材料和试剂

无菌尖端为微量（绿- 白TM SPACESAVER TM 堆叠笔芯为的Rainin 移液管）
PCR 微管（BioExpress ，目录号：T-3135-2）
测序引物MTK_P072（gagcctatggaaaaacgc ）
测序引物MTK_P073（gggcgtaatttgatatcg ）
LB汤（西格玛奥德里奇，目录号：L3022）
LB琼脂肉汤（Lennox）（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
氯霉素（频谱化学，目录号：40310016-2）（工作浓度：100 毫克/ 米升）
羧苄青霉素溶液（频谱化学，目录号：403 10030-2）（工作浓度：25 毫克/ 米升）
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich公司，目录号：K4000）（工作浓度：100 毫克/ 米升）
T4 DNA 连接酶（NEB，目录号：M0202L）
聚乙二醇（PEG）（Millipore-Sigma，目录号：81268）
T4 多核苷酸激酶（NEB，目录号：M0201L）
T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10 x ）（NEB，目录号：B0202S）
BsaI-HFv2 （NEB，目录号：R3733S）
FastDigest Esp3I（Thermo Fisher Scientific，目录号：FD0454）
微量准备套件（Thermo Fisher Scientific，目录号：FERK0503PR ）
T4 DNA连接酶+ 2.5％PEG（请参阅食谱）

设备

微量移液器（Rainin Pipet-Lite XLS）
培养箱摇床（新不伦瑞克TM 伊诺? 44，目录编号：M1282-0000）
凝胶文件系统（Protein Simple AlphaImager HP）
热循环仪（Bio -R ad C1000，目录号：1851148）
纳米d ROP （热科学TM 纳米滴TM 2000C ，目录号：ND2000）
程序

总览
使用MTK生成遗传回路的过程如图1所示。可以从Addgene （https://www.addgene.org/browse/article/28197510/）订购或从oligos生成MTK库的第1-8部分。和PCR片段。通过BsmBI 金门大会将新零件驯化为对氯霉素具有抗性的目的载体，并选择白色菌落。从零件库中，可以通过将第1-8部分与BsaI Golden Gate反应组装并选择白色，耐羧苄青霉素的克隆来构建转录单位（TU）。TU可以单独或与其他TU一起递送或进一步组合到卡那霉素抗性目的载体中。该组装是通过BsmBI 金门反应完成的，该反应可生成准备引入哺乳动物细胞的质粒。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902929--1309 Joao Fonseca 828905 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

图1. MTK克隆过程概述。A. P 领域中是从寡聚或PCR产物克隆进用氯霉素抗性驯化矢量BsmBI 金门组件。将新克隆的部分或Addgene 提供的库中的部分合并，以产生耐羧苄青霉素的转录单位（TU）。为了递送到哺乳动物细胞中，可以将单个或多个TU进一步组合以产生抗卡那霉素的多个转录单位（Multi-TU）。B.标准TU由8部分组成。第1部分包含5'连接器，第2部分是5'UTR（通常是启动子），第3部分包括编码序列，第4部分是3'UTR（通常是终结器），第5部分包括3'连接器。第6至8部分未显示，通常编码细菌抗性标记。

部分d omestication
现有零件
从Addgene 订购零件（https://www.addgene.org/browse/article/28197510/）。
用相应的抗生素在LB琼脂平板中划线细菌。
用无菌微尖端挑出一个白色菌落，并用相应的抗生素接种5 ml LB培养基。
在37处培养细菌16小时 ℃，在250rpm的一个振荡器。
使用的Thermo Fisher Miniprep试剂盒，以下制备质粒DNA 的制造商的说明书。
测量的DNA对的浓度纳米d ROP 。
用引物和MTK_P072 MTK_P073序列的质粒，以确保存在的正确部分。
聚合酶链反应
正向引物设计为（N 4 ）CGTCTCNTCGGTCTCN （X 4-6 ）（Y 16-22 ）。
N是任何基数。

X是特定于零件类型的BsaI 突出碱基。参见表1。

Y是与特定部分同源的碱基，并允许PCR。

反向引物设计为（N 4 ）CGTCTCNGGTCTCN （X 4-6 ）（Y 16-22 ）。
N是任何基数。

X是零件特有的BsaI 突出碱基。参见表1。

Y是与特定部分同源的反向互补碱基，其允许PCR。

从idtDNA （https://www.idtdna.com/）订购引物作为定制的25 nmole DNA寡核苷酸
对于第1部分（连接器），和第5'部分（反向连接器），一个附加的悬垂需要被加入到正向引物（见? 能够2）。
对于第5部分（连接器），和第1'部分（反向连接器），一个附加的悬垂需要被添加到反向引物（见? 能够2）。
?F 或部分小号2 ，3 ，4，其为spCAS9编码sgRNAs，以下寡核苷酸被排序为定制25个纳摩尔DNA寡聚物从idtDNA ：
TGTTTG（N 20 ）G

TAAAC（N” 20 ）CA

N是向导特定的序列，而d N'是其反补

表1.部分驯化的引物

部分

正向引物突出

反向引物突出

1个

CCCTCGTCTCaNNNN

CGTT

1 （反向连接器）

CCCT

CGTTCGTCTCtNNNN

2

咨询委员会

卡塔

3

TATG

加特

3a

TATG

美国汽车协会

3b

TTCT

加特

4

技师

中国计算机学会

4a

空中交通管制

认证证书

4b

泰格

中国计算机学会

5

燃气轮机

TGTACGTCTCtNNNN

5 （反向连接器）

GCTGCGTCTCaNNNN

TGTA

6

塔卡

培训中心

7

加特

泰格

8

中国注册会计师协会

AGGG

8a

中国注册会计师协会

空中交通管制

8b

卡特

AGGG

234

咨询委员会

中国计算机学会

表2.特定于连接器的悬垂

连接器

悬垂

LS，LS'

5' CTGA

L1，R1

5' CCAA

L2，R2

5' GATG

L3，R3

5' GTTC

L4，R4

5' GGTA

L5，R5

5' AAGT

L6，R6

5' CCCT

L7，R7

5' GCGG

L8，R8

5' TTTA

RE，RE'

5' AGCA

移除内部BsmBI 和BsaI 网站
如果存在内部BsaI 或BsmBI 位点，则需要在这些位点侧翼的其他引物。这些将创建额外的PCR产物，这些产物在金门反应中汇集在一起??，以生成与MTK兼容的部分。需要遵循以下要求：
底漆应正向使用BsmBI 位点，以确保它们不包含在最终产品中。
PCR产生的突出应与零件构建产生的突出（TCGG和GGCT）尽可能不同。例如CATA，而不是TAGG。
去除BsaI / BsmBI 位点的点突变应在编码DNA序列中保持沉默。
去除BsaI / BsmBI 位点的点突变应保持非编码DNA序列中的CG含量。
用于去除ERKKTR 圆顶中内部BsaI 位点的引物示例（ERK激酶易位报道基因，MTK3_021，图2）。悬在了考试PLE是AGGA。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902929--1309 Joao Fonseca 828905 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2. 驯化之前的ERKKTR 序列的一部分。BSAL 网站是突出的黄色。无论正向和反向引物编码BsmBI 网站对后金门总成。此外，反向引物具有一个到? 替代该保持G48，但除去BSAL 从所述最终产品。

为了简化编码序列的零件驯化，我们创建了一个python脚本（可在此处找到：https : //github.com/weinerlab/mtk_primer_generator），该脚本可生成给定输入序列和零件编号的候选引物。该脚本会找到需要删除的BsmBI 和BsaI 限制位点，然后生成能够删除每个限制位点的潜在沉默突变列表。最后，它检查这些潜在突变的组合，以确保与Golden Gate组件的一般兼容性以及彼此之间的相互兼容性，从而实现精简的一锅式Golden Gate组件装配。
PCR产生的零件的金门反应
使用表3中所示的反应混合物，将生成的PCR（He，2011 ）或基因区块编码部分驯化在PCR微管中。
运行在表4中描述的方案一thermocycl ER。

表3.零件驯化的Golden Gate反应设置

试剂

体积

MTK0_027（50 飞摩尔/ μ 升）

0.5 μ 升

PCR或基因片段块（50 飞摩尔/ μ 升）

0.5 μ 升每个片段的

具有2.5％PEG的T4 DNA连接酶缓冲液（10 x ）

1 μ 升

T4 DNA连接酶

0.5 μ 升

Esp3I

0.5 μ 升

蒸馏水

7.5 μ 升- （0.5 μ 升X片段的数量）

表4.金门反应的热循环条件

温度

持续时间

重复

37°摄氏度

2分钟

24 倍

16°摄氏度

4分钟

37°摄氏度

10分钟

1 个

80°摄氏度

10分钟

1 个

12°摄氏度

保持

1 个

如果必须在驯化部分保留内部Bsm bI 位点，则将热循环反应的第三步（表4，37°C，10分钟）从实验方案中删除。
如Sharma 等人所述转化细菌。（2017）。
从步骤B 3进行现有零件的驯化。
一般，挑2个丝毫? 菌落（见注解）中的情况下的PCR增加了一个突变在新克隆的一部分。

寡聚生成零件的金门反应
首先，通过将以下混合物在PCR微管中于37°C孵育1小时，将寡核苷酸生成部分的寡核苷酸磷酸化（表5）。

表5. Oligo退火反应设置

试剂

体积

正向寡核苷酸（100 μ 中号）

1 μ 升

反向寡（100 μ 中号）

1 μ 升

T4 DNA连接酶缓冲液（10 x ）

1 μ 升

T4 PNK

1 μ 升

蒸馏水

6 μ 升

稀释的磷酸化寡核苷酸机智?190 μ 升蒸馏水。
为了使寡核苷酸退火，准备了热循环仪规程以将反应温度在96°C下保持6分钟，然后将每秒0.1°C的温度降至23°C。然后将反应无限期地保持在23℃。
使用表3中所述的反应混合物进行驯化，将PCR片段替换为相同体积的退火寡核苷酸。对于spCAS9 sgRNA驯化，将MTK0_027替换为MTK0_001。
如上所述，从步骤4c到4e 。

转录单位（TU）组件
单TU
转录单位（TU）由MTK库的第1至第8部分定义。如果所需的电路仅需要一个TU，我们建议将TU与MTK678_001以及适当的Part 1 LS连接器和Part 5 RE连接器一起安装。这将允许以不同的递送方法将TU回收到哺乳动物细胞中。
使用表6中所述的反应混合物构建单个TU。
如果需要额外的部件（例如，而不是第3部分，使用部分3a和部分3b）中，蒸馏水变化体积，使得反应体积为总等于10 μ 升。

表6. TU组装的金门反应设置

试剂

体积

质粒编码部分1与LS连接器（50 飞摩尔/ μ 升）

1 μ 升

质粒编码第2部分（50 飞摩尔/ μ 升）

1 μ 升

质粒编码第3部分（50 飞摩尔/ μ 升）

1 μ 升

质粒编码4部分（50 飞摩尔/ μ 升）

1 μ 升

质粒编码部5与RE连接器（50 飞摩尔/ μ 升）

1 μ 升

质粒编码678部分

（MTK678_001，50 飞摩尔/ μ 升）

0.5 μ 升

具有0.25％PEG的T4 DNA连接酶缓冲液（10 x ）

1 μ 升

T4 DNA连接酶

0.5 μ 升

BsaI-HFv2

0.5 μ 升

蒸馏水

2.5 μ 升

按表4所述进行金门反应。
如Sharma 等所述转化细菌。（2017年）。
用无菌微量吸头挑出两个单一的白色菌落（见注），并用羧苄青霉素接种5 ml LB培养基。
在生长细菌16小时37℃下在250rpm的一个振荡器。
使用的Thermo Fisher Miniprep试剂盒，以下制备质粒DNA 的制造商的说明书。
测量的DNA对的浓度纳米d ROP 。
消化的质粒用NotI位或其他适当的限制性内切酶小号，按照制造商的指示，并验证片段的正确大小。
TU编码与荧光蛋白mAzamiGreen 融合的ERKKTR 的CAG-d riven 表达的TU 实例，带有bgh 聚腺苷酸化信号（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902929--1309 Joao Fonseca 828905 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

图3.单个TU编码ERKKTR的组装和验证。A.组装TU以表达mAzamiGreen 融合的ERKKTR 所需的质粒。质粒enconding 连接器LS和RE（以红色突出显示）是用于单个TU电路的生成是必不可少的。B.组装的ERKKTR编码TU。组装中使用的不同零件以不同的颜色和Notl 位置显示。C.预期后编码ERKKTR TU的片段大小的NotI 消化。

TU用于MultiTU 质粒
用于多TU质粒的TU的生成过程与上述用于单个TU的方法相同。? H但是，所用必须允许连接器中相应的最终的多TU质粒有序组件中的TU的。下面是从可用零件构建的两个独立TU的示例（图4）。这两个质粒组装在编码两个转录单位的最终质粒中（图5B）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902929--1309 Joao Fonseca 828905 \ Figs jpg \ Fig4.jpg

图4.两个TU的组装，用于后部多TU组装。第一个TU（A，ERKKTR）和第二个TU（B，H2B）组装所需的质粒。红色突出显示的是组装到目标向量中所需的LS和RE 连接器。绿色突出显示的连接器允许在目标向量中对第一和??第二TU进行有序组装。请注意，L 1 与R1连接。最终的多TU质粒如图5B所示。

TU用于多顺反子MTU质粒
当需要两个或多个目的基因的共表达时，可使用多顺反子质粒。在MTK中，这是通过使用病毒P2A元素实现的。这些元素导致核糖体跳过2A元素C端的肽键合成，因此从相同的mRNA产生两个肽。

TU的用于多顺反多TU质粒需要使用部分被组装1连接器的质粒编码P2A元素和与部分2和部分4的质粒小号其编码间隔区序列维持在帧编码-DNA序列。
多顺反子质粒的第一个TU 必须使用不含P2A 元件的第1 部分，编码启动子的第2部分和不含终止密码子和PA信号（MTK4_006）的第4 部分。
多顺反子多质粒的最终TU 必须使用编码P2A元素的第1部分，编码间隔子（MTK2_013）的第2部分和带有终止密码子和聚腺苷酸化信号的第4 部分。
如果在多顺反子结构中使用了两个以上的TU ，则中间TU必须使用第1 部分编码的P2A元素MTK2_013和MTK4_006。
金门组装和质粒验证的协议与上面针对单个TU详述的协议相同。
sgRNA的TU
编码sgRNA的TU的组装方式与单个TU相同，但第2、3和4部分被含sgRNA的234 部分代替。

多牛逼ranscriptional ü 尼特b uilding
多个TU单元由经过验证的TU构建而成，这些TU使用连接器将其按顺序组装到目标向量中。
使用表7中描述的反应混合物构建多个TU 。

表7. MTU组装的金门反应设置

试剂

体积

质粒编码的TU （50 飞摩尔/ μ 升）

1 μ 升每

质粒编码PART0 （目的载体，50 飞摩尔/ μ 升）

0.5 μ 升

具有2.5％PEG的T4 DNA连接酶缓冲液（10 x ）

1 μ 升

T4 DNA连接酶

0.5 μ 升

Esp3I

0.5 μ 升

蒸馏水

7.5 - （0.5 μ 升X TU的质粒的数量）μ 升

按表4所述进行金门反应。
如Sharma 等所述，转化细菌。（2017年）。
用无菌微尖端挑出两个单一的白色菌落（请参阅“注释”），并用Kan接种5 ml LB培养基。
在37℃下生长的细菌16小时在250rpm的一个振荡器。
使用的Thermo Fisher Miniprep试剂盒，以下制备质粒DNA 的制造商的说明书。
测量该DNA的上的浓度纳米d ROP。
消化的质粒用NotI位或其他适当的限制性内切酶小号，按照制造商的指示，并验证该片段的正确大小。
电子多TU编码TU的xample 被示出在图4中，在piggyBac转目的地向量（图5）。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 1902929--1309 Joao Fonseca 828905 \ Figs jpg \ Fig5-udated.jpg

图5.在piggybac 目标向量中编码ERKKTR和H2B的Multi-TU的组装和验证。所需的组件多-T的A.质粒在红色U.突出显示的是目的载体enconding 为所需的序列piggyBac转-directed插入基因组中。B.组装的多TU编码ERKKTR和H2B。组装中使用的不同质粒以不同的颜色和NotI位点显示。多TU的C.预期片断大小后编码ERKKTR和H2B NotI位消化。

笔记

采摘白色殖民地

正确组件插入MTK0_027，MTK678_001或任何最终目的地向量会产生白色E. 大肠杆菌转化后的菌落。大多数错误的程序集都会生成绿色菌落。发生这种情况是因为目的载体包含正确表达后会丢失的细菌GFP表达盒。尽管在白光下可见绿色菌落，但在蓝光下很容易区分它们。为此，我们使用了图6所示的凝胶文档系统。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902929--1309 Joao Fonseca 828905 \ Figs jpg \ Fig6.jpg

图6.部分驯化的转化体。板与大肠杆菌与MTK0_027的金门装配和3的PCR产物的UND产物转化ER （A）白光和（B）的蓝色光。在蓝光下（绿色菌落，箭头）很容易检测到不正确的组件。

菜谱

T4 DNA连接酶+ 2.5％PEG
解冻10x T4连接酶缓冲液
在连接酶缓冲液中稀释50％PEG 1:20
等分试样6 μ升在PCR微管
储存在-20 °C

致谢

本文提供的协议改编自Fonseca 等。（2019）。我们要感谢Seesha Takagashi 和Marisa Rosa对协议的重要反馈。这项工作得到了HE-.S 的国家科学基金会奖＃1715108和国防高级研究计划局的资助（HE-.S的资助号HR0011-16-2-0045 ）。HE-.S是Chan Zuckerberg Biohub 的调查员。这项工作也得到了授予ARB的国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金的支持。

利益争夺

没有利益冲突。

参考文献

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