材料和试剂

A. 类器官培养材料

1. 12/24 孔组织培养板（F 基；TPP，目录号：920 12/24）

2. 15/50 mL锥形离心管（TPP，目录号：910 15/50）

3. 1.5 mL微量离心管（BrandTech，目录号：780500）

4. 10/200/1,000 μL ART 屏障移液器吸头（Thermo Scientific，目录号：10098960/10029040/10313272）

5. 20/100 μL PP 滤芯吸头（Nerbe Plus，目录号：07-662-8300/07-642-8300）

6. PCF Transwell 插入物（0.6 cm ²，0.4 μm 孔；Merck，Millicell，目录号：PIHP01250）

7. 真空过滤系统“快速”-Filtermax（0.22 μm；TPP，目录号：99505）

8. Sartorius MinisartR 无菌过滤器（0.22 μm；Thermo Scientific，目录号：10730792）

9. 一次性血细胞计数器（Kisker Biotech，目录号：M-NZ）

10. Duran 玻璃烧杯（25/600-mL；Schott，目录号：2110614、2110648）

11. Duran 玻璃瓶（500/1,000-mL；Schott，目录号：4459/5455）

12. Bemis Parafilm“M”（Thermo Scientific，目录号：11762644）

13. B Braun 单锥 Luer 注射器（5/10/20-mL；Braun，目录号：12752637）

14. Sterican 一次性 21 G 注射器针头（Blunt，25 mm，0.4 mm；Carl Roth，Braun，目录号： X134.1）

15. 一次性 18 G 注射器针头（Blunt，40 mm；VWR，BD Medical，目录号： BDAM303129）

注：给出了供应商/制造商的示例；其他人的类似材料也可能有效。

B. 类器官培养试剂

1. 高级 DMEM/F-12（Thermo Scientific，Gibco，目录号：12634028；储存于 4°C）

2. 重组人EGF（Peprotech，目录号：AF-100-15；在-20°C冻干储存，在-80°C分装）

3. 重组鼠EGF（Peprotech，目录号：315-09；在-20°C冻干并在-80°C下分装）

4. N-乙酰基-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165；在 4°C 下储存粉末，在 -80°C 下分装）

5. 烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：N0636；在室温下储存粉末并在-80°C下分装）

6. A83-01（Sigma-Aldrich，目录号：SML0788；在-20°C冻干并在-80°C下分装）

7. SB 202190（Cayman 化学品，目录号：10010399-10；在 -20°C 下冻干储存，在 -80°C 下分装）

8. B-27 补充剂（Thermo Scientific，Gibco，目录号：17504044；储存于 -80°C）

9. N-2 补充剂（Thermo Scientific，Gibco，目录号：17502048；储存于 -80°C）

10. HEPES（1 M；Thermo Scientific，Gibco，目录号：15630056；储存于 4°C）

11. GlutaMAX 补充剂（100×；Thermo Scientific，Gibco，目录号：35050038；储存于 4°C）

12. 青霉素/链霉素（100×；青霉素[10,000 U/mL]和链霉素[10,000 µg/mL]；Capricorn Scientific，目录号：PS-B；储存于-20°C）

13. Y-27632（盐酸盐；Cayman 化学品，目录号：10005583；在-20°C 冻干储存，在-80°C 分装）

14. TrypLE Express 酶（1×；Thermo Scientific，Gibco，目录号：12605010；储存于 4°C）

15. ECM Matrigel（Corning，目录号：734-0269；将等分试样储存在 -20°C）或 Cultrex 减少的生长因子基底膜提取物 2 型（Bio-Techne，R&D Systems，目录号：3533-010-02；将等分试样储存在-80°C)

注意：蛋白质含量 ≥ 8.5 mg/mL 是可取的。

16. 牛血清白蛋白（BSA，不含脂肪酸；Sigma-Aldrich，目录号：A7030-100G；储存于 4°C）

17. 二甲基亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich，目录号：D2650-100ML；室温储存）

18. 80% 乙醇或其他等效消毒剂，室温储存

19. MilliQ 或其他等效无菌水，室温储存

注意：发现按描述工作；来自其他供应商/制造商的类似试剂也可能有效。

C. 用于生产条件培养基的试剂

1. DMEM 高葡萄糖（4.5 g/L），具有稳定的谷氨酰胺（Capricorn Scientific，目录号：DMEM-HPSTA；储存在 4°C）

2. DMEM，含有 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸盐的高葡萄糖（Thermo Scientific，Gibco，目录号：31966047；储存于 4°C）

3. 胎牛血清（FBS；Capricorn Scientific，目录号：FBS-LE-12A；在-20°C下储存等分试样）

注意：在常规培养中使用前，测试新批次的 FBS 至少三周。在 56°C 下加热灭活 30 分钟，并在 -20°C 下储存 50 mL 等分试样。

4. 胰蛋白酶-EDTA（Capricorn Scientific，目录号：TRY-1B10；将等分试样储存在-20°C）

5. 磷酸盐缓冲盐水（PBS；内部制造；室温或 4°C 储存）

6. 青霉素/链霉素（100 × ，青霉素[10,000 U/mL]和链霉素[10,000 µg/mL]；Capricorn Scientific，目录号：PS-B；在-20°C下储存等分试样）

7. 潮霉素 B（50 mg/mL；Carl Roth，目录号：CP12.2；储存于 4°C）

8. 遗传霉素（G418；50 mg/mL；Carl Roth，目录号：CP11.2；储存于 4°C）

9. Zeocin（Invivogen，目录号：ant-zn-1；在-20°C下储存等分试样）

10. 萤光素酶测定系统（Promega，目录号：E1500；在-20°C下储存等分试样）

注意：发现按描述工作；来自其他供应商/制造商的类似试剂也可能有效。

D. 条件培养基及其衍生培养基的细胞系

1. L-WRN (ATCC CRL-3276) (VanDussen et al ., 2019)

2. HEK 293T HA-noggin-Fc （Heijmans等人，2013； Bartfeld等人，2015）

由乌得勒支 Hubrecht Institute 的 Hans Clevers 友情提供。

3. HEK 293T R-Spondin1-Fc (Kim et al ., 2005)

由美国斯坦福大学 Calvin Kuo 提供（受 MTA 约束）。

4. HEK 293 SuperTopFlash (ATCC CRL-3249)

用于 L-WRN 和 R-Spondin 1 条件培养基活性测试的荧光素酶报告细胞系。

5. WERN 3D 基础增殖培养基（参见食谱）

6. 器官冷冻培养基（见食谱）

7. 离试剂（见配方）

8. ODM 第 0 天培养基（见食谱）

9. ODM 第 1 天培养基（见食谱）

10. ODM 培养基，第 2 天起（见食谱）

11. 磷酸盐缓冲盐水（见食谱）

12. L -WRN 生长培养基（见食谱）

13. L-WRN 调节培养基（见食谱）

14. R -Spondin 1 和mNoggin生长培养基（参见食谱）

15. R -Spondin 1 和 mNoggin 调理培养基（参见食谱）

16. R -Spondin 1 和 mNoggin 冷冻培养基（参见食谱）

设备

1. - 20°C 冰箱

2. 真空吸引器系统，Integra Biosciences Vacusafe Comfort Aspiration 系统（Fisher Scientific，Integra，目录号： 10590273）

3. 可调节移液器，Eppendorf Research plus 10/20/200/1,000 移液器（Eppendorf，目录号：3123000020、3123000039、3123000055、3123000063）

4. CO ₂细胞培养箱（加湿空气，5% CO ₂，37°C），CB 170 CO ₂培养箱（Binder，型号： CB170-230V-O）

5. 用于 BSL-2 工作的安全柜，Safe 2020 Class II 生物安全柜（Thermo Scientific，目录号： 51026640）

6. 用于 15/50 mL 锥形管的冷却离心机，Multifuge X1R Multi-Application Centrifuge（Thermo Scientific，目录号： 15364306）

7. 冷却容器，带有 IsoPack 0°C 的 Eppendorf IsoRack（Eppendorf，目录号：3880001174）

8. CoolCell LX 细胞冷冻小瓶容器（Fisher Scientific，Corning，目录号： 15572771）

9. 37°C 水浴，WNB 14（Carl Roth，Memmert，型号： WNB 14）

10. 发光计，TriStar LB 941 多模式酶标仪（Berthold，型号： LB 941）

11. 用于测量跨上皮电阻的筷子电极，带有电极 STX01 的伏特欧姆计 ERS-2（Merck，Millicell，目录号： MERS00002）

12. 用于测量跨上皮电阻的 37°C 加热块，数字干浴培养箱（MRC Laboratory Instruments，型号： DBD-002N）

注：给出了供应商/制造商的示例；其他人的类似材料也可能会起作用。

程序

为了从肠道组织中建立 3D 类器官， Sato等人的标准协议。（2009 年）紧随其后。按照Mahe等人的协议，所有 3D 类器官的传代每周进行一次（人类）或每周两次（所有其他物种）。（2015 年）。 Holthaus等人总结了 3D 类器官培养的培养基条件。（ 2020 ）每个物种，并在食谱中简要介绍。

A. 处理 3D 类器官

1. 解冻 3D 类器官

a. 在冰箱的 4°C 冷却架中解冻细胞外基质（ECM；Matrigel 或 Cultrex）化合物。

b. ₂培养箱中预热 24 孔板。

c. 在 37°C 水浴中预热“用于球体培养的 WERN 3D 基础增殖培养基”。

d. 从液氮仓库中取出一瓶 3D 类器官（戴上护目镜和手套进行保护），然后将其运送到冷却架中的工作台上。

e. 在 37°C 水浴中轻轻搅拌解冻小瓶。

f. 一旦内容物解冻，从水浴中取出小瓶。用 70% 乙醇擦拭小瓶对小瓶进行消毒，然后将其移至生物安全柜。

注意：在处理人类或野生动物来源的类器官时，请始终使用 BSL-2 生物安全柜，除非经测试不含传染性病原体。

g. 将小瓶内容物转移到 9 mL 的 Advanced DMEM/F-12 的 15 mL 管中。

h. 500 ×离心机 g在 4°C 下 5 分钟。

i. 吸出上清液并将颗粒重新悬浮在 100 μL 的高级 DMEM/F-12 中。将细胞悬液转移到 4°C 冷却架中预冷的 1.5 mL 微量离心管中。

j. 添加 100 μL 的 ECM 并通过上下移液混合。

k. 将每孔 40-50 μL 的 ECM/细胞混合物转移到 24 孔板中。

l. 在 37°C 下孵育培养物 30 分钟以固化 ECM。

m. 将 500 μL 的预热“用于球体培养的 WERN 3D 基础增殖培养基”添加到井中，将盘子放回培养箱，每隔一天更换一次培养基。

2. 冷冻 3D 类器官以进行冷冻保存

a. 准备一个装有冰块的桶。

b. 在一个或多个玻璃烧杯中装满冰块，并将其放入生物安全柜内。

c. 将适当数量的 15 mL 锥形管放在冰上。

注意：每 12 个 3D 有机体培养孔需要一个 15 mL 锥形管。

d. 用 0.1% BSA 溶液涂抹 15 mL 锥形管的塑料表面。

注意：提前在 50 mL 管中准备好 0.1% BSA 溶液，并将其储存在 4°C。该溶液最多可重复使用 5 次或两周。

e. 用 6 mL 的冷 Advanced DMEM/F-12 填充每个 15 mL 锥形管，并辅以 P/S。

f. 将 ECM 嵌入的 3D 有机体培养的 24 孔板从培养箱转移到生物安全柜。

g. 收集 ECM 嵌入的 3D 有机体。用 1，000 μL 移液器尖端刮掉 ECM 从底部掉落。将移液器设置为 ±600 μL（每口井应有 500 μL 的介质 + 40 μL 的 ECM）并将 ECM/介质悬浮液转移到含有 6 mL 的高级 DMEM/F-12 的 15 mL 锥形管中，并辅以 P/ S。将锥形管放在冰上，同时收获其他井。在冰上的两个 15 mL 锥形管之间分配一个 24 孔板的内容物。

注意：每口井刮 2-3 秒就足以去除 ECM 液滴。

h. 在 4°C 下以500 × g将收集的 ECM 嵌入 3D 类器官离心5 分钟。

注意：类器官将在离心管底部形成颗粒，ECM 将沉淀在顶部。如果介质层中仍有可见的 ECM 残留物，请重复此步骤。

i. 离心后，用真空泵小心吸出上清液和含有 ECM 的层。

j. 在 15 mL 试管中加入适量的有机体冷冻培养基并重新悬浮。

注意：4 孔 3D 类器官通常足够每瓶冷冻保存。

k. 将 1 mL 转移到每个冷冻管中，并将其放入冷冻容器中。

l. 将冷冻容器在 -80°C 下储存 24 小时，然后将小瓶转移到液氮中进行最终储存。

B. 创建类器官衍生的单层

1. 用 ECM 包被细胞培养插件

a. 对生物安全柜进行消毒。

注意：在处理人类或野生动物来源的类器官时，请始终使用 BSL-2 生物安全柜，除非经测试不含传染性病原体。

b. 在 4°C 冰箱中的预冷机架中解冻 ECM 等分试样（需要 100 μL 的 ECM 来涂覆 12 个细胞培养插入物）。

c. 用消毒剂对镊子进行消毒。将其转移到生物安全柜中，等待消毒剂蒸发。

d. 使用镊子将细胞培养插入物放入 12 孔板中。

注意：小心不要用镊子刺破渗透支撑。

e. 将带有细胞培养插件的 12 孔板置于- 20°C 冰箱中至少 20 分钟。

f. 同时，将 0°C 冷架（例如，带有 IsoPack 0°C 的 Eppendorf IsoRack）从- 20°C 冷冻柜转移到生物安全柜中，并放置包含步骤B.1.b中解冻的 ECM 等分试样的试管在 0°C 冷架中。

注意：ECM 在 10°C 以上开始凝固，但如果机架太冷可能会冻结。从冰箱中取出 0°C 冷架后，可能需要等待几分钟。

g. 准备涂层溶液。用高级 DMEM/F-12 和 P/S 稀释 ECM 1:20。吸管上下混合。对于 12 孔板，将 100 μL 的 ECM 添加到 1，900 μL 的预冷却高级 DMEM/F-12 中，并辅以 P/S。

h. 将 150 μL 的稀释 ECM 溶液移液到冷冻板的每个细胞培养插件中。

注意：小心地将移液器直接移入可渗透膜的中心，并避免移液器靠在侧壁上。

i. 将涂层板放入 4°C 冰箱中并放置过夜。

2. 收获球体和种子细胞

注意：要从 ECM 嵌入的有机体培养物中生成 ODM，请在其处于富含干细胞的球体状态时收获相应的培养物（图 1）。本协议的背景部分描述了球体和有机体的定义。每个细胞培养插入物需要大约 2-3 × 10 ^{6 个奇异球状细胞。}作为参考，为了生成一个 12 孔的 ODM 板，我们使用一个 24 孔的 ECM 嵌入人体球体板。以下步骤也显示在视频 1中。

图 1.收获前的球体以制造类器官衍生的单层。

显示了来自小鼠、人类、鸡和猪的球体的代表性明场显微图像。图像是在 Axiovert Observer 系统 (Zeiss) 上拍摄的。使用 Zen Blue 2.6 lite 软件 (Zeiss) 调整图像的对比度。

视频 1. 生成类器官衍生单层和跨上皮电阻 (TEER) 测量的实验程序。

a. 准备“ODM 第 0 天介质”。对于 12 孔板，需要 15 mL 这种培养基。要准备介质，请将组件添加到无菌玻璃烧杯中。使用 0.22 μm 注射器过滤器对介质进行消毒，并将其转移到 15 mL 锥形管中。

可选：平行制备“ODM 第 1 天培养基”并将其储存在 4°C 冰箱中直至第二天。

b. 将离心机冷却至 4°C。

c. 准备一个 37°C 的水浴。

d. 在 37°C 水浴中预热 ODM 第 0 天培养基。

e. 对生物安全柜进行消毒。

f. 准备一个装有冰块的桶。

g. 将涂层板（来自步骤B.1 ）从 4°C 冰箱中取出，并使用真空泵小心地从细胞培养插件中吸出培养基（参见视频 1 ）。

h. 将板放入 37°C 培养箱中约 30 分钟，同时继续步骤B2i 。

i. 用冰填充两个或多个玻璃烧杯，并将它们放在生物安全柜内。

j. 将适当数量的 15 mL 锥形管放在冰上。

注意：每 12 个球体培养孔需要一个 15 mL 锥形管。

k. 组装一个 1 mL 注射器和一个钝的 18 G 针头。

注意：为尽量减少受伤风险，请使用钝针并且不要重新盖上针头。将组装好的注射器放在架子上的开放式 15 mL 锥形管中。

l. 用 0.1% BSA 溶液涂抹 15 mL 锥形管和注射器表面的塑料表面。要涂覆锥形管表面，将冷的 0.1% BSA 溶液倒入每个 15 mL 管中并再次吸气。要涂抹注射器表面，还要用冰冷的 0.1% BSA 溶液填充注射器并释放（视频 1 ）。

注意：提前在 50 mL 管中准备 0.1% BSA 溶液，并将其存放在 4 °C 冰箱中。该溶液最多可重复使用 5 次或两周。

m. 用 6 mL 的冷 Advanced DMEM/F-12 填充每个 15 mL 锥形管，并辅以 P/S。

n. 将 ECM 嵌入球体培养的 24 孔板从培养箱转移到生物安全柜。

o. 收集 ECM 嵌入的球体。用 1，000 μL 移液器尖端刮掉底部的 ECM。将移液器设置为 ±600 μL（每口井应有 500 μL 的介质 + 40 μL 的 ECM）并将 ECM/介质悬浮液转移到含有 6 mL 的高级 DMEM/F-12 的 15 mL 锥形管中，并辅以 P/ S。将锥形管放在冰上，同时收获其他井。在冰上的两个 15 mL 锥形管之间分配一个 24 孔板的内容物。

注意：每口井刮 2-3 秒就足以去除ECM液滴。

p. 在 4°C 下以500 × g离心收集的球体5 分钟。

注意：球体将在离心管底部形成颗粒，ECM 将沉淀在顶部。如果介质层中仍有可见的 ECM 残留物，请重复此步骤！

q. 在离心过程中，每 15 mL 管收获的球体准备 1 mL 解离试剂（TrypLE Express 溶液中的 10 μM Y-27632），例如，通过将1 μL 的 Y-27632（10 mM 库存）添加到 999 μL 的 TrypLE Express解决方案。

r. 离心后，用真空泵小心吸出上清液。

s. 将颗粒重新悬浮在 1 mL 的解离试剂中。

t. 37°C 水浴中孵育 2-5 分钟以进行酶消化。

注意：孵育人类球体 5 分钟；小鼠、鸡和猪 2 分钟。其他物种可能需要调整。

u. 将悬浮液强制通过钝的 18 G 针头，机械破坏球体，七到十次（视频 1 ）。

注意：机械破坏主要取决于实验者。通常，7 - 10 次就足够了。第一次总是在显微镜下检查你的细胞悬液。

v. 添加高级 DMEM/F-12 辅以 P/S至总共 12 mL。

w. 在 4°C 下以 500 × g离心 5 分钟。

x. 小心吸出上清液。

y. 在 ODM 第 0 天培养基中重新悬浮颗粒。首先，在每个颗粒中加入 1 mL 的 ODM 第 0 天介质，通过移液重新悬浮颗粒，并在添加剩余介质之前将细胞悬浮液池化。

注意：每个 12 孔板需要 4.8 mL ODM 第 0 天培养基用于细胞悬液，另外 9.6 mL 用于每个 12 孔板的基底侧。我们在每个细胞培养插入物中播种约 2-3 × 10 ^{6个细胞。}

z. 将涂层板从培养箱转移到生物安全柜。

i. 小心地将 400 μL 的细胞悬浮液移液到细胞培养插入到涂层渗透膜（顶端侧）上。

ii. 小心地将 ODM 第 0 天介质的 800 μL 移液器移至外隔间（基底外侧）。将板返回培养箱。

iii. 第二天（播种后第 1 天），将培养基从 ODM 第 0 天培养基更改为 ODM 第 1 天培养基。用真空泵吸出旧介质。从外部隔间开始，然后从细胞培养插件内部吸出培养基。以相反的顺序添加预热的 ODM 第 1 天培养基：首先，将 400 μL 移液器移入细胞培养插入物，然后将 800 μL 移至外隔间。

注意：更换培养基时要注意顺序！如果先去除顶端介质，则细胞层可能由于周围介质的浮力而从膜上脱落。

iv. 第二天（播种后第 2 天），将培养基从 ODM 第 1 天培养基改为 ODM 培养基。如步骤 B2z.iii 中所述，吸出旧培养基并添加新鲜的 ODM 培养基。

v. 每周更换 ODM 介质 3 次，如步骤 B2z.iii 中所述。

注意：成功的单层形成可以通过分别使用免疫荧光显微镜和 RT-qPCR 的标记蛋白和基因的表达来评估。上皮紧密性可以通过跨上皮电阻(TEER)来确认 测量。图s 2 和 3 显示了成功形成单层的示例。数据取自Holthaus 等人。 ( 2020 ) , 其中详细描述了数据的方法和解释。 TEER 测量也在本协议的程序C 中进行了描述。图 4 显示了单层形成不成功的示例。在这个例子中，细胞未能达到 100% 的汇合，并且没有形成电生理上紧密的单层。

图 2. 人、小鼠、猪和鸡 ODM 中标记蛋白表达的免疫荧光分析。

标记蛋白 EZR/VIL2（刷状边界）、NHE3/SLC9A3（转运蛋白）和 SOX9（增殖细胞）以白色显示，用 DAPI 染色的细胞核以蓝色显示。在 10（人）、12（小鼠）、6（猪）和 15（鸡）天后固定 ODM。猪 ODM 的 NHE3/SLC9A3 染色被排除在外，因为该抗体对该物种的适用性值得怀疑。显示了 z 堆栈的代表性正交图像。比例尺 = 20 µm。数据来自Holthaus等人。（2020），可以找到染色模式的解释。

图 3. ODMs 中刷状缘方向、电生理紧密度和肠道标记基因转录表达分析。

(A) 具有代表性的 z 堆叠正交图像，其中 F-肌动蛋白 (白色) 的鬼笔环肽染色在顶端刷状边界中积累。在 10（人）、12（小鼠）、6（猪）和 15（鸡）天后固定 ODM。用 DAPI（蓝色）染色的细胞核。比例尺 = 20 µm。 (B)播种后 ODM 的跨上皮电阻 (TEER) 分析。除猪外，所有 ODM 都形成了电生理上紧密的单层。显示了每个物种 12-36 个滤芯的平均值 (± 95% CI)。 (C)通过 RT-qPCR 测量的肠道细胞群的标记基因转录物的表达。指示标志物是：EE，肠内分泌细胞； PC，潘氏细胞； GC，杯状细胞； SC，干细胞； E，肠细胞。显示了至少两个独立生物复制的≥ 4 个技术复制的平均值 (± 95% CI) 。 nd，检测不到。数据来自Holthaus等人。（2020），可以找到数据的解释。

图 4. ODM 建立和诱导屏障破坏的不成功尝试示例。

(A)对 F-肌动蛋白 (白色) 进行鬼笔环肽染色的非融合 ODM 的 z 堆栈的示例性投影。用 DAPI（蓝色）染色的细胞核。比例尺 = 100 µm。 (B)在 12 天的时间过程中，随着时间的推移成功与不成功地建立人类 ODM 的 TEER 发展。显示了每种条件 36 和 28 个滤芯的平均值 (± 95% CI)。成功建立数据对应于图 3B。 (C)用 2 µM 激酶抑制剂和凋亡诱导剂星形孢菌素诱导屏障破坏（作为对照）（Belmokhtar等，2001）。显示了每种条件的三个独立实验的平均值 (± SEM)。成功的人类 TEER 数据来自Holthaus等人。（2020 年）。

C. 使用筷子电极测量跨上皮电阻 (TEER)

1. 将加热板预热至 37°C。

注意：TEER 对温度敏感，因此建议使用加热板。

2. 将 80% 乙醇和无菌水倒入 25 mL 无菌玻璃烧杯中。

注意：重要的是水是无菌的，以防止样品受到污染。

3. 将电极放入 80% 乙醇中对电极进行消毒，直至加热块加热。

4. 将您的 ODM 板放在 37°C 加热板上。

5. 打开 ERS2 伏特表。

注意：确保伏欧计测量的是 Ω 而不是 mV。水和乙醇中的值应在 12,000 - 14,000 Ω 左右。

6. 将电极放入烧杯中，用水冲洗掉乙醇。

7. 抖掉电极上剩余的水。

8. 将电极放入您要测量的孔中（视频 1 ）。

注意：电极有一根较短和一根较长的腿。将较长的腿用于基部隔室，将较短的腿用于顶端。小心不要划伤细胞表面！您可以用较长的电极腿接触孔底，而不会刮伤细胞表面，从而提供额外的稳定性。小心不要施加太大的重量，因为这会使电极弯曲。你可能想事先练习一下。

9. 等待值稳定并将它们记录在您的笔记中（人类和小鼠 ODM 的原始 TEER 值范围在500-700之间）。

10. 重复步骤C.8和C.9以测量所有孔。在不同条件下用乙醇和水洗涤。

11. 把你的盘子放回孵化器。

12. 关闭伏欧计和加热板，并用乙醇对电极进行消毒。

13. 测量后将电极放入锥形 15 mL 管中，并用封口膜密封。

D. L-WRN条件培养基的生产

注意：我们使用L-WRN (ATCC CRL-3276) 细胞系生产 L-WRN 条件培养基。以下协议基于产品表上的程序，但包括已证明对我们有用的修改。特别是，我们指出了可以执行每个步骤的日期，以便可以在工作日进行收获。

1. L-WRN 细胞的解冻

a. 不含遗传霉素和潮霉素 B的 L-WRN 生长培养基，并将其置于 5% CO _{2的 37°C 培养箱中}。

b. 从液氮储存中取出一小瓶 L-WRN 细胞（戴上护目镜和手套进行保护）并将其运送到冷却架中的工作台上。

c. 在 37°C 水浴中轻轻搅拌解冻小瓶。

d. 一旦内容物解冻，从水浴中取出小瓶。用 70% 乙醇擦拭小瓶对小瓶进行消毒，然后将其移至生物安全柜。

e. 将小瓶的内容物转移到含有预热培养基的 T75 烧瓶中。

f. 将烧瓶在 37°C 下孵育，24 小时后将培养基更换为添加了 0.5 mg/mL 遗传霉素和 0.5 mg/mL 潮霉素 B 的 L-WRN 生长培养基。

2. L-WRN 细胞的传代

注意：我们通常在星期一这样做，因为这样我们可以在工作日收获。

a. 从 T75 烧瓶中吸出并丢弃 L-WRN 生长培养基。

b. 用 10 mL 的 PBS 冲洗细胞层两次。

c. 将 2 mL 的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液加入烧瓶中，并在 37°C 下放置 5-10 分钟。

注意：您可以在显微镜下跟踪细胞脱离的进程。

d. 添加 8 mL 的预热生长培养基以停止胰蛋白酶化反应。

e. 将 1.5 mL（分流比 1:6.6）的细胞悬浮液转移到适当数量的含有 18.5 mL 预热生长培养基的新 T75 烧瓶中。

注意：新 T75 烧瓶的数量取决于您想要生产的 L-WRN 条件培养基的所需体积。每个 T75 烧瓶随后扩展为三个 T150 烧瓶，收获四次，每个 T75 烧瓶总共产生 300 mL 的条件培养基。作为参考，我们通常将 L-WRN 培养扩展到每轮条件培养基生产三到五个新的 T75 烧瓶。

f. ₂的培养箱中在 37°C 下培养烧瓶。

3. L-WRN 条件培养基的制备和收获

注意：我们通常在星期四这样做，因为这样我们可以在下一周的工作日收获。

a. 每一个 L-WRN 细胞的 T75 烧瓶准备三个 T150 烧瓶。

b. 在每个 T150 烧瓶中加入 22 mL 的预热调节介质（不含遗传素和潮霉素 B）。

c. 从 T75 烧瓶中吸出并丢弃 L-WRN 生长培养基，用 PBS 冲洗，然后用 2 mL 的胰蛋白酶-EDTA 分离细胞，如上所述用于传代。

d. 将 8 mL 的调节介质添加到分离的细胞中。

e. 将 3 mL 的细胞悬浮液转移到每个准备好的 T150 烧瓶中。

f. 如果您想继续传代 L-WRN 细胞，请将 0.5-1 mL 剩余的细胞悬浮液添加到一个额外的 T75 烧瓶中，该烧瓶中含有 19 mL L-WRN 生长培养基（补充有遗传霉素和潮霉素 B）。在 37°C 下孵育 4 天，然后重复步骤D.2以扩大培养物以进行另一轮收获。

g. 将 T150 烧瓶在 37°C 下孵育 4 天或直到细胞过度融合。

注意：如果您按照我们的计划，细胞应该在星期一准备好。

h. 吸出并丢弃培养基。

i. 用 10 mL 的调理介质冲洗细胞层一次，然后丢弃冲洗液。

j. 加入 25 mL 新鲜预热的调节培养基，在 37°C 下孵育 24 小时。

k. 第二天，将条件培养基转移到 50 mL 管中。在烧瓶中加入 25 mL 的新鲜调理介质，然后将烧瓶放回培养箱。将条件培养基在 2,000 × g ，4°C 下离心 5 分钟，然后将上清液倒入无菌玻璃瓶中。将 L-WRN 条件培养基储存在 4°C。

l. 重复上一步（步骤D3 k ），共收获 4 次。每次将上清液倒入同一瓶中。第四次之后收获，充分混合，并将这批条件培养基储存在 4°C。

注意：可能在第 4 天之后继续收获。但是，我们通常连续收获四天（周二至周五），并在周一开始新鲜培养。在合并批次之前，测试它们的活动（参见程序F ）。

m. 使用前通过 0.22 µm 过滤器过滤进行消毒。分装并储存在 -80°C。

4. L-WRN 细胞的冷冻保存

注意：一个汇合的 T150 烧瓶或两个 T75 烧瓶应该足以产生 4 个 5 × 10 ^{6 个}细胞的低温储备。

a. 在 37°C 水浴中预热 L-WRN 生长培养基。

b. 吸出并丢弃旧的生长培养基。

c. 用 10 mL 的 PBS 冲洗一次细胞层。

d. 如上所述，用 2 mL 的胰蛋白酶-EDTA 分离细胞。

e. 添加 4 mL 的预热生长培养基，并将细胞悬浮液转移到 15 mL 管中。

f. 用额外的 4-5 mL 生长培养基再次冲洗烧瓶，以收集任何剩余的细胞，并将培养基添加到 15 mL 管中。

g. 确定单元格编号。用 10 μL 的细胞悬浮液填充 Neubauer 室，并在显微镜下计数细胞。

h. g离心细胞悬液 5 分钟。

i. 去除上清液并小心地将细胞沉淀重悬于适当体积的冷冻培养基中。每个冷冻管应在 1 mL 中包含大约 5 × 10 ^{6 个细胞。}

j. 将 1 mL 转移到每个冷冻管中，并将其放入冷冻容器中。

k. 将冷冻容器在 -80°C 下储存 24 小时，然后将小瓶转移到液氮中进行最终储存。

E. R-Spondin 1 条件培养基和 mNoggin 条件培养基的生产

注意：我们使用HEK 293T HA-noggin-Fc 细胞系(Heijmans et al., 2013; Bartfeld et al., 2015) ，由 Hans Clevers, Hubrecht Institute, Utrecht 和 HEK 293T R-Spondin1-Fc 友情提供细胞系(Kim et al., 2005) ，由美国斯坦福大学 Calvin Kuo 友情提供，用于生产 R-Spondin 1 条件培养基和 mNoggin 条件培养基。以下协议基于各自作者的程序，但包括已证明对我们有用的修改。特别是，我们指出了可以执行每个步骤的日期，以便可以在工作日进行收获。

1. R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞的解冻

a. 在 37°C 水浴中预热 R-Spondin 1 和 mNoggin 生长培养基。分别为 R-Spondin 1 细胞添加 0.3 mg/mL zeocin 和为 mNoggin 细胞添加 0.5 mg/mL 遗传素。在所有后续步骤中使用补充了相应抗生素的培养基。

b. 将 19 mL 的 R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基分别添加到一个 T75 烧瓶中，然后将它们置于 37°C 的培养箱中，其中 5% CO ₂。

c. 从液氮储存中取出一瓶 R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞（戴上护目镜和手套进行保护），然后将它们运送到冷却架中的工作台上。

d. 在温和搅拌下在 37°C 水浴中解冻小瓶。

e. 一旦内容物解冻，从水浴中取出小瓶。用 70% 乙醇擦拭小瓶对小瓶进行消毒，并将其移至生物安全柜。

f. 将每个小瓶的内容物分别转移到含有 9 mL R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基的 15 mL 管中。

g. 134 ×离心机 g在 4°C 下 5 分钟。

h. 吸出并丢弃上清液。分别在 1 mL 的 R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基中重新悬浮细胞颗粒，并将细胞悬浮液转移到一个 T75 烧瓶中，每个烧瓶都含有各自的预热培养基。

i. 将烧瓶在 37°C 下孵育，24 小时后更换培养基。

2. R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞的传代

a. 在 37°C 水浴中预热 R-Spondin 1 和 mNoggin 生长培养基。分别为 R-Spondin 1 细胞添加 0.3 mg/mL zeocin 和为 mNoggin 细胞添加 0.5 mg/mL 遗传素。在所有后续步骤中使用补充了相应抗生素的培养基。

b. 吸出并丢弃生长培养基。

c. 用 10 mL 的 PBS 冲洗细胞层两次。

d. 将 2 mL 的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液加入烧瓶中，并在 37°C 下放置 5-10 分钟。

注意：您可以在显微镜下跟踪细胞脱离的进程。

e. 分别添加 8 mL 的预热 R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基，以停止胰蛋白酶化反应并将每个细胞悬浮液转移到 15 mL 管中。

f. 在 4°C 下以 134 × g离心 5 分钟。

g. 吸出并丢弃上清液。

h. 如果您想从条件培养基的制备开始，请通过将每种培养物传代培养到两个 T150 烧瓶中来扩展每种培养物。因此，将颗粒分别重新悬浮在 9 mL 的预热 R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基中。将 3 mL 的细胞悬浮液转移到两个新的 T150 烧瓶中，每个烧瓶中含有 37 mL 的相应预热生长培养基。

注意：如果您不想继续收获，请以 1:10 的亚培养比例传代细胞。

i. 在 37°C 的培养箱中用 5% CO _{2培养烧瓶，}直到细胞在 3-4 天后达到汇合。

3. R-Spondin 1 条件培养基和 mNoggin 条件培养基的制备和收获

注意：我们通常在星期一或星期四这样做，因为这样我们可以在工作日收获。

a. 在 37°C 水浴中预热 R-Spondin 1 和 mNoggin 生长培养基（分别含有和不含 zeocin 或遗传霉素）。分别为 R-Spondin 1 细胞添加 0.3 mg/mL zeocin 和为 mNoggin 细胞添加 0.5 mg/mL 遗传素。

注意：您也可以在步骤 E3i 中将抗生素直接添加到烧瓶中。

b. 在显微镜下检查细胞是否完全汇合，然后再继续。

c. 为了扩大细胞培养以进行后续收获，分别从 R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞的两个 T150 烧瓶中制备 12 个新的 T150 烧瓶。

d. 在每个新的 T150 烧瓶中加入 38.6 mL 的预热生长培养基（不含 zeocin 或遗传霉素）。

e. 从 T150 烧瓶中吸出并丢弃旧的生长培养基，用 PBS 冲洗，然后用 3 mL 的胰蛋白酶-EDTA 分离细胞，如上所述用于传代。

f. 添加 10 mL 的预热生长培养基（不含 zeocin 或遗传霉素）以停止胰蛋白酶化反应。将一个烧瓶的细胞悬浮液转移到一个 50 mL 管中。

g. 在 4°C 下以 134 x g离心 5 分钟。

h. 吸出并丢弃上清液。小心地将颗粒重新悬浮在 10.5 mL 的预热 R-Spondin 1 或 mNoggin 生长培养基（不含 zeocin 或遗传霉素）中，并将 1.4 mL 的细胞悬浮液转移到每个新的 T150 烧瓶中。

i. 如果您想继续传代，请分别将 1.4 mL 剩余的细胞悬液添加到另外两个含有 38.6 mL R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基（含 zeocin 或遗传霉素）的 T150 烧瓶中。在 37°C 下孵育 3-4 天，然后重复步骤E.3以开始另一轮收获。

注意：您可以将抗生素直接添加到烧瓶中。

j. 将 12 个 T150 烧瓶在 37°C 下孵育 3-4 天。

k. 吸出并丢弃生长培养基，并用 50 mL 的调理培养基代替。

l. 将烧瓶在 37°C 下孵育 7 天，无需更换培养基。

m. 收获条件培养基并将其转移到 50 mL 管中。

n. 将条件培养基以 2,000 × g离心5 分钟，然后将上清液倒入玻璃瓶中。

o. 使用前通过 0.22 µm 过滤器过滤进行消毒。分装并储存在 -80°C。

注意：在合并批次之前，测试它们的活性（参见程序F ）。

4. R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞的冷冻保存

对于 R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞的冷冻保存，请遵循 L-WRN 细胞的冷冻保存方案（步骤D.4 ），但分别使用 R-Spondin 1 生长培养基和 mNoggin 生长培养基。

注意：对于 R-Spondin 1 细胞和 mNoggin 细胞，我们通常制备含有 8 × 10 ^{6 个}细胞的冷冻储存液。

F. 条件培养基的活性测试

在用于类器官培养之前测试所有条件培养基是至关重要的。使用 ERN 培养基（标准小鼠培养基 - EGF、R-Spondin 1、Noggin）对新收获的鼠隐窝进行常规测试 Noggin 条件培养基，新鲜制备批次的 1% 必须足以建立类器官。已经描述和比较了用于批次间质量控制的不同方法（参见VanDussen 等人，2019 年）。至少建议使用荧光素酶报告细胞系在 WRN 和 R-Spondin 1 条件培养基中测试 Wnt 和 R-Spondin 1 活性，该细胞系表达萤火虫荧光素酶以响应经典 Wnt 信号传导，例如 HEK293 SuperTopFlash (STF ) 细胞系（ATCC 编号：CRL-3249）与荧光素酶检测试剂盒结合使用，根据制造商的说明使用光度计（Mahe 等人，2015；Urbischek 等人，2019） 。此外，建议比较不同批次条件培养基之间的增殖和球体生长（VanDussen et al., 2019） 。所有三种条件培养基或蛋白质替代物的批次均可商购，例如在 U-Protein Express BV (Puschhof et al., 2021) 。

数据分析

对于跨上皮电阻 (TEER) 的测量，至关重要的是随后将测量值标准化为表面积。通常以Ω*cm ^{2表示测量值}。

食谱

1. 用于球体培养的 WERN 3D 基础增殖培养基

50% (v/v) L-WRN 条件培养基 (CM) (VanDussen et al ., 2019)

20% (v/v) R-Spondin 1-CM (Kim et al ., 2005)

10% (v/v) Noggin-CM (Heijmans et al ., 2013; Bartfeld et al ., 2015)

50 纳克/毫升表皮生长因子

注意：对于小鼠和人类器官，分别使用小鼠 EGF 和人类 EGF。对于猪类器官，我们使用小鼠 EGF。对于鸡类器官，结合使用人和小鼠 EGF。

1 毫米 HEPES

2 毫米谷氨酸

1× P/S（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

1× N2

1× B27

1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸

10 毫米烟酰胺

500 nM A83-01（TGF-β抑制剂）

1 μM SB-202190（p38 抑制剂）

在高级 DMEM/F-12 中。

使用 0.22 μm 过滤器消毒并在一周内使用。储存在 4°C。

注意：对于猪类器官，用 10 μMY-27632 补充 3D 基础培养基。对于鸡类器官，用 10 μM Y-27632、3 μM CHIR99021（GSK-3 抑制剂）和 10 μM 前列腺素 E2 补充 3D 基础培养基。

2. 类器官冷冻培养基

10% (v/v) 无脂肪酸牛血清白蛋白 (BSA)

10% (v/v) 二甲基亚砜

在高级 DMEM/F-12 中。

使用 0.22 µm 过滤器消毒并在一周内使用。储存于 4°C。

3. 解离试剂

TrypLE Express 中的 10 µM Y-27632

使用前立即准备新鲜。

4. ODM 第 0 天中

50% (v/v) L-WRN-CM (VanDussen et al ., 2019)

20% (v/v) R-Spondin 1-CM (Kim et al ., 2005)

10% (v/v) Noggin-CM (Heijmans et al ., 2013; Bartfeld et al ., 2015)

50 纳克/毫升表皮生长因子

1 毫米 HEPES

2 毫米谷氨酸

1× P/S（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

1× N2

1× B27

1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸

10 毫米烟酰胺

10 μMY-27632（ROCK1 抑制剂）

在高级 DMEM/F-12 中。

使用 0.22 μm 过滤器消毒并在一周内使用。储存在 4°C。

5. ODM 第 1 天培养基

5% (v/v) L-WRN-CM (VanDussen et al ., 2019 )

20% (v/v) R-Spondin 1-CM (Kim et al ., 2005)

10% (v/v) Noggin-CM (Heijmans et al ., 2013; Bartfeld et al ., 2015)

50 纳克/毫升表皮生长因子

1 毫米 HEPES

2 毫米谷氨酸

1× P/S（100 U mL ^-1青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

1× N2

1× B27

1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸

10 毫米烟酰胺

10 μMY-27632（ROCK1 抑制剂）

在高级 DMEM/F-12 中。

使用 0.22 μm 过滤器消毒并在一周内使用。储存于 4°C。

6. ODM 中期第 2 天起

20% (v/v) R-Spondin 1-CM (Kim et al ., 2005)

10% (v/v) Noggin-CM (Heijmans et al ., 2013; Bartfeld et al ., 2015)

50 纳克/毫升表皮生长因子

1 毫米 HEPES

2 毫米谷氨酸

1× P/S（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

1× N2

1× B27

1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸

10 毫米烟酰胺

在高级 DMEM/F-12 中。

使用 0.22 μm 过滤器消毒并在一周内使用。储存于 4°C。

7. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

137 毫米氯化钠

8.0 毫米钠₂HPO ₄

2.7 毫米氯化钾

1.5 mM KH ₂PO ₄(pH 7.4)

使用 0.22 μm 过滤器进行消毒。在室温或 4°C 下储存。

8. L-WRN 生长培养基

10 % (v/v) 胎牛血清

1% (v/v) P/ S（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

0.5 毫克/毫升潮霉素 B

0.5 毫克/毫升遗传霉素 (G418)

在 DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/l) 中，含稳定的谷氨酰胺

储存于 4°C。

注意：建议准备较小体积的媒体以节省资源。

9. L-WRN 调节培养基

10% (v/v) FBS

1% P/S (v/v)（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

在 DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/l) 中，含稳定的谷氨酰胺

储存于 4°C。

10. R-Spondin 1 和 mNoggin 生长培养基

10% (v/v) FBS

1% (v/v) P/S（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

在 DMEM 中，含有 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸的高葡萄糖

储存于 4°C。

11. R-Spondin 1 和 mNoggin 调节培养基

1% (v/v) P/S（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）

1 毫米 HEPES

2 毫米谷氨酸

在高级 DMEM/F-12

储存于 4°C。

12. L-WRN、R-Spondin 1 和 mNoggin 冷冻培养基

20% (v/v) FBS

10% (v/v) 二甲基亚砜

在 DMEM 中，含有 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸的高葡萄糖。

使用 0.22 μm 过滤器消毒并在一周内使用。储存于 4°C。

致谢

对于该协议和原始研究论文，德意志研究中心 (DFG)通过GRK 2046 向 TA、CK 和 FS 提供了财政支持。 GRK 2046（项目 B3 和 C3）支持 DW、ED-B、DH 和 AM。增材制造也得到 Sonnenfeld 基金会的支持。 SMK 和 JDS 的工作是由 DFG 资助的 TRR 241（项目 B06）。 GK、TA、CK 和 FS 的工作由 Robert Koch-Institute 提供支持。 FS 还是 IRTG 2029（由 DFG 支持）和 TOXOSOURCES（由欧盟 Horizo n 2020 研究和创新计划根据赠款协议 No 773830：One Health European Joint Programme 资助）的成员。

该协议源自Holthaus等人的原始研究论文。（ 2020 年）。为此，我们感谢柏林自由大学的 Luca Bertzbach 和 Benedikt Kaufer 提供肠道鸡样本和组装肠道标记引物序列库。我们还感谢柏林自由大学的 Svenja Steinfelder 提供和提取猪肠隐窝。

利益争夺

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。资助机构在数据的设计、收集、分析和解释方面没有任何作用，也没有在编写本协议或之前的研究方面发挥作用。

伦理

如前所述（Kraft等人，2020；Holthaus等人，2020）从人类十二指肠标本中分离和建立类器官，并获得柏林慈善委员会的伦理委员会批准（#EA4-015-13 ）。人体材料的捐赠者提供了他们参与科学研究的书面知情同意书。对于猪样品，十二指肠隐窝是从一只 10 周大的小猪身上分离出来的（ Sus scrofa ，由柏林自由大学免疫学研究所的 Svenja Steinfelder 友情提供，动物许可证 T0002/17）。鸡十二指肠隐窝从一只 14 天大的雌性鸡（ Gallus gallus ，由柏林自由大学病毒学研究所 Luca Bertzbach 和 Benedikt Kaufer 友情提供，动物许可证 T0245/14）的肠中分离。小鼠十二指肠样本来自 RKI 内部繁殖群体的雌性 C57/Bl6 小鼠（动物许可证 T0173/14）。动物研究得到了柏林的 Landesamt für Gesundheit und Soziales (LAGeSo) 审查和批准。

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