材料和试剂

塑料移液器吸头
微量离心管
ZipTipC 18 （默克密理博（Merck Millipore），目录号：ZTC18S096）
乙腈，含有0.1％（V / V）甲酸对LC-MS，JT贝克® （VWR ，目录号：JT9832-2）
水，含有0.1％（V / V）甲酸，BAKER ANALYZED TM ，JT贝克® （VWR ，目录号：JT9826-3）

设备

SpeedVac
的nanoACQUITY UPLC 小号ystem（Waters公司）
的nanoACQUITY M级BEH130 C18柱，1.7 μ 米，75 μ 米×250毫米（Waters公司，商品目录号：186003545）
Picoview 纳米喷雾源550（新物镜，目录号：PV-550）
混合LTQ- Orbitrap Elite TM 质谱仪（Thermo Scientific）或任何等效的高分辨率/质量精度MS系统，包括三重Orbitrap Fusion（Thermo Fisher Scientific）

软件

Masslynx TM 软件v。4.1 （Waters）
Xcalibur TM 软件v2.2（Thermo Fisher Scientific ）
GlyPick（内部，可根据要求提供）

程序

样品制备
在进行UPL C系统处理之前，应使用ZipTip C 18 （Yu 等人，2020年所述）进一步清洗过甲基化的聚糖样品，并通过SpeedVac进行干燥。
在10重新溶解全甲基化的聚糖样品μ 升5％乙腈的，0.1％甲酸。

设置UPLC系统参数
的连接的nanoACQUITY UPLC系统到LTQ- 轨道阱精英TM 经由混合质谱仪PicoView 纳米喷雾源nanoLC 分离在35℃下，使用75 微米的ID，长度25cm C18柱BEH填充有1.7 微米的颗粒与300埃孔径大小。
设定300 nl / min 的恒定流量
将溶剂系统的流动相A设置为包含100％水和0.1％甲酸（FA），对于流动相B设置包含100％的乙腈和0.1％FA。在30的过程中使用B的线性梯度为30-60％5分钟后，在5分钟内增加至80％的乙腈，并等度保持10分钟（如图2所示）。

图2.设置HPLC梯度方法的步骤

设置用于MS采集的参数（如图3所示）
双击个ê 的Xcalibur 软件，然后点击仪器设置。
点击“ N次双重播放” 。
选择“在Orb itrap Elite支持下初始化方法”，然后在“分析前N个峰”中键入“ 5”，然后单击“确定”。将显示名为“ Thermo Xcalibur 仪器设置” 的页面。
设置以下参数
采集时间设置为60分钟，并在段1设置的“扫描事件”中键入3（由蓝色箭头指示）。
注意：当改变液相色谱梯度或使用不同的UPLC系统/反相毛细管柱时，可以调整采集时间。

单击扫描事件1（活动窗口显示为黄色背景）。
扫描说明：分析仪：FTMS; 质量范围：正常；分辨率：120,000；扫描类型：完整；极性：负极；数据类型：个人资料。
扫描范围：第一质量（m / z ）650; 最后质量（m / z ）2000 。
C。单击扫描事件2（活动窗口显示为黄色背景）。

扫描说明：分析仪：离子阱；质量范围：正常；扫描类型：普通；数据类型：质心
单击设置，将显示窗口“数据相关设置”。
1）选择“动态排除”；点击“启用”；类型重复计数：2；重复持续时间：15；排除清单大小：500；排除持续时间：60；排除质量宽度，选择“按质量”；最低：1.5；高：1.5，单击“确定” 。

2）选择“充电状态”；单击“启用电荷状态筛选”和“启用单同位素前体选择”；单击“启用”，然后选择“拒绝充电状态”：“ 2”，“ 3”，“ 4及更高”。点击“确定”。

注意：此设置适用于单硫酸化的全甲基化聚糖，因为单硫酸化的聚糖以负离子模式单独带电。

3）选择“当前扫描事件”；类型最小信号阈值（计数）：5000。单击“确定” 。

4）选择“激活”；选择激活类型：CID；默认充电状态：2；隔离宽度（m / z ）：2；归一化碰撞能量：35；活化度Q：0.25; 激活时间（毫秒）：10.单击“确定” 。

单击扫描事件3（活动窗口显示为黄色背景）
扫描说明：分析仪：FTMS; 质量范围：正常；分辨率：15,000；数据类型：Centroid 。
单击设置，将显示窗口“数据相关设置”。
1）选择“动态排除”；点击“启用”；重复次数：2；重复持续时间：15；排除清单大小：500；排除持续时间：60；排除质量宽度，选择“按质量”；最低：1.5；高：1.5。点击“确定” 。

2）选择“充电状态”；单击“启用电荷状态筛选”和“启用单同位素前体选择”；单击“启用”，然后选择“拒绝充电状态”：“ 2”，“ 3”，“ 4及更高”。点击“确定”。

注意：此设置适用于单硫酸化的全甲基化聚糖，因为单硫酸化的聚糖以负离子模式单独充电。

3）选择“当前扫描事件”；类型最小信号阈值（计数）：5000。单击“确定” 。

4）选择“激活”；选择激活类型：HCD；默认充电状态：2；隔离宽度（m / z ）：2；归一化碰撞能量：110；激活时间（毫秒）：0.1。点击“确定” 。

转到Tune plus窗口，然后选择SetupFT Injection Control或在Instrument Control工具栏中单击。将显示名为“注射控制”的窗口。选择FT，AGC目标设置，输入“ Full MS”：1.00e 6 ；SIM：5.00e 4 ; MS n ：5.00e 4 ; 单击“启用全扫描注入波形”。选择离子阱，全质谱：3.00e 4 ；SIM：1.00e 4 ; MS n ：1.00e 4 ; 缩放：3000，单击“确定” 。

注意：这些设置基于已发表作品中使用的设置（Yu等人，2018 ）。其他设置应根据样品类型进行调整。例如，

在扫描事件1扫描范围将被改变为1 ，000-4 ，000为全甲基化的单硫酸化的N-聚糖由于单电荷的性质。
检查节“数据相关的设置”  “段”  “充电状态”，应该调整被拒绝的充电状态取决于聚糖的充电状态。对于二硫酸化的N-或O-聚糖，通常以负离子模式加倍电荷。拒绝的充电状态应为1、3和4或更高。
人们应该始终相应地优化和校准LC-MS / MS系统。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-20 \ 3618--1902755 Kay-Hooi Khoo 837220 \图3-updated.jpg

图3.设置MS采集

清单数据分析小号

负离子模式下的ESI-MS分析
Xcalibur 软件v2.2手动处理了所有数据。我们观察到，全甲基化的单硫酸化的聚糖通过使用早于二硫酸化的聚糖洗脱的nanoACQUITY UPLC BEH130柱和乙腈/甲酸/水溶剂系统中。在ESI-MS光谱中，单硫酸化的N- 和O- 聚糖的离子信号检测为[MH] - ，而二硫酸化的N- 和O- 聚糖的离子信号检测为[M-2H] 2- 。

负离子模式下的ESI-MS / MS分析
通常，根据其前体的洗脱曲线在保留时间段内平均采集的HCD-MS 2 和CID-MS 2 光谱，然后手动进行解释。一般而言，全甲基化硫酸化聚糖在负离子模式下的裂解模式与正离子模式下的裂解模式相似（Yu 等人，2006；Hsiao 等人，2017），除了仅保留硫酸根并因此保留硫酸根的裂解离子。在负离子模式下将检测到负电荷。正确而充分地分配各种裂解离子需要大量的专业知识和经验，而鉴定少数几个公认的诊断离子则更为简单（总结于表1中）。下面显示一个示例，以说明可以预期的特征碎片模式（图4）。

图4. HCD-MS / MS和CID-MS / MS谱二硫酸化的ø 聚糖对应于2 SO 3 六角3 HexNAc 3 在-itol M / Z 769.81，双电荷[M-2H] 2-

表1. HCD-MS / MS分析提供的诊断性碎片离子的选择，可用于评估一些最常见的硫酸化糖基的存在和相对丰度。可以使m / z 528、702、889、1063 处的MS 2 离子进一步经受MS 3的作用，以产生< m / z 400 处的诊断离子，这些信息可以说明硫酸盐在Gal或GlcNAc 残基上的精确位置。m / z 97 处的信号高度丰富，普遍存在，可用于确认硫酸盐的存在，但其本身并不能告知特定的硫酸化糖基。它可以被排除在LC-MS的质量范围2 的数据采集，以更好地检测其它低得多abundan 吨离子。

在负离子模式下检测到的HCD碎片离子（m / z ）

HSO 4 -

96.9596

六硫酸化GlcNAc

138.9701、194.9963、234.0436、264.0542

3'-硫酸盐

152.9858、180.9807、253.0382、283.0488、301.0599

6'-硫酸加仑

167.0014、194.9963、253.0382、283.0488、301.0599

硫酸唾液酸

296.08、440.12

硫酸末端HexNAc

324.0759

硫酸化的LacNAc

528.1759

硫酸化的LacNAc [1型链]

398.1126

硫酸化的LacNAc [2型链]

371.1017

硫酸化的路易斯

702.2648

硫酸唾液酸化的LacNAc

889.3493

硫酸化唾液酸化的路易斯

1063.4385

HCD-MS / MS分析
m / z 528 处的强B离子和m / z 457 处的相关E离子表明存在硫酸化的LacNAc 单元。
3,5- 于A离子M / Z 371和d离子在M / Z 514表示的硫酸化类型2的存在的LacNAc 。
m / z 139、195、234、264 处的低质量离子表明两个硫酸根均位于HexNAc 的6碳位置。
在离子M / Z 588/616/676是在裂解离子HexNAc-itol ，表明硫酸化的LacNAc 单元承载在的6-臂HexNAc-itol ，这是提供信息的。通过在m / z 807 的Y离子和在m / z 789的Z离子进一步证实了该糖基。
CID-MS / MS分析
在HCD MS 2 数据中还观察到了CID MS 2 中显示的那些碎片离子，除了i ）m / z 1442 处的离子，这对应于从母离子中消除了硫酸根；ii）m / z 652 处的Z离子是双电荷的，对应于末端己糖残基的消除；iii）m / z 1039和1108处的离子是HexNAc 残基处的X离子；iv）m / z 1224和1208处的离子，分别来自m / z 1442 处离子的己糖损失和m / z 1540 处的前体离子硫酸盐和己糖的协同消除（Yu 等人，2006年）。
信息低质量的碎片离子（表明硫酸盐的位置）由于截止而在CID-MS / MS数据中丢失。

注意小号：

对于HCD-MS / MS分析提供的特征性MS 2 碎片离子，读者可参考已发表的工作（Cheng等，2015）中的图4，这些离子可用于鉴定硫酸盐的位置。这些特征性碎片离子不仅在过甲基化硫酸化O-聚糖的HCD-MS / MS分析中显示，而且在N-聚糖中显示。
CID- MS 3 全甲基化的硫酸化聚糖的光谱可以得到有关硫酸化Gal和硫酸化的GlcNAc ，但硫酸盐的不准确的位置（图小号3C 和图3 中d Cheng等，2015）。这可以通过在Orbitrap Fusion上启用HCD-MS 3 分析来进一步解决和定义（Hsiao等人的图S3 等，2017年）。
当前，在负离子模式下，m / z 2000以上的全甲基化单硫酸化N-聚糖和O-聚糖的单电荷前体离子无法在Orbitrap MS系统的四极杆或阱中高效分离，用于MS / MS分析。

内部GlyPick 计算工具
甲的硫酸化的dditional映射glycotopes 基于它们各自的MS 2根诊断离子（图5）可以使用内部开发的软件，来执行GlyPick 。描述用于用户界面的代表人物GlyPick 已被示出为图S4 在萧等人。（2017年）。
GlyPick中用于全甲基化硫酸化聚糖输入数据的参数
将质量公差设置为±5 ppm，并选择Orbitrap作为要从采集的数据集中提取的目标HCD-MS 2的仪器类型，其绝对强度和相对强度阈值应设置为100和1％以上。
选择负离子模式。
从内置列表中选择已知的诊断碎片离子作为目标离子。不在列表中的其他离子可以由用户输入。
分析全甲基化还原聚糖时，选择“还原”作为还原末端。
根据不同的样品修改其他参数，例如单硫酸盐或二硫酸盐；N- 聚糖或O- 聚糖。
当另外执行pd-MS 3 采集时，将使用MS 3 设置。
将计算每个提取的目标离子的总离子强度，并以CSV格式输出结果。这些可以进一步计算为所有选定MS 2 离子的总百分比，这是一种方便的归一化方法。

致谢

此LC-MS / MS实验工作流sulfoglycomics 改编自2件出版作品（程等人，2015; 于等人。，2018），而另外的糖表位与-centric数据挖掘GlyPick 由萧开发等。如Hsiao 等报道。，2017年MS数据是由LTQ轨道阱在学术界获得中央研究院共同质谱蛋白质组学和蛋白质修饰的研究设施位于生物化学研究所，中国科学院报，学术界支持中央研究院核心设施和创新工具项目（AS-CFII -108-107）。这些作品由学术界支持中央研究院和科学技术部台（科技部）授予KKH。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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Cheng，PF，Snovida，S.，Ho，MY，Cheng，CW，Wu，AM and Khoo，KH（2013）。通过其他尺寸的糖酵解剂和全甲基化聚糖的靶标分析，增加基于质谱的糖基覆盖的深度。Anal Bioanal Chem 405（21）：6683-6695。
肖国强，王宝华，张慧聪，陈永耀，王SH，陈恩耀和KH，KH（2017）。推进基于全甲基化聚糖的nanoLC-MS（2）-产品依赖性-MS（3）分析的高通量以糖类为中心的糖链工作流程。摩尔细胞蛋白质组学16（12）：2268-2280。
Patnode，ML，Cheng，CW，Chou，CC，Singer，MS，Elin，MS，Uchimura，K.，Crocker，PR，Khoo，KH和Rosen，SD（2013）。在白细胞或肺组织中生成Siglec-F配体不需要半乳糖6-O-磺基转移酶。生物化学杂志288（37）：26533-26545。
Yu，SY，Hsiao，CT，Izawa，M.，Yusa，A.，Ishida，H.，Nakamura，S.，Yagi，H.，Kannagi，R.和Khoo，KH（2018）。基于质谱的硫糖体分析显示了人类GlcNAc-6-磺基转移酶的不同底物特异性。生物化学杂志293（39）：15163-15177。
Yu，SY，Snovida ，S。和Khoo，KH（2006）。硫酸聚糖的过甲基化和微分离技术用于MS分析。乙io的- p rotocol 10（10 ）：E3 6 17 。
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