材料和试剂

直径425-600 μm的酸洗玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5606-400EA）
50毫升猎鹰? 管（Dutscher ，目录号：352070）
Eppendorf管S（VWR，目录号：89000-028）
牛血清白蛋白标准品，2 mg / ml（Thermo Scientific，目录号：23210）
蛋白酶抑制剂混合物[ 4 mg / ml亮肽素（Roth，目录号：CN33.2），抑肽酶（Roth，目录号：A162.3），抗痛药（Roth，目录号：2933.2），胃蛋白酶抑制剂（Roth，目录号： 2936.3）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：EI6）]
酵母提取物KAT（Ohly ，目录号：OHLY ? KAT）
葡萄糖（默克（Merck），货号：1083469029）
硝基蓝四唑（Sigma-Aldrich，目录成员：N6876）
4- 15％的Mini-PROTEAN ? TGX TM 预制蛋白凝胶，10孔，50微升（Bio-Rad公司，目录号：4561084）
MilliQ 水
乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐d 我水合物（Sigma-Aldrich公司，目录号：E4884）
乙二醇- 双（β- 氨基乙基醚）-N，N，N'，N'- 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：10837091001）
二辛可宁酸（Supelco公司，目录号：B9643）
CuSO 4 · 5 H 2 O （Sigma-Aldrich，目录号：209198）
Trizma 基地（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
HCl（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
NaOH （Sigma-Aldrich，目录号：795429）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：47861）
KCN（Sigma-Aldrich，目录号：60178）
Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
NaH 2 PO 4 （Sigma，Aldrich，目录号：S3139）
K 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：1551128）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：1551139）
液氮
YD板（请参见食谱）
NaPO 4 缓冲液（0.1 M，pH 7.8）（请参见食谱）
Tris缓冲液（1 M，pH 6.8）（请参见配方）
磷酸钾缓冲液（1 M，pH 7.8）（请参见食谱）
EDTA（100 mM，pH 8.0）（请参阅食谱）
EGTA （100 mM，pH 8.0 ）（参见食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
CuSO 4 · 5 H 2 O （4％）（请参阅食谱）
2 x cc。小号上午PLE缓冲区天然凝胶（见食谱）
天然凝胶运行缓冲液（请参见配方）
染色溶液（请参阅食谱）

设备

Eppendorf管离心机（Hettich Z entrifugen ，型号：MIKRO 20）
涡流（VWR，型号：444-0996）
高压灭菌器（Systec，型号：VX / VE）
蛋白质凝胶盒（Bio-Rad，型号：1645052）
凝胶扫描仪（Amersham ，型号：29083461）
用于液体培养中酵母生长的恒温振荡器（EdmundBühlerGmbH ，型号：VKS-75对照）

程序

酿酒酵母细胞提取物制备
条纹的酿酒酵母株对从上YD板（配方1）的对应甘油储备进行分析。在28°C下孵育两天。
使用无菌牙签选择单个菌落。
将酵母细胞在50毫升YD培养基中搅拌（120 rpm）在28°C下生长至OD 600 为3（OD 600 = 1对应于1.25 x 10 7 细胞/ ml 的密度）。
注意：从这一步开始，尽量将样品放在冰上。

离心的酵母培养物在50个毫升猎鹰? 在3500管×g下在4 ℃下5分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬于2 ml冰冷的水中。
在4°C下以16,000 xg离心20 s。
弃去上清液，将沉淀重悬于200 μl冰冷的裂解缓冲液中（配方7）。
向细胞悬液中加入200 μg酸洗过的425-600 μm直径的玻璃珠。
通过以3,000 rpm 涡旋8 x 30 s 进行细胞裂解，在每个涡旋步骤之间在冰上休息15 s 。
在4°C下以2,400 xg离心20 s。
将上清液（细胞裂解液）转移到新的Eppendorf管中，如果不直接使用，则将其保存在-80 °C，事先在液氮中速冻。

蛋白质浓度定量
注意：该方案包括使用双辛可宁酸测定的蛋白质定量。如果熟悉其他任何蛋白质浓度定量方法（例如Bradford分析法），也可以使用此方法。

根据表1 从2 mg / ml储备溶液中制备牛血清白蛋白（BSA）的标准溶液以建立校准曲线：

表1 。制定BSA标准

管

牛血清白蛋白浓度（mg / ml）

H 2 O体积（微升）

BSA体积（微升）

一种

2.000

0

储备溶液300 mg 2 mg / ml

乙

1.500

125

375从储备溶液中2 mg / ml

C

1.000

325

325从储备溶液中2 mg / ml

d

0.750

175

从管B 175

?

0.500

325

来自管C的325

F

0.250

325

E管中的325

G

0.125

325

F管中的325

H

0.025

400

G管100

一世

0

400

0

稀释细胞裂解液，使其浓度被校准曲线覆盖。如果来自50ml培养在OD收获开始600 的如图3所示，可将样品稀释10倍（10微升细胞溶胞产物中的90微升中号illiQ 水）。
将49 ml二辛可宁酸与1 ml CuSO 4 · 5 H 2 O （4％）混合（配方8）。
将20 μl的每个标准品/样品与200 μl的二辛可宁酸/ CuSO 4 · 5 H 2 O混合。
在37 °C下孵育30分钟。
读取562 nm处的吸光度。
使用标准品确定校准曲线，并使用该校准曲线推导待分析样品的浓度。图1说明了使用如上所述制备的BSA标准ds 可以获得的典型线性回归。

图1。根据本文所述制备的BSA标准品用于二辛可宁酸测定的校准曲线示例。图中提到了线性回归方程以及相应的R 2 。

Sod2p活性染色
将相同体积的2 x cc 混合对应于200 μg蛋白质的细胞裂解液（如果从OD 600 为3 收获的50 ml培养物开始，则约为15 μl ）。天然凝胶的样品缓冲液（配方9）。
加载上一个Mini-PROTEAN所得混合物? TGX TM 预制蛋白凝胶。
在天然凝胶电泳缓冲液（配方10）中，在100 V和4°C下将凝胶电泳4 h。
凝胶迁移后，将其在搅拌（40 rpm）和黑暗中浸入20 ml 1 mg / ml 硝基蓝四唑鎓溶液中15分钟。
Rince 与凝胶的MilliQ 水。
在搅拌（40 rpm）和黑暗中，将凝胶浸入25 ml染色溶液（配方11）中15分钟。
Rince 与凝胶的MilliQ 水。
暴露于光下15-30分钟和扫描的凝胶。凝胶的未染色区域对应于Sod2p。图2示出了针对野生型酵母菌株和针对编码CuZn-Sod1p（sod1Δ ）或Mn-Sod2p（sod2Δ ）的基因而缺失的菌株获得的凝胶。

图2.在凝胶中评估的Sod2p对野生型，sod1Δ 和sod2Δ 酵母菌株的活性。箭头处的白带强度与Sod2p的活性水平相关（此区域越白，Sod2p的活性越高）。

笔记

对应于Sod2p活性的信号强度可以与Mn 2+ 的可用性以及细胞的氧化还原状态相关。从这个角度来看，蓝色背景上强度较弱的白带反映了Sod2p的活性降低，可能与（i ）由于其作为辅因子的作用而在Sod2p的附近产生的Mn 2+ 生物利用度降低有关，或者（ii）由于在中和自由基中涉及Sod2p和锰阳离子，导致细胞抵抗氧化应激的能力降低。可以使用任何常规用于定量Western blotting信号的软件对与Sod2p对应的信号进行定量，从而实现更定量的方法。

菜谱

YD板
2克（2％w / v）酵母提取物KAT

2克（2％w / v）葡萄糖

用M illiQ 水和高压灭菌器调节至100毫升

倒入培养皿

磷酸钠4 b uffer （0.1M，pH7.8）中
4.48毫升1 M Na 2 HPO 4

0.52毫升的1 M NaH 2 PO 4

用M illiQ 水调节至50毫升，并验证pH值

Tris缓冲液（1 M，pH 6.8）
121.14克Trizma 基

约稀释。800毫升M illiQ 水

使用HCl将pH调整至6.8

调整到终体积1升用中号illiQ 水

磷酸钾缓冲液（1 M，pH 7.8）
14.894克K 2 HPO 4

1.972克KH 2 PO 4

用M illiQ 水调节至100毫升并验证pH

EDTA （100毫米，pH 8.0）
3.7224克EDTA

约稀释。80毫升M illiQ 水

使用NaOH将pH调节至8.0

用M illiQ 水调节至100 ml的最终体积

EGTA （100毫米，pH 8.0 ）
3.8035克EGTA

约稀释。80毫升M illiQ 水

使用NaOH调节pH

用M illiQ 水调节至100 ml的最终体积

裂解缓冲液
10毫升（10毫米）NaPO 4 缓冲液pH 7.8（配方2）

5毫升（5毫米）的100毫米EDTA

5毫升（5毫米）的100毫米EGTA

0.292 g（50 mM）氯化钠

100微升（0.1％v / v）Triton X-100

50 μl蛋白酶抑制剂混合物

1 ml（1 mM）的100 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）（0.0174 g PMSF在1 ml乙醇中）

用M illiQ 水调节至100 ml的最终体积

CuSO 4 · 5 H 2 O （4％）
2克CuSO 4 · 5 H 2 O

在50毫升M illiQ 水中稀释

2 x cc。天然凝胶样品缓冲液
1.875 ml（62.5 mM）的1 M Tris-HCl缓冲液pH 6.8（配方3）

12毫升（40％v / v）甘油

0.3 ml （0. 01％w / v）的1％（w / v）溴酚蓝（在50 ml M illiQ 水中的0.5 g溴酚蓝）

用M illiQ 水调节至30毫升

? ativ ?凝胶电泳缓冲液
30.3 g（250 mM ）Trizma 基础

144.1 g（1.9 M）甘氨酸

调整到1升用中号illiQ 水

使用前需稀释10倍

染色液
5 ml（100 mM）磷酸钾缓冲液pH 7.8（配方4）

162.7微升（28毫米）TEMED

0.0005 g（0.028 mM）核黄素

0.0163 g（5毫米）KCN

用M illiQ 水调节至50毫升

致谢

该协议改编自已建立的已发布程序（Luk 和Culotta ，2001）。这项工作是由来自全国全宗德拉资金支持RECHERCHE 科学研究（FNRS，授予PDR-T.0206.16）。LT是一个研究员在“全宗倒勒形成点菜RECHERCHE 丹斯欧莱雅工业等丹斯欧莱雅农业”。

利益争夺

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

参考文献

IA的Abreu和DE的Cabelli （2010）。超氧化物歧化酶-与金属有关的机械变化的综述。Biochim Biophys Acta 1804（2）：263-274。
Luk ，EE和Culotta ，VC（2001）。酿酒酵母中的锰超氧化物歧化酶通过涉及Nramp金属转运蛋白Smf2p的途径获得其金属辅因子。生物化学杂志276（50）：47556-47562。
Packer，L。（2002）。超氧化物歧化酶。美国：Elsevier科学，197。
Thines ，L.，Deschamps，A.，Sengottaiyan ，P.，Savel，O.，Stribny ，J.和Morsomme ，P.（2018）。酵母蛋白Gdt1p转运Mn 2+ 离子，从而调节高尔基体中的锰稳态。? 生物学化学293（21）：8048-8055。