材料和试剂

1. 5 mL血清移液管（Genesee Scientific，目录号： 12-104）

2. Rattler 玻璃镀珠（Genesee Scientific，目录号： 11-255A）

3. 封口膜（VWR，目录号： P7793-1EA）

4. 通用实验室胶带（VWR，目录号： 89097-938）

5. 50 mL管（Genesee Scientific，目录号：28-108）

6. 1.7 mL微量离心管（Genesee Scientific，目录号：24-281）

7. 待测试的细胞裂解物样品（例如，来自 DLF_R004）（Menacho-Melgar等人，2020）

我们建议使用至少 2.5 mL 的裂解物，来自至少 20 mL 的细胞培养物，至少 OD ₆₀₀= 10)

8. 自来水

9. Tris碱（ GoldBio，目录号：T-400-500）

10. Triton X-100（Sigma Aldrich，目录号：93443）

11. 蛋白酶抑制剂片剂，不含 EDTA（Thermo Fisher，目录号：A32965）

12. 裂解缓冲液（见配方）

设备

1. 带摄像头的手机

2. 切管机（Ridgid，型号：104）

3. 台式离心机（Thermo Scientific，型号：Legend XTR）

4. 热块（Bioer，型号：CHB-201）

5. -80°C 冰箱（Thermo Scientific，型号：TSX700）

软件

1. 任何视频媒体播放器，例如“电影和电视”（Microsoft）

程序

A. 获得细胞裂解物

1. 离心 20 mL 的 DLF_R004（或其他大肠杆菌菌株）细胞培养物，如前所述（Menacho-Melgar等人，2020）培养它们。

2. 在 1 × Lysis 缓冲液中重悬细胞。

3. 将细胞在 -80°C 冰箱中冷冻 1 小时。

4. 在 37°C 下解冻细胞 1 小时。有关更多详细信息，请参阅我们发表的描述我们方法的文章 (Menacho-Melgar et al ., 2020)。

5. 如果不使用 DLF_R004 或衍生的大肠杆菌菌株，则可以使用添加溶菌酶的裂解缓冲液和重复的冻融循环来裂解细胞。如果需要水解寡核苷酸，可以根据制造商的说明添加核酸酶（例如，DNase I 或 Benzonase ^{TM ）。}在这种情况下，不应期望完全裂解。

B. 血清移液器制备

1. 使用管切割器，在 3 mL 标记处切割移液器（图 1A）。

2. 用封口膜密封血清移液管的底部。

3. 用 1 mL 水填充血清移液器，以确保不会发生泄漏。

4. 清空血清吸管。

5. 将血清移液器固定到垂直表面，确保表面和移液器之间有足够的对比度，以方便数据分析（图 1B）。

图 1. 裂解液粘度测量的设置准备。

(A) 使用管切割器在 3 mL 标记处切割血清移液器。 (B) 用封口膜密封血清移液管底部后，将装满的血清移液管垂直贴上胶带，装满待测样品。

C. 测量粘度

1. 用至少 2.5 mL 的细胞裂解液填充血清移液器。如果血清移液器在步骤 B1 中的 6 mL 标记处切割，则可以将细胞裂解液的体积增加到 6 mL。

2. 测量从 2 mL 标记到 1 mL 标记的距离。如果使用本协议中列出的血清移液器，则距离为 3.6 厘米。

3. 将您的手机摄像头放置在足够远的位置，以确保可以看到血清移液器的顶部和底部。开始录制移液器的视频。

4. 将玻璃珠滴入血清移液管内。

5. 再重复两次步骤 C3。

6. 一旦第三个玻璃珠落到血清移液管的底部，就停止录制视频。

7. 取下封口膜密封。

8. 清空血清吸管并用水冲洗。

9. 用下一个样本填充血清移液器，并重复步骤 C1-C7 两次，以获得一式三份。

10. 作为示例，提供了视频 1 和 2。

视频 1。 玻璃珠滴过非粘性裂解物样品，其中 DNA/RNA 已被水解。

视频 2。 玻璃珠滴过粘性裂解物样品，其中 DNA/RNA 尚未水解。

数据分析

1. 使用任何媒体播放器软件，播放并记录珠子从 2 mL 标记到 1 mL 标记所需的时间。或者，如果使用更多的细胞裂解物，可以记录更长距离的珠滴时间。

2. 使用公式计算粘度：

其中 g 是重力加速度，a 是珠子的半径，v 是珠子在液体中移动的速度。裂解物的密度假定为水的密度 (1 g/mL)。

3. 通过将 1 和 2 毫升标记之间的距离（如果使用更多的细胞裂解物，则距离更长）除以珠子下降该距离的时间，计算珠子的速度。

4. 如果使用本协议中列出的材料（单位转换后），公式可简化为：

5. 如果不使用相同的血清移液器，请测量 2 mL 和 1 mL 标记之间的距离。如果不使用相同的玻璃珠，请测量珠子直径。如果使用不同材料的珠子，请查看密度值。

6. 使用这种方法，对于含有水解寡核苷酸的裂解物，我们获得了 ~600 g/(m*s) 的粘度值，对于含有非水解寡核苷酸的裂解物，我们获得了 ~450,000 g/(m*s) 的粘度值。

食谱

1. 裂解缓冲液

20 mM Tris HCl，pH 8.0

0.1% v/v Triton X-100

每 50 mL 裂解缓冲液 1 片蛋白质抑制剂。

致谢

我们要感谢以下支持：DARPA# HR0011-14-C-0075、ONR YIP #N00014-16-1-2558 和 DOE EERE 赠款 #EE0007563、北卡罗来纳州生物技术中心 2018-BIG-6503 和NIH R61 AI140485-01 。该协议改编自 Menacho-Melgar, R., Moreb, EA, Efromson, JP, Yang, T., Hennigan, JN, Wang, R. 和 Lynch, MD (2020)。通过噬菌体溶菌酶和 DNA/RNA 核酸内切酶的自溶和自体 DNA/RNA 水解的自诱导改进两阶段蛋白质表达和纯化。生物技术生物工程 117（9）：2852-2860。

利益争夺

MD Lynch 在 DMC Biotechnologies, Inc. 拥有竞争利益。MD Lynch 和 R Menacho-Melgar 在 Roke Biotechnologies, LLC 拥有竞争利益。作者没有其他竞争利益。

参考

1. Boynton, ZL, Koon, JJ, Brennan, EM, Clouart, JD, Horowitz, DM, Gerngross, TU 和 Huisman, GW (1999)。通过在恶臭假单胞菌中的葡萄球菌核酸酶基因的染色体整合降低聚（3-羟基链烷酸酯）加工过程中的细胞裂解物粘度。 应用环境微生物65（4）：1524-1529。

2. 库里恩，B . T. 和 Hal Scofield, R. (2012)。电泳中的常见伪影和错误。在：分子生物学方法。 869：633-40。

3. Menacho-Melgar, R., Moreb, EA, Efromson, JP, Yang, T., Hennigan, JN, Wang, R. 和 Lynch, MD (2020)。通过噬菌体溶菌酶和 DNA/RNA 核酸内切酶的自溶和自体 DNA/RNA 水解的自诱导改进两阶段蛋白质表达和纯化。 生物技术生物工程117（9）：2852-2860。

4. Nakayama, Y.、Yamaguchi, H.、Einaga, N. 和 Esumi, M. (2016)。使用 DNA 结合荧光染料和建议的解决方案进行 DNA 定量的缺陷。 公共科学图书馆一号11（3）：e0150528。

5. Prazeres, DM, Ferreira, GN, Monteiro, GA, Cooney, CL 和 Cabral, JM (1999)。用于基因治疗的药用级质粒 DNA 的大规模生产：问题和瓶颈。 趋势生物技术17（4）：169-174。