCell Technologies，目录号：07922）

27. 胰蛋白酶EDTA（0.05%）（Thermo Fisher Scientific，目录号：2530062）

28. 磷酸盐缓冲盐水（赛默飞世尔科技公司，目录号：14190144）

29. L929条件培养基（见配方）

30. BMDM维护介质（见配方）

31. BMDM分化培养基（见配方）

32. L929培养基（见配方）

笔记：

a。*任何有足够健康骨髓的小鼠模型都可以使用。

b。**根据所需刺激方案选择。LPS和IFN-γ刺激可诱导经典激活。

B、代谢物和脂质提取及样品制备

1. 移液管尖端1000μl，200μl（VWR，目录号：89079-470，89079-478）

2. 1.5 ml塑料管（VWR，目录号：89000-028）

3. 玻璃瓶（仅用于LC-MS级溶剂，见注释）

4. LC-MS聚丙烯瓶（赛默飞世尔科技公司，目录号：03-377-299）

5. LC-MS玻璃瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：03-FIRVA）

6. 弹簧帽（赛默飞世尔科技公司，目录号：C4011-53）

7. 聚丙烯微型离心管（VWR，目录号：89000-028）

8. 玻璃瓶（惠顿，目录号：224740）

9. 氮气

10. 富丁醛-347号LC产品目录

11. LC-MS级甲醇（费希尔化学，目录号：A456-4）

12. 正庚烷LC-MS级（Sigma-Aldrich，目录号：1036541000）

13. LC-MS级乙酸乙酯（Fisher Scientific，目录号：E195-4）

14. LC-MS级醋酸（Fisher Chemical，目录号：A11350）

15. LC-MS级水（赛默飞世尔科技公司，目录号：W64）

16. 三丁胺（Sigma-Aldrich，目录号：90780）

17. LC-MS级醋酸铵（Fisher Scientific，目录号：A114-50）

18. 乙腈LC-MS级（赛默飞世尔科技公司，目录号：A955-4）

19. 异丙醇（赛默飞世尔科技公司，目录号：A461-4）

20. SPLASH LipidoMIX内标（Avanti极性脂质，目录号：330707）

21. 冰

C、 LC-MS分析

1. Acquity UPLC BEH C18色谱柱，130汔，1.7µm，2.1 mm x 100 mm（Waters，目录号：186002352）

2. Acquity UPLC BEH C18 VanGuard Pre-column，130？1.7µm，2.1 mm x 5 mm（Waters，目录号：186003975）

3. Acquity UPLC CSH C18色谱柱，130峎，1.7µm，2.1 mm x 100 mm（Waters，目录号：186005297）

4. Acquity UPLC CSH C18 VanGuard Pre-column，130？1.7µm，2.1 mm x 5 mm（Waters，目录号：186005303）

5. 溶剂B（100%LC-MS级甲醇）

6. 溶剂A（见配方）

7. 溶剂C（见配方）

8. 溶剂D（见配方）

设备

1. 手术剪（Fisherbrand，目录号：08-935）

2. 手术钳（BrainTree Scientific，目录号：FC03-41）

3. Thermo Q-精密四极轨道质谱仪（Thermo-Scientific）与Vanquish Horizon UHPLC（Thermo Scientific）耦合

4. 氮气流样品浓缩器（Techne，目录号：FSC400D），配备127 mm针（Techne，目录号：F7210）

5. Vortexer（VWR，目录号：10153-838）

6. 微型离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 20，目录号：B31599）

7. 台式离心机（Thermo，型号：IEC Centra CL2）

8. -20 °C冷冻机

9. 4 °C冰箱

10. 标准通风柜

11. 移液管（P1000，P200）

12. 无菌细胞培养罩

13. 细胞培养箱（37°C，5%二氧化碳）

14. 伯爵夫人II手机计数器（AMQAX1000）

软件

1. 热电科学XCalibur 4.1

2. 马文（682节）(http://genomics-pubs.princeton.edu/mzroll/index.php)（Melamud等人，2010年；Clasquin等人，2012年）

3. MZMine2型(http://mzmine.github.io/)（Pluskal等人，2010年）

4. MSConvertGUI（蛋白质向导，http://protowizard.sourceforge.net/download.html)（Kessner等人，2008年）

5. 利必得(https://github.com/coongroup/LipiDex)（Hutchins等人，2018年）

程序

A、分离骨髓细胞并分化为巨噬细胞（图1）

有关骨髓分离的有用演示，请参阅其他资源（Ying等人，2013年）。

图1。BMDM分化方案的时机选择。TC治疗：组织培养治疗；BMDM：骨髓源性巨噬细胞。

1. 用快速颈椎脱位法安乐死小鼠。

2. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠，放入无菌罩内。

3. 采用无菌技术，从小鼠每只腿上分离股骨和胫骨。

4. 用浸泡在乙醇中的锋利剪刀，切断每个关节附近的骨头。

5. 用一根27.5克的针头连在10毫升注射器上，用冷的无菌BMDM分化培养基冲洗骨头，放入10厘米的培养皿中，直到骨腔呈白色。使用尽可能多的介质来充分冲洗骨骼。

6. 用移液管彻底吸取细胞悬液，使骨髓细胞完全复苏。

7. 为了去除任何肌肉或骨骼碎片，通过70µm过滤器将细胞过滤到50 ml无菌锥形离心管中。

8. 在500 x g，4°C条件下离心试管3分钟。

9. 弃去上清液，在100 ml BMDM分化培养基中重新悬浮细胞颗粒。

10. 在每个培养皿上放置10毫升的细胞悬液（非组织培养处理过的培养板在这里很重要，因为巨噬细胞会强烈地附着在处理过的培养皿上）

11. 在细胞培养箱中放置3天。

12. 镀后4天从细胞中吸取培养基，用10ml新鲜BMDM分化培养基代替。在第5天和第6天重复。

13. 电镀后7天从细胞中吸取培养基，并在每个培养皿中添加4毫升的Accutase。放回培养箱中约5分钟。

14. 用移液管，轻轻地将细胞从板上移开，并将所有细胞合并在一个50毫升的锥形管中。

15. 降速（1000 x g，5分钟）并重新注入20毫升BMDM维护介质中。

16. 用0.4%台盼蓝1:1染色计数细胞。

17. 在BMDM维持培养基和TC处理过的细胞培养板（6孔板的每孔2 ml）中使细胞再悬浮至2.5 x 105个细胞/ml。对于每种情况，建议三个重复（例如，6孔板的3个孔）。应指定额外的孔用于蛋白质或细胞计数正常化。

18. 细胞会在几个小时内粘在盘子上。贴壁后，细胞准备好进行刺激和/或提取。为了刺激巨噬细胞，用50ng/ml的LPS和10ng/ml的IFN-γ，或其他感兴趣的刺激物，持续一定时间。

B、极性代谢物和脂质的分离（图2）

图2。提取脂质和极性小代谢物的工作流程。ACN：乙腈，IPA：异丙醇。

1. 在开始之前，请制定以下解决方案：

3： 11-丁醇：甲醇（LC-MS级），含1%SPLASH LipidoMIX内标（SPLASH）

3： 1庚烷：乙酸乙酯（LC-MS等级）

1%乙酸（LC-MS级）

65:30:5秒硝基甲苯：异丙醇：水（LC-MS等级，ACN:IPA公司：水）

2. 冷却3:1丁醇：甲醇（+飞溅）和3:1庚烷：乙酸乙酯在开始之前，在-20°C和1%乙酸中在4°C中放置至少一小时。

3. 从细胞中吸取培养基。

4. 用室温PBS清洗电池两次。

5. 添加300微升-20°C 3:1丁醇：甲醇（+飞溅）对于每个井，立即将板放在冰上。

6. 在保持细胞板在冰上的同时，使用细胞刮板刮取细胞，并将溶液从每个孔转移到一个单独的1.5毫升塑料微型离心管中。将样品放在冰上。

注意:同样，通过对空管/板执行相同的步骤B1-B5来执行程序空白（N>2）.

7. 将每个试管旋转1分钟，放回冰上。

8. 在通风柜中，添加300µl-20°C 3:1庚烷：乙酸乙酯每个样品。

9. 旋涡所有管3分钟，放回冰上。

10. 在通风柜中，向每个样品添加300µl 1%乙酸。

11. 旋涡所有管3分钟，放回冰上。

12. 离心分离所有试管（20000 x g，10分钟，4°C）–应形成两个单独的层。

13. 使用移液管，将固定体积（~400µl）的顶部有机层转移到玻璃小瓶中（这是脂质和脂肪酸部分）（在通风橱中进行）

14. 使用移液管，将固定体积（~300µl）底部水层转移到1.5 ml塑料管（这是极性代谢物部分）（在通风橱中进行）

15. 使用通风柜中的N2样品浓缩器通过氮气流完全干燥所有样品。样品通常在室温下干燥2小时。干燥后立即取回样品。

16. 在LC-MS级水（50µl）中再悬浮代谢物部分，在65:30:5中重新悬浮脂质部分ACN:IPA公司：水（50µl）。

17. 将代谢物部分转移到聚丙烯LC-MS小瓶中，并将脂质部分转移到LC-MS玻璃瓶中，加盖并放置在LC-MS自动进样器中进行分析。

C、液相色谱-质谱法

1. LC-MS小瓶应按随机顺序放置在样本托盘中。样品运行应首先注入至少三个适当空白的等量溶液：极性代谢物的LC-MS H2O，65:30:5ACN:IPA公司：H2O代表脂质。另外，应在至少每10个样品之间进行空白试验。

2. 极性代谢物和脂质组分的分析在热Q-精密质谱仪上进行，该质谱仪与Vanquish Horizon UHPLC耦合。

3. 在100 x 2.1 mm 1.7uM Acquity UPLC BEH C18色谱柱（Waters）上分离极性代谢物样品，并将其连接到130？1.7µm、2.1 mm x 5 mm Acquity UPLC BEH C18 VanGuard预柱（Waters）上。在0.2ml/min流速下使用溶剂A（97:3H2O:甲醇，10 mM TBA，9mM醋酸盐，pH 8.2）和溶剂B（100%甲醇）的梯度。梯度为：0分钟，5%B；2.5分钟，5%B；17分钟，95%B；21分钟，95%B；21.5分钟，5%B（图3A）。每种代谢物样品注入5µl进行分析。在全扫描阴性模式下收集数据。详细的MS参数如表1所示。

4. 在100 x 2.1 mm 1.7 um Acquity UPLC CSH C18色谱柱（Waters）上分离脂质样品，并将其与130？1.7µm、2.1 mm x 5 mm Acquity UPLC CSH C18 VanGuard预柱耦合。溶剂C的梯度（70:30ACN：水，10mM NH4Ac）和溶剂D（90:10IPA:ACN公司，10 mM NH4Ac）在0.4 ml/min流速下使用。梯度为：0分钟，2%D；2分钟，2%D；5分钟，30%D；19分钟，85%D；20分钟99%D；27分钟，99%D；28分钟，2%D；32分钟，2%D（图3B）。每种脂质样品注入5µl进行分析。使用数据相关的MS2（ddMS2）分析，样本运行两次，一次为阴性模式，一次为阳性模式。详细的MS参数如表1所示。

表1。质谱参数

极性代谢物

脂质/脂肪酸

全扫描

全扫描

ddMS2型

充电

否定的

正/负

分辨率

7万

70万

17.5公里

最大喷射时间

100毫秒

100毫秒

80毫秒

自动增益控制

3E6型

3E6型

5E5型

辅助气体流量

10

12

鞘气流量

35

40

扫气流速

2

1

喷雾电压

3.2千伏

3.5千伏

毛细管温度

320摄氏度

340

加热器温度

300摄氏度

350

循环计数

-

-

5

隔离窗

-

-

1.4米/z

（N） CE/阶梯式

-

-

30, 40

图3。溶剂梯度和洗脱曲线。A、 LC-MS极性代谢物法的溶剂梯度和实例洗脱曲线。B、溶剂梯度和实例洗脱曲线，用于LC-MS脂质分析，显示了正、负电离曲线。

数据分析

MS1数据用于使用MAVEN软件进行极性代谢物和游离脂肪酸定量（Melamud等人，2010年；Clasquin等人，2012年）。使用LipiDex软件，基于全扫描（ddMS2）识别和量化脂质数据（Hutchins等人，2018年）。两种方法如下所述。图4显示了从非刺激（M0）和LPS+IFNγ刺激的BMDM（M1）的代谢物和脂质谱分析中获得的代表性数据。

图4。代表性代谢物和脂质数据。与未刺激的BM相比，脂类代谢产物（BM 0）在脂类（BM）刺激下（BM 0）的代谢产物（BM 0）中被鉴定为γ-DM。重点介绍衣康酸盐和琥珀酸盐，这两种免疫调节代谢物已知在M1巨噬细胞中动态上调（Jha等人，2015年；Cordes等人，2016年；Lampropoulou等人，2016年；Mills等人，2016年）。同样突出显示的是甘油三酯50:2。甘油三酯积聚也显示在M1巨噬细胞中（Köberlin等人，2014；Lee等人，2017；Feingold等人，2012）。

极性代谢物和脂肪酸

极性代谢物和脂肪酸通过匹配预期的准确质量和保留时间以有针对性的方式进行量化。保留时间和M/z的列表是通过对代谢物标准品的分析确定的，使用与上述样品相同的LC-MS方法，并在补充信息中（补充文件“Polar Descellators RT list.xlsx”）。我们建议，特别是对于感兴趣的代谢物，用户应自行制定标准。为此，在适当的样品溶剂中将标准品稀释至一定浓度范围（例如，1μM、10μM、100μM、1000μM，进样体积为1μl），并使用相应的方法在LC-MS上运行。关于非目标代谢组学分析，请参阅其他资源（Smith等人，2005和2006；Kind等人，2018；Wang等人，2019）。此外，该方法仅描述代谢物相对定量所需的内容。有关代谢物绝对浓度的测量，见其他资料（Bennett等人，2008）。我们使用MAVEN软件对峰值进行集成（Melamud等人，2010年；Clasquin等人，2012年）。本软件及其更详细的使用指南可在这里找到。

1. 使用MSConvertGUI将热生成的.raw文件转换为.mzXML文件（Holman等人，2014；Adusumilli等人，2017）。

2. 在MAVEN中打开.mzXML文件。正确加载样本后，ID将出现在左侧的“样本”窗口中。

3. 确保“复合小工具”已打开。通过点击左边的复合选项卡并选择“加载自定义复合列表”来加载复合列表。在.csv文件中加载已知的m/z和代谢物标准生成的保留时间或补充材料中提供的保留时间。调整Maven窗口右上角的ppm窗口，以匹配您的仪器的灵敏度。

4. 加载化合物列表后，单击感兴趣化合物的名称，每个样品中对应于该代谢物的峰将出现在主窗口中。红线对应于根据导入化合物列表观察到的保留时间（图5）。要保存所选峰的数据，双击峰-化合物名称和相应参数将显示在软件内的列表中。仅保存那些保留时间与化合物列表上的匹配的峰值的数据，具有相对平滑的轮廓，并且其信号高于期望的截止（例如，5E4和至少2x倍的空白）。如图5所示。

注：有关软件功能和参数设置的详细信息，请参阅MAVEN使用手册。

5. 保存了所有需要的峰值后，从Maven中导出这些数据，方法是在保存的峰值列表上方选择“export peaks to SpreadSheet（.csv）”。

6. 通过从每个样本的信号中减去空白处的平均信号，使数据空白。随后将数据标准化为细胞计数或蛋白质。

注：只比较同一序列内样品的相对丰度，因为仪器条件随时间的变化可能导致信号响应的差异。如果需要绝对定量的代谢物浓度，建议使用同位素内标。

图5。良好LC-MS峰的示例。 Maven软件显示未刺激（M0）和LPS+IFNγ刺激（M1）BMDM的琥珀酸峰。

脂类

使用开放式LipiDex软件进行脂质识别和量化（Hutchins等人，2018年）。基于全扫描ddMS2数据，LipiDex识别脂质。该软件与MZmine2耦合以量化脂质种类。以下是我们的分析工作流程（Pluskal等人，2010年）。

1. 将热生成的.raw文件转换为.mgf文件（我们使用MSConvertGUI软件[Holman等人，2014；Adusumilli等人，2017]）。

2. 在LipiDex中执行频谱搜索

a、打开LipiDex，进入频谱搜索。

b、上传.mgf文件。

c、启用适当的库。

d、指定所需的搜索参数（例如，MS1搜索容差：0.01，MS2搜索容差：0.01）。

e、单击“光谱搜索”–这将生成带有标识的结果.csv文件。

3. 使用MZmine2生成色谱特征表。分别进行正、负电离运行。按照此处提供的分步说明进行操作。

4. 在LipiDex中执行峰值查找

a、打开LipiDex，进入Peak Finder。

b、单击MZMine2选项。

c、加载MZMine2生成的正负极性峰值表。

d、上传MS/MS.csv结果文件，确保文件具有适当的极性（正极或负极）。

e、例如，使用以下命令设置所需的过滤参数：

MS2过滤参数：最小脂质光谱纯度（%）：75，最小MS2搜索点积：500，最小MS2搜索Rev。Dot产品：700。

特征关联参数：半高宽窗乘数：2.0，最大质量差（ppm）：15。

结果过滤参数：检查加合物/二聚体过滤和源内片段过滤。检查最大RT M.A.D系数为3.5。在n个文件中找到的功能：2。

f、点击识别色谱峰-这将产生.csv文件，其中包含已识别的脂质种类及其量化。

5. 空白数据使用与样本平行运行的程序空白，并将数据标准化为细胞计数或蛋白质含量。

6. 质量控制：SPLASH LipidoMIX内标是同位素标记脂质的混合物，代表主要的脂类。在初始提取缓冲液（3:11）中加入飞溅物（1%）-丁醇：甲醇). 在所有分析过的脂质样品中都存在这种内标，可以测定样品的保留时间漂移和样品回收的潜在差异。一个序列内的保留时间漂移通常<0.1min，内标的变化<20%。如果差异显著，可以将数据标准化为同一类脂的内标或最近的保留时间（如果没有同类标准）。见补充文件“SPLASH LipidoMix Stds化合物列表.xlsxSPLASH LipidoMIX中化合物的列表及其各自的保留时间。

笔记

1. 在干净的指定玻璃器皿中保存并测量所有LC-MS级溶剂。请勿将此玻璃器皿用于其他用途，也不要用自来水或肥皂清洗。残留的清洁剂和其他物质会造成背景。必要时，仅用高效液相色谱级溶剂冲洗。

2. 在提取溶剂和油脂提取过程中使用的塑料会产生背景，尤其是脂肪酸。始终执行一个程序空白，以适当说明此背景信号。如果观察到塑料移液管和微量移液管的使用量，可以减少使用玻璃管和移液管。

食谱

1. BMDM分化培养基

不含谷氨酰胺的RPMI 1640

10%FBS

20%L929条件培养基

10 U/ml青霉素/链霉素

25毫米HEPES

2毫米谷氨酰胺

2. BMDM维护介质

不含谷氨酰胺的RPMI 1640

10%dFBS

10 U/ml青霉素/链霉素

25毫米HEPES

2毫米谷氨酰胺

20 ng/ml m-CSF

3. L929培养基

DMEM高糖

10 U/ml青霉素/链霉素

10%FBS

4. L929条件培养基

a、 L929细胞在L929培养基中培养至完全融合

b、胰蛋白酶化细胞，在1000 x g下旋转5分钟

c、吸取胰蛋白酶，在L929培养基中重新悬浮细胞颗粒

d、对细胞计数，并重新消耗至8 x 103个细胞/ml

e、将130毫升该悬浮液加入175平方厘米的烧瓶中，并置于培养箱中

f、 7天后收集所有用过的介质

g、在1000 x g，4°C下离心5分钟。使用0.45μm过滤器将无菌过滤器放入无菌玻璃瓶中

h、等分份放入50毫升塑料离心管中，并在-20°C下冷冻至需要使用（6个月内使用）

5. 溶剂A

97:3分水：甲醇（LC-MS等级）

10毫米三丁胺

乙酸（LC-MS级），pH值为8.2

注：这需要大量的剧烈混合才能完全溶解三丁胺并达到稳定的pH值。

6. 溶剂C

70分30秒二氧化钛：水（LC-MS等级）

10mm醋酸铵（LC-MS级）

250µl/l醋酸（LC-MS级）

7. 溶剂D

90:10是丙丙醇：乙腈（LC-MS等级）

10mm醋酸铵（LC-MS级）

250µl/l醋酸（LC-MS级）

致谢

骨髓源性巨噬细胞分离、代谢物和脂质提取、LC-MS分析和数据分析的方法在之前的工作基础上进行了调整和优化，每个方法都在相应章节中引用。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

伦理学

动物护理和实验程序按照威斯康星大学麦迪逊机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

工具书类

1. Adusmilli，R.和Mallick，P.（2017年）。用蛋白质向导msConvert进行数据转换。方法分子生物学1550:339-368。

2. Bennett，B.D.，Yuan，J.，Kimball，E.H.和Rabinowitz，J.D.（2008年）。用同位素比值法绝对定量细胞内代谢物浓度。Nat协议3（8）：1299-1311。

3. Clasquin，M.F.，Melamud，E.和Rabinowitz，J.D.（2012年）。用MAVEN进行LC-MS数据处理：代谢组学分析和可视化引擎。现代生物信息学第14章：单元11。

4. Cordes，T.，Wallace，M.，Michelucci，A.，Divakaruni，A.S.，Sapcariu，S.C.，Sousa，C.，Koseki，H.，Cabrales，P.，Murphy，A.N.，Hiller，K.和Metallo，C.M.（2016年）。免疫应答基因1和衣康酸抑制琥珀酸脱氢酶调节细胞内琥珀酸水平。生物化学杂志291（27）：14274-14284。

5. Feingold，K.R.，Shigenaga，J.K.，Kazemi，M.R.，McDonald，C.M.，Patzek，S.M.，Cross，A.S.，Moser，A.和Grunfeld，C.（2012年）。活化巨噬细胞中甘油三酯积累的机制。白血病生物学杂志92（4）：829-839。

6. 费恩，O.（2002年）。代谢组学——基因型和表型之间的联系。植物分子生物学48（1-2）：155-171。

7. Galván-Peña，S.和O'Neill，L.a.J.（2014年）。巨噬细胞极化过程中的代谢重编程。前免疫5:420。

8. Gika，H.G.，Theodoridis，G.A.，Plumb，R.S.和Wilson，I.D.（2014年）。液相色谱-质谱法在代谢组学和代谢组学中的应用现状。药学与生物医学杂志87:12-25。

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