材料和试剂

无粉手套（Denville Scientific，目录号：G4162 ）。
一次性刮刀（VWR，目录号：80081-194）
50 ml 锥形管（Denville Scientific，目录号：C1062-P（100079 9 ））
无菌玻璃漏斗，50毫米（派热克斯）
剪式
金属钳
过滤纸，中等/快速流动（VWR ® ，417级，目录号：28313-068 ）
毫升50 抽真空驱动的过滤系统（Steriflip ® ，Millipore公司，0.22微米孔径大小，目录号的：SCGP00525）
BioLite 96 - 孔板（热费舍尔科学，目录号：12-556-008）
硝酸纤维素膜/滤纸（Bio-Rad，目录号：1620215）
移液器仪（Eppendorf，2。5，10，20，100，200，和1 ，000 微升）
福尔瓦® 包被的铜网上（电子显微学，目录号：FCF300-CU-SC）
云母片（电子显微镜科学，目录号：71855-15）
常规移液器技巧
纸巾
130盎司带215毫米盖的纸桶（卡拉特（Karat），目录号：C-FB130W）
基本老鼠笼式装配在Cludes一个内部水瓶（工艺优化® ，目录号：C79100 M / P / S）
抗CD63，大鼠抗小鼠（BD Biosciences ，目录号：564221 ）。
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A2153-10G）
预先染色的蛋白质标准品，10-250 KD（Precision Plus Protein TM ，Bio-Rad，目录号：1610373）
脱脂牛奶（Sigma-Aldrich，目录号：M7409-1BTL）
十二烷基硫酸钠（SDS）粉（BIO-RAD，目录号：1610301）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046-50G）
罗氏蛋白酶抑制剂混合物，片剂（Sigma-Aldrich，目录号：4693159001 ）。
蔗糖（Calbiochem公司® ，Millipore公司，目录号：573113-1KG ）
Ponceau S解决方案（Sigma-Aldrich，目录号：P7170-1L）
DC™蛋白测定试剂盒II（Bio-Rad，目录号：500-0002）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV ）。
RIPA 裂解缓冲液，10x（Sigma-Aldrich，目录号：20-188）
Laemmli 缓冲液2x（Bio-Rad，目录号：1610737 ）。
4-20％的预浇铸的凝胶（Bio-Rad，目录号：4561904 ）。
ECL Prime Western印迹检测试剂（GE Healthcare生命科学，目录号：RPN 2232）
Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-500）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860-2L-R）
乙酸铀酰酯粉（电子显微镜科学，目录号：22400）
Western Blotting的运行缓冲液（请参见食谱）
Western Blotting的转移缓冲液（请参见配方）
1％醋酸铀酯溶液（请参阅食谱）

配套设备

Optima TM L-90K超速离心机（Beckman Coulter，目录号：969349）
固定角式45 Ti 转子（贝克曼库尔特公司，加利福尼亚州布雷亚，目录号：339160 ）。
70 ml 离心瓶（贝克曼库尔特，目录号：355655）
SW 41 Ti 转子，摆动铲斗，钛，6 x 13.2 ml ，41,000 rpm，288,000 x g （Beckman Coulter，货号：331362）
壁薄，超清除TM 13.2毫升，14 x 89毫米超速离心管（Beckman Coulter公司，目录编号：344059）
超声波浴（布兰森，目录号：3510MTH ）。
透射电子显微镜（TEM，LEO 906E，德国卡尔·蔡司）
原子力显微镜（AFM，布鲁克纳克斯表面公司，加利福尼亚州圣巴巴拉）
电子天平，可读性：0.01 mg（OHAUS，型号：EX125）
粒度分析仪（布鲁克黑文仪器公司，型号：90PLUS）
Se mi-micro Cuvettes，Clear，1.5 ml （Sigma，货号：BR759115）
Zetasizer （Malvern，Nano系列，型号：Nano-ZS90）
一次性毛细管细胞（马尔文，目录号：DTS 1070或DTS 1061）
荧光酶标仪（BioTek ，型号：Synergy 2）
印迹装置西方（伯乐，的PowerPac ® 基本动力，而小型蛋白质® 电泳槽中）
Milli-Q净水系统（Millipore，型号：Advantage A10）
冰桶
计时器

软体类

90 Plus粒度调整软件（布鲁克海文仪器公司）
Malvern Zetasizer

程序

准备粪便样品（小鼠品系的选择取决于目标动物模型，在本例中，我们使用C57BL / 6，因为DSS诱导的C57BL / 6中的急性结肠炎是公认的模型）
将20只C57BL / 6 只小鼠放在高压灭菌的小鼠笼子中（无垫层，每只笼子5只，每只笼子一只，取决于实验）或清洁一次性纸箱（每盒5只或每盒一只鼠标，取决于实验）。
2至3小时后，收集所有粪便。
将粪便存放到-20 如果不立即使用°C冰箱，粪便颗粒可以保存一周。

分离总外泌体
称量粪便，加入干净的50 ml 锥形管中（每管1.0克粪便，大约50至75个粪便颗粒）。
取另一个干净的50 ml 锥形管，放入5个抑制蛋白酶的鸡尾酒片剂，加入50 ml 冰冷的PBS，摇动直至片剂溶解。
将步骤B2中制备的25 ml PBS溶液添加到50 ml 锥形管中（包含1.0克粪便）。
将试管放在4 °C的冰箱中30分钟。
取出试管，以最大速度涡旋5 分钟。
注：一种简化的工作流程中分离纯化来自粪便是显示在图1中所有的粪便应该是破碎成小颗粒（图2）。

图1.从小鼠粪便中分离外来体的简化工作流程

图2.涡旋后的粪便悬浮

在4°C下以3,000 xg离心10分钟，收集上清液。
将在Ste p B2中制备的25 ml PBS溶液添加到50 ml 锥形管的剩余部分中。
重复步骤B6。
合并目标。
在4°C下以3,000 xg离心30分钟，收集上清液。
设置一个带有消毒玻璃漏斗的过滤装置，使样品流过滤纸以除去碎屑（图3 ）。

图3.纸过滤去除粪便碎片

在4°C下以40,000 xg离心1.5 h，收集上清液。

图4.真空过滤去除微生物

通过0.22运行Myuemu 滤器以除去微生物（图4 ）。
在150,000 xg f 或4 h下2.5 h 离心，弃去上清液，并保留可见的沉淀。
用1-2 ml PBS 洗涤沉淀3次，两次洗涤之间以150,000 xg离心10-15分钟（在4°C下），并丢弃第一次和第二次的PBS，最后一次洗涤的PBS作为外泌体空白保存蛋白质定量解决方案。
保存沉淀（图5 ）。

图5.超速离心后的外泌体沉淀

ř Esuspend将沉淀在PBS（1个毫升PBS每1g粪便样品）。
表征前将悬浮液储存在4°C的冰箱中。
注意：如果您在2天内未测试样品，则将样品存储在-80°C下。

总外泌体的细分（蔗糖密度梯度超速离心），从微生物群来源的细胞外囊泡中分离出结肠外泌体

图6.设置蔗糖梯度

在双蒸馏水中制成8％，30％，45％，60％（w / v）的蔗糖溶液，并通过0.22 µm过滤器过滤溶液。
ñ 大手：过滤所有的8 Pasento，30 Pasento，45 Pasento，60种Pasento蔗糖溶液通过0.22 Myuemu 膜去除小颗粒上样，小颗粒会污染外来体做超速离心当之前。

用60％至8％的蔗糖溶液在离心管（14 x 89 mm）上装载1.5 ml 60％，1.5 ml 45％，1.5 ml 30％，1 ml 8％，然后4.5 ml PBS （图6）。
将样品与标签染料（丽春红溶液，1.0毫升样品与10 Myueru 染料）。
将标记的样品上样至PBS层。
在4 °C（使用SW41转子）下以150,000 xg离心3 h 。
通过移液除去8-30％的层，使用玻璃移液器收集含染料的层（30-45％的层，图7 ），用PBS 稀释收集的溶液至10 倍体积。

图7.标记的外泌体带

以150,000离心机XG 对于2 H在4 ℃，保存沉淀物。
将沉淀重悬于5 ml PBS中。
表征前将悬浮液储存在4 °C的冰箱中（请参阅注1 ）。

表征

粒度和表面ζ电势
注意：在进行尺寸和Zeta电位测量之前，请打开仪器（Particle Size Analyzer和Zetasizer ）至少15分钟。

Partic 文件大小测量：取0.5毫升的Exos 青梅溶液稀释至2.0毫升PBS，吸管到试管（避免产生气泡），插入比色皿室的粒度分析仪读取的。尺寸的颗粒由90加粒度测量软件。水合外泌体的平均直径约为155 nm（在该测试中为152.8至157.9 nm，如注2 所示）（图8）。
粒子表面Zeta电位测量：取0.8 ml 稀释溶液（已准备好在步骤D1中进行粒径测量），缓慢移液到一次性毛细管中，盖上细胞，将细胞插入zeta分析仪的小室中，并记录值在中性pH值下，样品的Z电位约为-11.2 mV（在此测试中为-10.2到-12.2 mv）（图9 ，软件：Malvern Zetasizer ，请参见注释2 ）。

图8. 水合粪便外泌体的粒径测量

图9.粪便外泌体的Zeta电位测试

蛋白质浓度
使用DC TM 蛋白测定试剂盒。将20 µl试剂S加到每毫升试剂A中。
制备在1x PBS中包含0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50 mg / ml BSA 的蛋白质标准曲线。
5 Myueru吸取标准和样品到洁净的96 - 孔板。
在每个孔中加入25 µl试剂A'（1 ml 试剂t A和20 µl 试剂S）。
在每个孔中加入200 µl 试剂B。上下吹打3次混合。
在室温下等待15分钟。
用酶标仪读取750 nm处的吸光度。
绘制标准曲线并计算蛋白质浓度。
注意：从1g粪便中分离出的外泌体的预期蛋白浓度在0.25至1.5 mg / ml之间，如果浓度超出线性范围（0.25至1.5 mg / ml ，请参见图13 和表1 ），请稀释或浓缩样品并重做测试。

CD-63蛋白检测（蛋白质印迹法）
10添加0 微升RIPA缓冲液（10X）-to 900 微升冰冷的PBS（含有蛋白酶抑制剂混合物（Roche）） -向制成1 ml的溶液A.
20 TAKE 亩克粪便纳米囊泡（20 微升从1 毫克/毫升溶液），添加100 微升冰冷的溶液A.
在室温下以42 kHz的频率超声处理3 次，每次10-15 s。
在4°C下以16,000 xg 旋转20分钟。
取总计，添加相同体积的Laemmli 缓冲区（2x）。
将样品在95°C下煮沸5分钟。
在微量离心机中以16,000 xg 离心1分钟。
将样品上样到4％至20％的预制凝胶上。
添加运行缓冲液（配方1），以50 v 运行凝胶5 分钟。
将电压增加至100 v，运行凝胶1 h。
取出凝胶，添加转移缓冲液（配方2），将电压调节至100v ，然后转移至硝酸纤维素膜上（Chankova 等人，2013 ）。
取出硝酸纤维素膜，在室温下用5％脱脂牛奶封闭1 小时。
加入一抗（抗CD63：在PBS中1：200稀释，抗-β-肌动蛋白，在PBS中1：200稀释），在室温下孵育2 小时。
用PBS清洗3-5次，每次5 分钟，添加HRP偶联的二抗，在室温下孵育2 小时。
化学发光的波段检测与ECL Plus试剂。一个代表性蛋白质印迹画面是显示ň 在图10中。

图10. CD63的蛋白质印迹带（使用裂解的小鼠大肠样品作为对照）

透射电子显微镜（TEM）
1移液器Myug （1 Myueru 1毫克/毫升）粪外来体解决方案在10 Myueru 蒸馏水。
5〜10存款Myueru 样品在表面上福尔瓦中® 包被的铜网上。
加入5μl1 ％乙酸铀酰（配方3）15秒钟。
在室温下将样品干燥至少30分钟。
样本通过测试透射电子显微镜。一个代表性的TEM照片的粪便外泌体被显示在图11 。

图11. 粪便外泌体的TEM图

原子力显微镜（AFM）
0.25移液器MYU ģ （0.5 Myueru 0.5毫克/毫升）粪外来体解决方案在10 Myueru PBS。
d Eposit 5〜10 Myueru 样品加到云母片。
在室温下干燥样品约2 小时。
20添加Myueru 蒸馏水为云母片。
将样品在室温下再干燥2小时。
等待样品相对平坦。
将样品与扫描的区域约4×4 Myuemu 或更小的面积随着2- 5 0 Nm的高度。一个典型的AFM图的粪便外来体被示出在图12中。

图12.粪便外泌体的AFM图

数据一Nalysis

表1 是外泌体样品蛋白质浓度测试的典型数据分析；定量是基于BSA样品的标准曲线；如“ E.蛋白质浓度”部分所述。

从标准值中减去平均空白PBS值，（或在酶标仪的软件中选择“减去空白值函数”，然后直接取该值）。
取调整后标准的平均值，并在Microsoft Excel中建立回归方程，计算相关系数（R或R平方），确保相关系数大于0.95（图13 ）。
调整外泌体样品的价值通过减法平均外来体毛坯（PBS）值。取平均值的调整外泌体样的价值观，并替换进入回归方程为“Y”（OD 750），计算值“的x ”，其中是蛋白质浓度。
最后，规范中的蛋白质浓度为“Mg的每克粪便中”通过乘法稀释因子。（2× 语Ution手段1克粪便在2mL PBS，0.5X Dilut 离子手段1克粪便在0.5ml PBS中。参见没有te 1 ）。

图13. DC TM 蛋白浓度测试的标准曲线和回归方程

表1.粪便外泌体样品的蛋白质定量

标准品

（BSA）

浓度（mg / ml ）

0.25

0.5

0.75

1.0

1.25

1.5

OD 750 值

标准1

0.115

0.166

0.208

0.257

0.297

0.328

标准2

0.125

0.171

0.219

0.254

0.303

0.324

空白（PBS）

0.065

0.066

0.067

0.067

0.065

0.065

空白（平均）

0.066

标准1减去空白

0.050

0.101

0.142

0.191

0.231

0.262

标准2减去空白

0.059

0.105

0.153

0.189

0.237

0.258

标准减去空白（平均值）

0.055

0.103

0.148

0.190

0.234

0.260

标准曲线

Y = 0.1672x + 0.0185（R 2 = 0.9937）

外泌体空白*

0.072

0.076

0.075

空白（平均）

0.074

外泌体样品1

0.219

0.223

0.212

样品1减去空白

0.145

0.149

0.138

样品1浓度

0.750毫克/毫升

归一化浓度（2倍稀释）

1.500毫克/克

外泌体样品2

0.188

0.201

0.202

样品2减去空白

0.114

0.127

0.128

样品2浓度

0.630毫克/毫升

归一化浓度（2倍稀释）

1.260毫克/克

外泌体样品3

0.178

0.178

0.176

样品3减去空白

0.104

0.104

0.102

样品3浓度

0.510毫克/毫升

标准化浓度（0.5倍稀释）

0.26毫克/克

注意事项

产量中总的外来体蔗糖密度梯度离心约为0.8-2.0每克粪便，将前产量的外来体小碎片的从30-45 Pasento蔗糖密度约为0.1-0.3每克粪便，定量进行通过蛋白质定量方法。
分离的粪便外泌体的大小可能在125至170 nm之间变化；表面zeta电位范围可能在-14.0至-9.0 mv之间变化。

菜谱

用于Western Blotting的运行缓冲液（pH 8.3，储存在4°C，保质期：3个月）
25 mM Tris

190 mM甘氨酸

蒸馏水中0.1％w / v SDS

用于蛋白质印迹的转移缓冲液（pH 8.3，储存在4°C，保质期：3个月）
25 mM Tris

190 mM甘氨酸

蒸馏水中含20％v / v甲醇

1％醋酸铀酰溶液（pH 4.5，储存在4°C，保质期：3个月）
使用准备好的4％醋酸铀酯原液：将4克醋酸铀酯粉末溶于100 ml 预加热的Milli-Q过滤水（50-60 °C）中
将1 ml 4％的原液与3 ml Milli-Q过滤水混合

致谢

这项工作得到了美国糖尿病，消化与肾脏疾病研究所（DM的RO1-DK-116306和RO1-DK-107739）和退伍军人事务部（DM的优异奖BX002526）的支持。研究职业科学家奖高级（BX004476）从部门退伍军人事务。这个协议用来在近日发表的作品通过春华杨（杨等人，2019 ）。

竞争利益

作者声明该作品内无利益冲突。

参考文献

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