材料和试剂

50 ml锥形烧瓶（奥林巴斯塑料，目录号：28-108）
0.22μm过滤器（Fisher，目录号：CLS 431118 ）
5 ml 12 x 75 mm样式的聚苯乙烯圆底管（Corning Falcon，目录号：358058）
来自S288C 背景的酿酒酵母菌株，例如BY4741 / 2/3
可替代地，的yeaS的另一菌株可以使用T，只要两个非荧光和素-pHlurin表达株小号是可用的或者可以由研究者进行（见下文任选的试剂）。更多的酵母菌株和基因型信息可以找到。在https://wiki.yeastgenome.org/index.php/Commonly_used_strains。

2-脱氧-D-葡萄糖（Sigma，Sigma Life Sciences，目录号：D8375-5G）
Nigericin（Adipogen，Adipogen Life Sciences，目录号：AG-CN2-0020），以10 mM的储备液形式在100％乙醇中制备，并储存在-20°C
酵母氮基（YNB）+氮（Sunrise Scientific，目录号：1501-250）
综合完成（SC）辍学组合（Sunrise Scientific，目录号：1300-030）
D-（+）-葡萄糖（国际研究产品，目录号：G32040-5000.0）
MES（Fisher，目录号：BP300-100）
HEPES（GoldBio，目录号：H-400-1）
KCl（氯化钾）（Fisher，目录号：P217-3）
NaCl（氯化钠）（Fisher，目录号：BP358-212）
2 M HCl（盐酸）（Fisher，目录号：A144-212）
2 M KOH（氢氧化钾）（Sigma，目录号：484016-1KG）
醋酸铵（Sigma，目录号A1542-250G）
2X校准曲线缓冲液（请参见配方）
酵母生长培养基（请参阅食谱）

可选试剂

pCGT05或pHluorin表达载体（有关更多详细信息，请参见注释和所附质粒图；如果表达pHluorin的菌株尚不存在，必须由研究人员进行制备，则该试剂不是可选的）
PmeI位（新英格兰生物实验室，目录号：R0560S;自带CutSmart ® 缓冲器）
鲑鱼睾丸DNA（Millipore Sigma，目录号：D1626-250MG）在TE Buffer中制成2 mg / ml溶液（参见食谱）
分子生物学级琼脂糖（Apex Bioresearch产品，目录号：20-102GP）
10倍TBE缓冲液（Bio-Rad，目录号：161-0733），在超纯水中稀释至1 倍
无亮氨酸的SCD（2％）平板供选择
Tris-HCl（Fisher，目录号：BP153-1）
EDTA四钠（Fisher，目录号：S311-100）制成1 M pH 8.0储备液
醋酸锂（Sigma ，目录号：L6883-1KG）
聚乙二醇（PEG）3350（Sigma ，目录号：P4338-500G）

设备

离心纺丝能够1.5 毫升在3管，000 ×g下
BD Biosciences公司LSR Fortessa流式细胞仪（见注为仪器设置），邻- [R任何流式细胞仪能够激发380和410纳米之间和470-490之间纳米，和500和550纳米之间测量发光（对于两个激励）（见注）。其他激光器配置也可以使用;见Miesenb Ø CK 等人。1998年对于富的L1表征素-pHlurin
电子pH计，例如Mettler Toledo SevenCompact pH计S220（Mettler Toledo，型号：30019032）
（可选）F 或酵母转化
加热块/干浴/水浴
铸造琼脂糖凝胶的模具
用于电泳琼脂糖凝胶的标准电泳电源和设置

软件

可以读取FCS 文件的软件。在此协议中，我们将R（CRAN，https: //www.r-project.org/）与flowCore软件包（Bioconductor，https: //bioconductor.org/packages/release/bioc/ ht ml /flowCore.ht ml）；有关数据分析管道，请参见示例脚本

程序

（Ø Ptional）创建素-pHlurin表达酵母菌株
要整合到leu2 基因座（S288C背景），通过混合以下试剂并在37 °C下孵育60 分钟，将载体pCGT05与PmeI切开。
试剂（浓度）量（μl ）

pCGT05（〜200 ng / μl ）5

Cutsmart缓冲区（5x）5

PmeI （10,000单位/ 毫升）1

ü ltrapure水39

或者，可以使用具有选择标记的质粒而不是整合质粒；请参见注释S 在步骤A3的转化中将此模板用作模板，并在适当的选择培养基上平板接种。
如果无法在所需菌株中获得leu2 基因座，则也可以在另一个基因座进行整合。
（Ø Ptional）检查消化功效
要检查消化，运行2-5 微升在1产物的％琼脂糖凝胶上，用未切割的载体和ladder.The切割产品应在两个带，一个在5.2运行沿kb和其他在3.5 kb;见图2 。

图2 。矢量PCGT05之前，切割用PmeI位后的第一道如阶梯大小的参考，第二车道是向量没有孵化用限制酶PmeI位，第三车道为载体孵育PmeI位后（有两个剪切位点以使理论消化产生两个片段）。

转化为所需的酵母菌株
为了整合到leu2 基因座中，遵循标准的乙酸锂酵母转化方案（Gietz 和Schiestl，1994 ），使用上述消化反应的产物作为DNA模板。
在没有亮氨酸的SC平板上筛选菌落（30°C ，允许生长2-3天），然后在选择平板上进一步纯化菌落，然后在非选择性平板上纯化，以确保没有野生型细胞残留。
培养基中的细胞可与甘油混合以形成20％的最终溶液，并在-80°C下保存多年。

生长细胞（实验前的晚上）
接种每株要测量的酵母菌的起始培养物（至少5 ml）；包括不表达pHluorin的野生型酵母（用于背景扣除）和足够量的表达pHluorin的细胞，以产生实验样品并制备用于将荧光转换为pH 的校准曲线（有关体积估算，请参见下文）。
第二天早晨（大约16小时后）的细胞目标是OD 600 0.05-0.1左右，以便可以立即对其进行分析，或对其进行轻度稀释以便在当天晚些时候进行分析。
校准曲线将需要约5 ml OD 600 0.05-0.2 的表达pHluorin的酵母。
实验样品的目标OD 600 为0.05至0.1，低于通常用于显微镜或基于生物化学的实验的标准值。校准曲线样品可能略高，最高OD 600 0.2。
准备2个校准曲线缓冲液，可以提前准备并保存在4 °C下。

准备校准曲线（实验早晨）
向8个50 ml锥形管中加入5 ml 2x校准曲线缓冲液。添加3 ml超纯水（或足够的体积以使pH计的电极可以完全浸没在液体中，请注意酸和水的量可变需要添加碱以调节pH）。
使用浓HCl和KOH，调整各管的一半pH单位范围从5.0〜8.5 pH值（8总; 该跨距的pH值到所述荧光团是敏感的范围内;测量在该范围之外是不准确的）。该初始pH值应在5.5-6.5的范围内。
注意：调整pH值之前，请确保缓冲液处于室温，因为pH值可能对温度敏感。

pH值在正确范围内后，加入超纯水直至最终体积为10 ml（校准曲线缓冲液现在为1x），记下最终pH值并在试管外部记录准确的值。
经过pH调整的1x校准曲线缓冲液（不含离子载体）可以在4 °C下保存约一个月。重新使用时，将其恢复到室温，重新测量pH，并注意管子外部的任何变化。较小的变化（〜0.05 pH单位）是可以容忍的，但是较大的变化表明应丢弃缓冲液，并从2x储备液中重新制成。

准备校准曲线（实验前约30分钟）
将每个pH值的1 ml校准曲线缓冲液分装到标记的1.5 ml试管中，并向每个试管中加入1μl10 mM Nigericin的100％乙醇溶液，使其终浓度为10μM。该步骤应在接近测量时进行因为离子载体在室温下降解更快。
标记另外一个用于校准pH的pH值的1.5 ml试管（用于细胞），以及另外一个用于未标记细胞的试管。
细胞在一次OD 600 0 .05和0.2之间，将等分点〜500 Myueru的表达荧光素的细胞插入每个标记的试管中，再等分一个未标记的细胞试管，用于背景扣除。
以3,000 xg 旋转细胞3分钟，用移液管倾析上清液（培养基），注意在不干扰细胞沉淀的情况下尽可能多地除去液体。
通过将其重悬于100μl去离子水中并以3,000 xg 旋转3分钟来短暂洗涤细胞。
用尼日利亚菌素在400μl适当的pH制备的标准曲线缓冲液中重悬细胞。
如果在倾析过程中丢失了许多细胞（例如，如果沉淀物受到移液的干扰），或者开始时浓度较低，则可以使用较小体积的缓冲液，但至少需要200μl体积才能进行测量（这可能随用于进行测量的细胞仪的型号而变化）。
未标记的细胞可以重悬于任何pH值，因为荧光背景不会随缓冲液的pH值而变化。
让细胞在缓冲液中孵育15分钟以平衡pH，然后尽快进行步骤E.有可能将细胞在缓冲液中放置更长的时间而不会丢失完整性或荧光值，但是应该通过在不同的时间间隔多次运行完整曲线来进行经验测试。

在流式细胞仪上分析样品
在上样之前，先将试管涡旋或颠倒混合。
将培养基中的200μl野生型（非表达pHluorin的）细胞加入5 ml聚苯乙烯流动管中，将其放在流式细胞仪上并开始采集数据。以尽可能低的流速运行样品时，分离通过在前向散射与侧向散射图中绘制门来收集与细胞相关的事件，以收集绝大多数细胞事件，请参见图3，了解典型的散射曲线。
每个样本至少收集10,000个事件，但最好收集20,000+个事件。
表1 给出了BD LSR Fortessa仪器的电压设置。可以使用其他仪器和设置；有关更多详细信息，请参见“注释”。
至关重要的是，相同的电压在相同的实验中使用的，并且优选地甚至与不同的电压设置不能被直接比较采取experiments.Data之间不应当被改变。

图3. 酿酒酵母细胞的典型散射图轮廓，数据来自BD Biosciences LSR Fortessa，电压如表1所示。

表1.仪器设置（BD LSR Fortessa）

频道名称

激发

发射

电压

前向散射

488

不适用

110

侧面散射

488

不适用

236

FITC

488

525/50

422

BV510

405

525/50

400

BV421

405

450/50

495

使用相同的设置和体积，运行并收集培养基中表达pHluorin的细胞和校准曲线缓冲液中的野生型细胞的数据，所有这些样品对于背景扣除都是必不可少的。
使用相同的设置和体积，在程序C中准备的校准曲线缓冲区中运行并收集所有样品的数据。
使用相同的设置运行其他实验样品。
注意：在不同介质中实验样品的情况下，在相应的介质未标记的细胞的一个单独的样品也必须以进行正确背景减除分析;参见数据一个下面nalysis部。

汇出资料
导出所有数据。流式细胞仪数据的标准格式是.fcs格式;下面的数据分析假定使用此格式的数据。

数据分析

分析的目的是首先使用缓冲液中细胞的数据来构建校正曲线，然后将其用于将培养基中细胞的荧光读数转换为细胞内pH，在示例脚本中，使用的两个绿色通道称为“FITC”，对应于在488nm激发波长和发射在50分之525纳米，and'BV510' ，对应于405 nm，发射激发在50分之525纳米。下面，它们将被称为下面为F 405 用于发射在405激发后在525处的强度为F，在488 激发后在525处的发射强度为F488。上标将指代菌株和本底。

以下是数据分析管道的一般说明。随附了使用R编程语言执行此分析的示例脚本。

加载包含在FCS文件中的数据，并将其转换为表格格式的人类可读数据
在随附的示例脚本中，这是通过使用R编程语言的flowCore包读取文件，然后将所得对象转换为R数据帧来完成的。

计算背景读数
未标记细胞（在FITC和BV510通道中）的中值荧光将被减去作为背景。缓冲液中未标记的细胞将被用于从缓冲液中标记的细胞中减去背景，同样用于培养基中的细胞组成的样品。

制作校准曲线
对于每个细胞（排气孔），计算背景扣除的随pH值变化的荧光比率。

来自每个校准曲线样品的，与每个pH缓冲液相对应的bin / group事件。计算每个pH的中值荧光比率。建立荧光截止值可能有助于解决低，未表达或受损的细胞的问题。但是，该方案应保留大多数事件，并且对于基因组整合了pHluorin的菌株可能不是必需的。
要绘制校准曲线，请首先将每种缓冲液的已知pH值与R 405/488的中值作图，有关示例校准曲线，请参见图4 。

4.素-pHlurin校准曲线图。P Oints是中位数的人口至少10,000个细胞，误差棒为氩E中的第25和第75个百分点。

将点拟合为以下形式的S型：

其中a，b，c和d是拟合参数（a 对应于曲线的最大值，b 对应于上升的陡度，c 对应于中点，d 对应于基线）。在示例脚本中，使用由R编程语言中的nls（）函数实现的非线性最小二乘法；有关更多信息，请参见https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/nls.html上的文档有关此方法的信息以及图4 中的示例校准曲线。这些参数一经拟合，即可通过计算背景扣除的R 405/488 值，使用此函数在任何单个细胞的荧光比和细胞内pH之间进行映射，并重新排列上式如下：

注意：此功能只能在荧光团的敏感度范围内使用（pH 5.0至8.5）（Miesenböck等，1998）。通常，校准曲线必须延伸至这些极限值才能正确设置基线，并且只有落在校准曲线中使用的最小和最大pH范围内的比率才能确定地分配给pH，超出此范围的比率是模棱两可的，因此不应进行分析。

一个nalyze experim ental 样本
通过首先计算未标记的细胞的中值荧光在相同培养基中作为样品，然后计算将R从每个实验样品减去背景488分之405 如小号上述（替换f TEP C1 405 和F 488倍用于中未标记的细胞的值，而比缓冲区）。
使用S Tep C4 建立的关系将R 405/488 转换为PH。

笔记

关于酵母菌株和菌株的可用性：在所附的示例脚本中，数据从菌株yCGT028收集，该数据是从leu2 位点表达pHluorin 的二倍体（BY4743背景）酵母菌株，在亲本菌株中为空（leu2Δ0），而在SSA4 :: mCherry中但是，此协议中可以使用任何表达pHluorin的菌株，无论是从基因组还是从带有选择标记的质粒中表达。由于探针是按比例分配的，预期质粒表达的表达水平变化不会显着影响数据分析，但是，应注意不包括任何未能表达荧光团的细胞；因为易于区分表达细胞和非表达细胞（请参见图5 ），因此可以在仪器上手动剔除表达细胞或将其排除数据分析。

图5.通过荧光分离表达pHluorin和野生型的种群。数据来自BD Biosciences LSR Fortessa，电压列于表1 。

关于流式细胞仪的模型：在此协议中，我们给出了在BD Biosciences LSR Fortessa上运行样品的具体说明；但是任何能够在正确范围内测量激发和发射的细胞仪：在380至410 nm之间以及在470至490 nm之间的激发和发射（用于两个激发）在500到550 nm之间。要设置这些通道的电压，在pH 5和pH 8.5校准曲线缓冲液中运行两个电池都是有帮助的，因为它们代表了预期的最大和最小荧光强度（Miesenböck 等等人，1998年）。两个通道中的两个样品都应得到良好的分离（即，不要使检测器的饱和度为零或最大值）。
关于荧光数据：从流式细胞仪输出的数据可能包含脉冲高度和宽度信息以及总荧光（面积），在本协议的所有方面均使用面积测量。
关于补偿：尽管补偿（一种用于计算和校正荧光通道之间重叠的程序）在多色流式细胞术中很常见，但在此方案中，仅分析了一种荧光团，没有必要进行补偿。用其他荧光团（例如mCherry）表达，它们在相同范围内未激发，并且以相同方式进行分析。
关于测量校准曲线的频率：由于仪器设置和力学机制可能每天变化，因此最佳实践是每次执行实验时都要测量一条新的校准曲线。如果比例值似乎每天都非常一致，则只能分析最小和最大pH缓冲液；如果先前生成的校准曲线正确地预测了这些样品，则可以使用该校准曲线来分析当天的数据。
关于校准曲线的重现性：尽管比率的绝对值可能在不同的日子发生变化，但曲线的中点（即pHluorin的表观pKa）应保持一致。荧光团，将每个样品的缓冲液pH值与以下数量作图（Bagar 等，2009）：

此图可以适合通过线性最小二乘，且其中所得到的线穿过y = 0的线是fluorophore.The的公布的表观pKa 体外pKa为6.9（Bagar 等人，2009）。见的附脚本此分析的一个例子。

关于过滤事件：在某些样品中，根据处理情况，会有细胞亚群，它们既在与pHluorin相关的通道中丢失荧光，又在另一个通道中具有更多（自体）荧光（例如405，em 450/50）我们将这些细胞解释为以某种方式已经死亡或损坏，并将其排除在分析之外，它们通常出现在实验样品中而不是在校准曲线样品中。有关分离和滤除此亚群的示例，请参阅分析脚本。

菜谱

2个校准曲线缓冲液
100毫米MES

100毫米HEPES

100毫米氯化钾

100毫米氯化钠

400 mM醋酸铵

20毫米2-脱氧-D-葡萄糖

TE缓冲液
10毫米Tris-HCl

1 mM Na 2 EDTA，pH 8.0

酵母生长培养基（1升）
6.7 克YNB

2.0 g SC辍学组合

20 克葡萄糖

用超纯水稀释至1 L，然后通过0.22μm 过滤器进行过滤以进行灭菌

致谢

该出版物中报道的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的国家生物医学成像和生物工程研究所的资助，编号为T32EB009412，并且获得了美国国家科学基金会的研究生研究奖学金，授予号为DGE-1144082.DAD表示支持。美国国家卫生研究院（NIH）授予R01 GM126547和R01GM127406，美国陆军研究局授予W911NF-14-1-0411。作者还要感谢芝加哥大学流式细胞仪核心。

本文报道的方法用于预印本《瞬时细胞内酸化调节核心转录热休克反应》，https：//doi.org/10.1101/414706。

利益争夺

作者宣称他们没有任何竞争利益。

参考文献

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