材料和试剂

A. 材料

1. 花盆、小盆（6 × 6 × 5厘米）和大盆（13 × 13 × 13厘米）（SW Horto，目录号：700-245）

2. 植物托盘（34 × 22 × 4 cm）（ Nelson Garden，目录号：5770 ）

3. 土壤 (S-soil, Hasselfors Garden, Örebro, pH 5.5-5.6) 由可见的轻泥炭、黑泥炭、珍珠岩、沙子和石灰组成

4. Miracloth Calbiochem ^®（Merck，目录号：475855-1）

5. 玻璃烧杯（250 mL VWR，目录号：213-0014）

6. 实验室瓶（500 mL SARSTEDT，目录号： 3607507)

7. 塑料培养皿（Ø × H：92 × 16 mm，SARSTEDT，目录号：82.1473.001）

8. 玻璃培养皿（Ø × H：92 × 16 mm，Fisher Scientific，目录号：1201333）

9. Eppendorf 微量管（SARSTEDT，目录号：72.690.001 [1.5 mL]； 72.695.500 [ 2.0 mL ]）

10. 勺子（无菌）

11. 铝箔

12. 手术刀和刀片（Fisher Scientific，目录号：12348019 和 12398009）

13. 研钵和研杵（80 mm × 92 mm，VWR，目录号：470148-960）

14. 封口膜（10.2 cm × 38.1 m，VWR，目录号：52858-000）

15. Filtropur 灭菌过滤器 S0.2（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）

B. 植物

1. 甜菜种子（DLF 甜菜种子）

2. 拟南芥，Col-0（拟南芥信息资源，TAIR）

C. 病原

在整个工作中使用了立枯丝核菌AG2-2IIIB BBA 69670 分离物（Wibberg等人，2016）。

D. 分子生物学工作套件

1. DNeasy 植物迷你试剂盒（Qiagen，目录号：69104）

2. RNeasy植物迷你试剂盒（Qiagen，目录号：74903）

E. 其他试剂

接种培养基（见配方）

1. 马铃薯葡萄糖琼脂，PDA（Applichem，目录号： A5838)

2. 蒸馏水

3. 珍珠岩，0-6.5 毫米（SW Horto AB，Hammenhög，瑞典）

4. 玉米粉 (Risenta, Sollentuna, 瑞典)

CTAB DNA 提取

1. 液氮

2. 氯仿、EMSURE ^®ACS、ISO、Reag。博士（VWR，目录号：1.02445.1000，CAS 号：67-66-3）

3. 异丙醇（2-丙醇，EMSURE ACS，ISO，Reag. Ph. Eur. for analysis，VWR，目录号：1.09634.5000）

4. 乙醇 (70%)

5. 氯化钠（NaCl）（ Saveen Werner AB（Duchefa），目录号：31434）

6. 氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）

7. 乙二胺四乙酸（ EDTA）（ VWR ，目录号：BDH9232，CAS号：60-0-04）

8. Tris 碱 TRIS-RO ROCHE（Sigma-Aldrich，CAS 编号：77-86-1）

9. 盐酸（37%）（Sigma-Aldrich，目录号： H1758）

10. 蒸馏水

11. 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Sigma-Aldrich，目录号：H6269）

12. Tris-EDTA 缓冲溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T9285）

13. 可选：RNase A (17,500 U)（Qiagen 目录号：19101）

14. 马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) (1 L)（见食谱）

15. 3% CTAB 提取缓冲液（50 mL）（参见配方）

16. 1 M Tris-HCl (pH8) (1 L)（见配方）

17. 5 M NaCl (100 mL)（见配方）

18. 0.5 M EDTA (pH8) (1 L)（见配方）

19. 1 × TE 缓冲液 (100 mL)（参见配方）

设备

1. 生长室（ Percival AR82L2/Split）或温室

2. 分析天平（梅特勒-托利多，型号：AE100）

3. 高压釜

4. 层流罩

5. 加热柜

6. 水浴（Sigma-Aldrich，型号：Julabo TW12，目录号：Z615498）

7. 加热板

8. 液氮容器

9. 安全眼镜、手套和实验室外套

程序

A. 准备受侵染的土壤

1. 将 39 g PDA 粉末溶解在 1 L 蒸馏水中，并在 125 °C （135 kPa）下高压灭菌 15 分钟。一旦介质冷却下来（大约 50 °C ），每个培养皿倒入大约 20 mL 并让它凝固。在室温下在 PDA 板上种植10 天的茄属植物。使用无菌条件。将培养物在 4 °C 下储存长达一个月。

2. 计算实验需要多少克接种物（取决于花盆大小、生物复制数量和实验设置）。例如，拟南芥每 20 g 土壤1 g 接种物，甜菜每 10 g 土壤 1 g 接种物。

3. 在烧杯中混合珍珠岩、玉米粉和蒸馏水 (1:1:5)（参见接种培养基配方）。

4. 将 40 克珍珠岩混合物放入干净的玻璃培养皿中，用铝箔密封，并在 125 °C （135 kPa）下高压灭菌 15 分钟。

5. 在无菌条件下工作，并用R. solani从 PDA 板上切下 1 × 1 cm 的块。使用无菌手术刀将一块倒置在每个装有珍珠岩介质（步骤 2）的玻璃培养皿的中间。用封口膜密封玻璃培养皿，在室温下在黑暗中孵育 10 天，以产生真菌侵染的基质 (FIS)。

6. 用勺子将预先称重的 FIS 添加到土壤中并彻底混合。每 10 份土壤中应含有 1 份 FIS，用于接种甜菜，1:20（FIS：土壤）用于接种拟南芥。

注意：非常彻底地混合是至关重要的。一次称重并混合所有需要的土壤/接种物，以避免土壤批次变化。

7. 在准备好的同一天使用土壤-FIS 混合物。

B. 病害甜菜的制备或拟南芥植物

1. 将甜菜种子包裹在 Miracloth 中，然后将“袋子”浸入玻璃烧杯中的冷水中 30 分钟。

2. 将种子转移到 57 °C水浴中 5 分钟。

3. 再次将种子浸入冷水中，让它们在室温下干燥过夜。

4. 将甜菜种子转移到土壤中，在温室条件下培养三周（16 小时光照/8 小时黑暗循环，22 °C /18 °C ）。每周添加一次营养物质（2 毫升 Blomstra、Cederroth、Upplands Väsby/L 水），

5. 或者，将拟南芥Col-0 种子在无菌水中孵育过夜或在 4°C 下最多孵育四天。

6. 种植拟南芥种子并在短日照条件下培养 4 周（18°C 黑暗 16 小时/22°C 周期光照 8 小时，相对湿度为 60%）。保持土壤湿润但不潮湿。

7. 用镊子小心地将植物从土壤中提起。用蒸馏水轻轻洗去根部的土壤。

注意：如果土壤变得紧实，轻轻按压花盆的侧面，松开植物周围的土壤，以免损坏根部。

8. 将干净的小苗转移到受侵染的土壤中。监测植物的症状发展（图1 ；图2 ）。两天后，甜菜幼苗的症状可能出现在下胚轴上。在第八天，易感植物开始猝倒。症状在拟南芥幼苗上扩散，直到莲座叶在第五天左右开始出现萎黄和/或坏死的迹象。

图 1. 甜菜幼苗，发芽后 26 天。

A. 耐受基因型， R. solani感染后 5 天。 B. 耐受基因型，生长在未受侵染的土壤中。 C. 易感基因型， R. solani感染后 5 天。 D. 易感基因型，生长在未受侵染的土壤中。

图 2.拟南芥Col-0，发芽后 38 天。

R. solani中的植物以五种不同的接种比例侵染土壤，对照植物生长在 H ₂O 处理的土壤中。 10 dpi 的植物表型。这红色矩形标记最佳感染水平。

C. 植物材料的收获和总 RNA 和 DNA 的分离

1. dpi的速度收获甜菜幼苗的根和下胚轴，包括根部（收获时间和每个生物复制的植物数量取决于您的项目）。使用无菌蒸馏水洗去土壤和其他污染物。在纸巾上晾干。用铝箔包裹并立即在液氮中冷冻。

注意：根部完全清洁很重要。工作快。避免在冷冻前堆积材料。

用研钵和杵（高压灭菌或热灭菌）在液氮中研磨样品。保持植物材料冷冻，直到所有样品都被磨成细粉。

注意：在提取 DNA 或 RNA 之前不要让植物材料解冻。

2. 按照制造商的手册，使用市售的试剂盒，例如 RNeasy-和 DNeasy-plant mini kit (Qiagen)，从 100 mg 样品中继续进行 RNA 和/或 DNA 分离。如果希望获得更高的 DNA 产量，可以使用改进的 CTAB DNA 提取方法。

D. CTAB DNA 提取 (Möller et al ., 1992)

1. 将 500 μL 的 3% CTAB 提取缓冲液添加到 2.0 mL 微离心管中的 100 mg 粉状植物材料中，并大力涡旋。

可选：添加 4 μL 的 RNAse A (100 mg/mL) 并通过反转混合。

2. 将样品在 65°C 水浴中孵育 30 分钟。每 5-10 分钟倒置一次试管进行混合。

3. , 000 ×离心样品 10 分钟 g并将上清液转移到新的 1.5 mL 管中。

4. 添加 600 μL 的氯仿和涡流。

5. 13 , 000 ×离心机 g 10 分钟。将上清液的上相转移到干净的 1.5 mL Eppendorf 管中。

6. 加入 1 体积的氯仿并涡旋。

7. , 000 ×离心 10 分钟 g并将上相转移到干净的 1.5 mL 管中。

8. 添加 1 体积异丙醇（2-丙醇）并通过上下吹打混合。在 -20°C 下沉淀混合物 30 分钟。

9. , 000 ×离心 20 分钟克。用吸管丢弃上清液（避免干扰 DNA 沉淀），让沉淀短暂干燥。

10. 加入约 150 µL 冷冻 70% 乙醇并在 13 , 000 ×下离心 g 5 分钟以洗涤 DNA 沉淀。丢弃乙醇，让颗粒干燥。

11. 将颗粒溶解在 100 μL 的 1 × TE 缓冲液中。

数据分析

感染水平最好通过比较感染后 5 天或 10 天不同植物材料中的真菌 DNA 来评估。

1. 在无菌水中大力清洗根部，以消除多余的土壤和外部真菌生长。

2. 重复根部清洗直至完全清洁。这可以在立体显微镜下确定。

3. 使用至少五个甜菜或拟南芥根和下胚轴，至少重复四个。

4. 根据 Möller等人制备总 DNA。 (1992)。见 C 和 D 部分。

真菌 DNA ( RsG3PDH )的量可以通过qPCR 确定，并使用 iQ5 qPCR 系统 (Bio-Rad, Hercules, CA)标准化为植物 DNA ( Actin2 )的量。每个 20 μl 反应包含 2 μl gDNA 模板 (50 ng)、150 nM 的每种引物和 10 μl SYBR Green PCR Master Mix (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)。扩增程序包括：95 ° C 10 min，95 ° C 30 s，60 ° C 1 min，72 ° C 30 s 40个循环。进行熔解曲线分析以确认单个扩增产物。

5. 可以通过使用至少四次重复应用学生t检验来进行统计分析。

食谱

1. 马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) (1 L)

在 1 L 蒸馏水中混合 39 g/L PDA 粉末。

调节至 pH 5.6。

在 125°C (135 kPa) 下高压灭菌15 分钟。

2. 接种培养基（1公斤）

混合 143 克珍珠岩、143 克玉米粉和 714 毫升蒸馏水。

用铝箔包裹玻璃培养皿。

在 125°C (135 kPa) 下高压灭菌15 分钟。

3. 3% CTAB 提取缓冲液 (50 mL)

将 1.5 g CTAB 溶解在加热板上的 16.5 mL 蒸馏水中。

添加 7.5 mL 的1 M Tris-HCl（pH 7.4）、 26 mL 的 5 M NaCl 和0.2 mL 的 0.5 M EDTA（pH 8）。

使用 0.2 µm filtropour 过滤器过滤消毒。

4. 1 M Tris-HCl (pH8) (1 L)

将 121.1 g Tris 碱添加到 800 mL 蒸馏水中。

用浓 HCl（约 42 mL）将 pH 值调节至 8。

用蒸馏水调至 1 L。

在 125°C (135 kPa) 下高压灭菌 15 分钟。

5. 5 M 氯化钠（100 毫升）

加入 29.22 g NaCl 并调整至 100 mL 蒸馏水。

在 125°C (135 kPa) 下高压灭菌15 分钟。

6. 0.5 M EDTA (pH 8) (1 L)

将 186.1 g EDTA 添加到 800 mL 蒸馏水中。

用 NaOH（约 20 g）将 pH 值调节至 8。

用蒸馏水调至 1 L。

在 125°C (135 kPa) 下高压灭菌 15 分钟。

7. 1 × TE 缓冲液（100 毫升）

10 mM Tris-HCl

0.1 毫米乙二胺四乙酸

添加蒸馏水至所需的最终体积。

在 125°C (135 kPa) 下高压灭菌 15 分钟。

致谢

这项工作由瑞典研究委员会 (VR) 和瑞典农业科学大学资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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